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Method Article
家禽中の サルモネラ 菌を低レベルで正確に定量することは、現在の産業および規制上の課題です。このプロトコルは、生および調理済み家禽製品中の サルモネラ 菌の定量を可能にするMPNアッセイについて説明しています。この方法は迅速で感度が高く、FSISガイドラインに準拠しているため、食品の安全性が向上し、公衆衛生の取り組みがサポートされます。
サルモネラ菌 は、米国、特に家禽製品における食中毒の主な原因です。 従来のサルモネラ 菌検出法は、定量化よりも有病率に重点を置いているため、汚染レベルやリスクの評価における有用性は限られています。この研究では、チキンコルドンブルーなどの調理済み家禽製品中の サルモネラ菌 を定量するために設計された新しい最確数(MPN)アッセイを紹介します。この方法では、家禽サンプルを洗浄し、遠心分離によってリンスを濃縮し、48ウェルブロックで連続希釈します。MPNアッセイは、ループ媒介等温増幅(LAMP)法と統合されており、既存の食品安全検査サービス(FSIS)プロトコルと同じ時間枠内で サルモネラ 菌汚染の高感度、正確、迅速な定量を提供します。結果は、MPN-LAMP測定値と理論上の接種レベル(R² = 0.933)との間に強い線形相関があることを示しています。しかし、低濃度でのばらつきは、これらのレベルで サルモネラ菌 を正確に検出することの難しさを浮き彫りにしており、実際の検出下限は約300 CFU/gと推定されています。プロトコールの適用性を向上させるための潜在的な改良には、検出限界をさらに改善するためのサンプリング量の増加、濃縮培地の組成の最適化、および複数の サルモネラ 血清を標的とする分子検出の拡大が含まれます。全体として、この研究は食品業界にとって実用的なツールであり、家禽製品中の サルモネラ 菌汚染の信頼性の高い定量化を可能にし、食品の安全性と公衆衛生の向上に貢献しています。
サル モネラ 菌は、米国における食中毒、入院、死亡の主な原因として、公衆衛生と経済に大きな影響を与えています。2013年だけでも、この病原体の推定経済的負担は36億7000万ドルでした1。最近の規制イニシアチブは、2030年までにサルモネラ症を25%削減することを目指していますが2、現在の検出および緩和戦略のギャップは依然として明らかであり、特に処理プラントの監視を公衆衛生上の成果 と一致させる点では3 。
冷凍調理済みの家禽製品は、複数のサルモネラ菌の発生に関与しており、公衆衛生にとって重大な懸念事項です。これを受けて、食品安全検査局(FSIS)は、サルモネラ菌をこれらの製品の混入物として分類しました。現在、FSIS Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 4.15は、家禽製品4におけるサルモネラ菌の有病率の決定にのみ焦点を当てています。このガイドラインでは、収集したサンプルを18〜24時間濃縮した後、サルモネラ菌の有無を特定する分子検出システム(MDS)を使用してスクリーニングしますが、汚染レベルに関する洞察は提供しません。このアプローチは、病原体の存在を検出するには価値がありますが、食品加工業者が汚染リスクをより正確に評価し、的を絞った是正措置を講じるのに役立つ定量的な情報を提供することはできません。
本研究では、微生物病原体の有病率から定量まで検出を増強する方法を開発しました。これは、現在のFSISプロトコルの中断を最小限に抑えて家禽製品中のサルモネラ菌を検出するための既存のプロセスにシームレスに統合するために設計されました。この方法は、単にバルクサンプルを濃縮する代わりに、現在のFSIS法と一致する培地を使用して家禽製品を洗浄することから始まります。その後、リンスは深さ 48 のウェルブロックの最初のカラムに分配されます。残りの5つのカラムで段階希釈を行い、MLG 4.15プロトコルに沿ってブロックを18〜24時間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルはサルモネラ菌についてテストされ、その結果を使用して最も可能性の高い数(MPN)5,6が計算されます。このアプローチにより、現在のFSISプロセスと同じ時間枠内で汚染を定量化できるため、業界と規制当局の両方で使用できる実用的なオプションになります。図1は、修正されたMPNアッセイをまとめたブロック図を示しています。この図には、特定のステップで撮影された写真、反復の希釈と成長に利用される48ウェルブロック、および鶏ひき肉に存在する最も可能性の高いサルモネラ菌の数を評価するためのベンチマークとして使用される3つの手法が含まれています。この研究の第 1 段階では、放射線照射されていない鶏のサンプルにプロトコルを適用する前に、背景の微生物叢の影響と確認済みの接種物に対する測定値の不確実性を最小限に抑えるために、照射された鶏ひき肉を利用しました。
注:このプロトコルに関連するすべての作業は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)ラボ内で実施する必要があります。適切な場合、このプロトコルは生物学的安全キャビネット(BSC)内で実施し、無菌状態を維持し、サンプル汚染や微生物病原体へのオペレーターの曝露のリスクを最小限に抑える必要があります。BSCの外部にサンプルを移す場合は、密閉容器を使用してサンプルの完全性を維持し、誤って落下した場合のこぼれを防ぎます。好ましくは、クロスコンタミネーションの可能性を軽減するために、手順全体を通して使い捨てコンポーネントを使用する必要があります。使い捨てが不可能な場合は、使用前にすべての機器と材料が無菌であることを確認してください。適切な廃棄物管理は非常に重要です。使用済みの使い捨て部品はすべてバイオハザード廃棄物として廃棄する必要があります。再利用する前に再利用可能な材料をオートクレーブにして、潜在的に危険な材料の適切な滅菌と封じ込めを確保します。これらの予防措置を順守することで、サンプルの完全性を保護するだけでなく、オペレーターが微生物病原体にさらされるリスクも最小限に抑えることができます。
1.肉サンプルの調製
2. 細胞培養
3.家禽サンプルの接種
4. サンプル処理
5. MPNブロックのセットアップ
注: 表1 は、48ウェルブロックでの希釈液の概略図を示しています。
6. めっきと列挙
7. サルモネラ菌のqPCR検出
8. 3M MDSアッセイを用いた検出
9. データ分析
照射肉
回帰分析では、傾き 1 は、独立変数 (x 軸) が単位増加するごとに、従属変数 (y 軸) が正確に 1 単位増加することを示します。これは、2 つの変数間の比例関係を示唆しており、従属変数の変化は独立変数の変化を反映していることを意味します。切片が 0 の場合、独立変数が 0 の場合、従属変数も 0 になります。これは、2つの変数間の関係に固...
プロトコルの意義
サルモネラ菌は、食品の安全性、特に家禽製品内で依然として主要な懸念事項であり、食中毒の発生にしばしば関与しています13,14。米国における細菌性食中毒の主な原因として、新鮮な家禽製品と調理済みの家禽製品の両方でサルモネラ菌を検出するための信頼性の高い方?...
すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。
この研究は、米国農務省、農業研究サービス(USDA-ARS)、国家プログラム108、現在の研究情報システム番号8072-42000-093-000-Dおよび8072-42000-094-000-Dによって支援されました。USDAは機会均等の提供者であり、雇用主です。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
48 deep well block 4.6ml | Fisher Scientific International, Inc | NC1964628 | |
Agar - Solidifying Agent (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | JL602-G/L | Equipment |
Analytical Balance | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer | Steris plc | LV-250 | Equipment |
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
Brain Heart Infusion (BHI) Broth | Becton, Dickinson and Company (BD) | 237500 | |
Buffered Peptone Water | Bio-Rad Laboratories Inc. | 3564684 | |
Cell Spreader - L-shaped | VWR | 76208-438 | |
Centrifuge Microcentrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 | Equipment |
Centrifuge, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | Equipment | |
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
Ground Chicken | Local retailers | ||
IAC forward primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3' | Integrated DNA Technologies | ||
IAC probe: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC CACCA-3' labeled with 5' TAMRA/3' BHQ-2 | Biosearch Technologies | ||
IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3' | Integrated DNA Technologies | ||
Incubator - Inova 4230 incubator shaker | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
Inoculating Loop - Combi Loop 10µL and 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3' | Integrated DNA Technologies | ||
invA probe: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC CTTCCTC-3' labeled with 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1 | Biosearch Technologies | ||
invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3' | Integrated DNA Technologies | ||
Irradiation Treatment | Texas A&M Agrilife Research National Center for Electron Beam Research | Service | |
Luria Bertani (LB) Broth | Becton, Dickinson and Company (BD) | 244620 | |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | Equipment |
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | Equipment |
Media Storage Bottle -PYREX 1L Square Glass Bottle, with GL45 Screw Cap | Corning Inc. | 1396-1L | Equipment |
Media Storage Bottle -PYREX 2L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap | Corning Inc. | 1397-2L | Equipment |
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34cm2, sterile, 108/cs | MilliporeSigma | Z707902 | |
Mixer - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipment |
Molecular Detection Assay 2-Salmonella kit | Neogen | MDA2SAL96 | |
Molecular Detection Instrument | Neogen | MDS100 | Equipment |
Motorized pipette controller, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | 155019 | Equipment |
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
Petri Dish Rotator - bioWORLD Inoculation Turntable | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | Equipment |
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
Ready to cook chicken products | Local retailers | ||
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | 2750036476 | Equipment |
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
Stomacher 80 Biomaster Lab Blender | Seward | 30010019 | Equipment |
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700) | Applied Biosystems | 535028293 | Equipment |
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
Whirlpak bags 1.63L | VWR | 11216-777 |
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