Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כימות מדויק של סלמונלה בעופות ברמות נמוכות הוא אתגר תעשייתי ורגולטורי עכשווי. פרוטוקול זה מתאר בדיקת MPN המאפשרת כימות של סלמונלה במוצרי עופות גולמיים ומוכנים לבישול. שיטה זו מהירה, רגישה ותואמת את הנחיות FSIS, משפרת את בטיחות המזון ותומכת במאמצי בריאות הציבור.

Abstract

סלמונלה היא גורם מוביל למחלות הנישאות במזון בארצות הברית, במיוחד במוצרי עופות. שיטות מסורתיות לאיתור סלמונלה מתמקדות בשכיחות ולא בכמות, מה שמגביל את התועלת שלהן בהערכת רמות הזיהום והסיכונים. מחקר זה מציג בדיקת מספר סביר ביותר (MPN) חדשה שנועדה לכמת סלמונלה במוצרי עופות מוכנים לבישול, כגון קורדון בלו עוף. השיטה כוללת שטיפת דגימת העופות, ריכוז השטיפה באמצעות צנטריפוגה ודילול סדרתי בבלוק של 48 בארות. בדיקת MPN משולבת בשיטת הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) כדי לספק כימות רגיש, מדויק ומהיר של זיהום סלמונלה באותה מסגרת זמן כמו פרוטוקולי שירות בטיחות ופיקוח מזון (FSIS) קיימים. התוצאות מראות מתאם ליניארי חזק בין מדידות MPN-LAMP לבין רמות החיסון התיאורטיות (R² = 0.933). עם זאת, שונות בריכוזים נמוכים יותר מדגישה אתגרים בזיהוי מדויק של סלמונלה ברמות אלה, כאשר גבול הזיהוי התחתון המעשי מוערך בכ-300 CFU/g. שיפורים פוטנציאליים לשיפור תחולת הפרוטוקול כוללים הגדלת הכמות שנדגמה כדי לשפר עוד יותר את גבול הזיהוי, אופטימיזציה של פורמולציות חומרי העשרה והרחבת הזיהוי המולקולרי כדי להתמקד במספר סרוברים של סלמונלה . בסך הכל, מחקר זה מציג כלי מעשי לתעשיית המזון, המאפשר כימות אמין של זיהום סלמונלה במוצרי עופות, ותורם לשיפור בטיחות המזון ובריאות הציבור.

Introduction

כגורם מוביל למחלות הנישאות במזון, אשפוז ומוות בארה"ב, לסלמונלה יש השפעה משמעותית על בריאות הציבור והכלכלה. הנטל הכלכלי המשוער של הפתוגן בשנת 2013 לבדה היה 3.67מיליארד דולר. למרות שיוזמות רגולטוריות אחרונות שואפות להפחית את הסלמונלוזיס ב-25% עד 20302, פערים באסטרטגיות הזיהוי וההפחתה הנוכחיות נותרו ברורים, במיוחד בהתאמת המעקב אחר מפעלי העיבוד לתוצאות בריאות הציבור3 .

מוצרי עופות קפואים מוכנים לבישול, שהיו מעורבים בהתפרצויות סלמונלה מרובות, מהווים דאגה משמעותית לבריאות הציבור. בתגובה, שירות בטיחות המזון והפיקוח (FSIS) סיווג סלמונלה כחומר נואף במוצרים אלה. נכון לעכשיו, מדריך מעבדה למיקרוביולוגיה של FSIS (MLG) 4.15 מתמקד אך ורק בקביעת שכיחות הסלמונלה במוצרי עופות4. על פי הנחיה זו, דגימות שנאספו מועשרות למשך 18-24 שעות ולאחר מכן נבדקות באמצעות מערכת הזיהוי המולקולרי (MDS), המזהה נוכחות או היעדר סלמונלה אך אינה מציעה תובנה לגבי רמת הזיהום. בעוד שגישה זו חשובה לאיתור נוכחות של פתוגנים, היא אינה מספקת מידע כמותי שיכול לעזור למעבדי מזון להעריך את סיכוני הזיהום בצורה מדויקת יותר ולנקוט בפעולות מתקנות ממוקדות.

במחקר זה, פיתחנו שיטה להגברת הזיהוי משכיחות לכימות של פתוגנים מיקרוביאליים. הוא תוכנן לשילוב חלק בתהליכים קיימים לאיתור סלמונלה במוצרי עופות עם הפרעה מינימלית לפרוטוקולי FSIS הנוכחיים. במקום פשוט להעשיר את הדגימה בתפזורת, השיטה מתחילה בשטיפת מוצרי העופות באמצעות מדיה התואמת את שיטות FSIS הנוכחיות. לאחר מכן השטיפה מופצת לעמודה הראשונה של גוש באר בעומק 48. דילולים סדרתיים מבוצעים על פני חמש העמודות הנותרות, והבלוק מודגר למשך 18-24 שעות, בהתאם לפרוטוקול MLG 4.15. לאחר הדגירה, הבארות נבדקות לסלמונלה, והתוצאות משמשות לחישוב המספר הסביר ביותר (MPN)5,6. גישה זו מאפשרת לכמת את הזיהום באותה מסגרת זמן כמו תהליך ה-FSIS הנוכחי, מה שהופך אותו לאופציה מעשית הן לשימוש בתעשייה והן לשימוש רגולטורי. איור 1 מתאר דיאגרמת בלוקים המסכמת את מבחן ה-MPN שהשתנה. האיור כולל תצלומים שצולמו בשלבים ספציפיים, גוש 48 הבארות המשמש לדילול וגידול של שכפולים, ושלוש הטכניקות המשמשות כאמות מידה להערכת המספר הסביר ביותר של סלמונלה הקיימת בעוף טחון. בשלב הראשון של מחקר זה, השתמשנו בעוף טחון מוקרן כדי למזער את ההשפעה של מיקרופלורת הרקע ואי הוודאות של מדידות ביחס לחיסון מאומת לפני החלת הפרוטוקול על דגימות עוף שלא הוקרנו.

Protocol

הערה: כל העבודה הקשורה לפרוטוקול זה צריכה להתבצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). במידת הצורך, יש לבצע פרוטוקול זה בתוך ארון בטיחות ביולוגי (BSC) כדי לשמור על תנאים אספטיים ולמזער את הסיכון לזיהום דגימה או לחשיפת המפעיל לפתוגנים מיקרוביאליים. בעת העברת דגימות מחוץ ל-BSC, השתמש במיכלים אטומים כדי לשמור על שלמות הדגימה ולמנוע שפיכה במקרה של נפילות בשוגג. רצוי להשתמש ברכיבים חד פעמיים לאורך כל ההליך כדי להפחית את האפשרות של זיהום צולב. במקרים שבהם כלים חד פעמיים אינם אפשריים, ודא שכל הציוד והחומרים סטריליים לפני השימוש. ניהול פסולת נכון הוא קריטי; יש להשליך את כל הרכיבים החד פעמיים המשומשים כפסולת ביולוגית. חומרים לשימוש חוזר לפני שימוש חוזר כדי להבטיח עיקור והכלה נאותים של חומרים שעלולים להיות מסוכנים. הקפדה על אמצעי זהירות אלה לא רק שומרת על שלמות הדגימה אלא גם ממזערת את הסיכון לחשיפת המפעיל לפתוגנים מיקרוביאליים.

1. הכנת דגימות בשר

  1. רכישה ועיבוד דגימות בשר
    1. בשר טרי
      1. רכשו עוף טחון ממחלקת הבשר הטרי של קמעונאים מקומיים. העבירו את כל הדגימות לאחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ועבדו תוך 24 שעות לאחר הקבלה. מחלקים את הבשר באופן אספטי לדגימות של 25 גרם.
      2. אטום ואקום והקרין את הדגימה. כאן, המרכז הלאומי של טקסס A&M AgriLife לחקר קרן אלקטרונים הקרין בשר הנתון למינון של ~25 kGy.
        הערה: בעוד שהקרנה שימשה כאמצעי בקרה במחקר זה כדי להבטיח את חיסול המיקרופלורה ברקע, היא אינה תנאי מוקדם לפרוטוקול ביישומים מעשיים כפי שמוצג על ידי המוצרים המוכנים לבישול שאינם מוקרנים המשמשים בסעיף הבא. בהגדרות שדה, שיטות חלופיות כגון מדיה סלקטיבית או ספציפיות של אבחון מולקולרי יכולות לטפל בהפרעות פוטנציאליות ממיקרואורגניזמים שאינם מטרה.
    2. מוצרי עוף מוכנים לבישול
      1. רכשו מוצרי עוף מוכנים לבישול ממדור המזון הקפוא של הקמעונאים המקומיים. מחלקים אספטית לדגימות של 25 גרם.
      2. אסוף דגימות ממרכז החלקים הבודדים כדי להבטיח שכל המרכיבים (למשל, לחם וגבינה) כלולים.
  2. הכנת מדיה
    1. הכן מי פפטון חוצצים (BPW) על ידי המסת 25 גרם אבקת BPW ב-1 ליטר של ננו-טהור H2O.
    2. הכן צלחות עירוי לב מוח (BHI). לשם כך, ממיסים 37 גרם אבקת BHI ב-1 ליטר של ננו-טהור H2O ומוסיפים 15 גרם אגר לתמיסת BHI. עקרו את כל המדיה על ידי חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. יוצקים 20 עד 25 מ"ל מדיה לצלחות פטרי עם מכסה שקוף (100 מ"מ על 15 מ"מ).
      הערה: עדיף לשפוך את הצלחות בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על תנאים אספטיים.

2. תרבית תאים

  1. הכן את התרבית הראשונית על ידי פס סלמונלה אנטריקה , serovar Typhimurium ATCC 14028 על צלחת אגר BHI ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. הכינו תרביות לילה על ידי חיסון 25 מ"ל של מרק BHI במושבה אחת של סלמונלה טרייה. גידול אירובי של תרביות בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-100 סל"ד.

3. חיסון דגימות עופות

  1. דילול וציפוי תרבות
    1. הכן סדרה של דילולים פי 10 של תרבית הלילה ב-BPW כדי להשיג ריכוזים סופיים של כ-1 x 108 עד 1 x 101 CFU/mL. נניח שריכוז תרבית הלילה של סלמונלה הוא 1 x 109 CFU/mL.
    2. העבירו 0.5 מ"ל מתרבית הלילה ל-4.5 מ"ל BPW, ערבבו ואז העבירו 0.5 מ"ל מהדילול ל-4.5 מ"ל BPW עבור כל דילול נוסף.
      1. מורחים 10 מיקרוליטר של דילול 1 x 103 CFU/mL על צלחת אגר BHI בשלוש עותקים לספירת תאים כדי לחשב את ריכוז תרבית הלילה.
  2. חיסון דגימות בשר
    1. העבירו באופן אספטי 25 גרם עוף טחון מוקרן לשקית בטן סטרילית בשכפול. התיק הוא 7.5 על 12 אינץ' ומסומן כ-1.63 ליטר. התיק מכיל מחיצת פילטר בקוטר חור של 330 מיקרומטר, ויש 285 לס"מ מרובע.
    2. חסנו כל דגימה ב-1 מ"ל של דילול ריכוז היעד. לדוגמה, הוסף 1 מ"ל של תרבית מדילול של 1 x 10³ CFU/mL כדי להשיג רמת זיהום של כ-1,000 תאים/25 גרם עוף. מחלקים בעדינות את החיסון הנוזלי על פני דגימות העוף באמצעות מפזר תאים סטרילי ומניחים לו לעמוד שעה ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. הכן דגימות בקרה שליליות על ידי הוספת 1 מ"ל של BPW סטרילי.

4. עיבוד מדגם

  1. הוסף 225 מ"ל BPW לכל דגימה. היחס בין נפח למדיה נבחר כדי להתאים ל-FSIS MLG 4.154.
  2. הומוגניזציה של הדגימות באמצעות Stomacher7 במהירות רגילה ומשך של 120 שניות.
  3. צנטריפוגה והשעיה מחדש
    1. הסר בזהירות את הנוזל מהצד המסונן של השקית באמצעות פיפטה של 50 מ"ל. מפצלים את הנוזל לשני בקבוקי צנטריפוגה סטריליים.
    2. אזנו את הבקבוקים עם BPW סטרילי כדי להבטיח משקלים שווים. צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדור התא ב -3 מ"ל מרק BPW בעזרת מרית סטרילית.
    3. מוסיפים עוד 27 מ"ל מרק BPW ומערבבים היטב על ידי ערבוב בעזרת מרית. שלב את התוכן של שני בקבוקי הצנטריפוגות לבקבוק אחד עבור כל דגימה.

5. הגדרת בלוק MPN

הערה: טבלה 1 מתארת סכימה של הדילולים בגוש של 48 בארות.

  1. הוסף 3 מ"ל מהדגימה המושעה לכל באר בעמודה 1 של בלוק 48 הבארות (8 חזרות).
  2. הכן סדרה של דילולים פי 10 על פני עמודים 1-6 בתוך הבלוק באמצעות פיפטה בעלת שמונה ערוצים.
  3. הוסף 0.3 מ"ל דגימה ל-2.7 מ"ל של פיפטה BPW לערבוב. חזור על הפעולה עבור כל דילול. דגירה של בלוקים למשך הלילה (~18 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-~100 סל"ד.

6. ציפוי וספירה

  1. ספירת לוחית טיפה שונה
    1. לוח 7 מיקרוליטר של דגימה שגדלה בלילה של כל דילול ברשת של 4 x 6 על צלחת אגר באמצעות פיפטה רב-ערוצית (איור 2). שימוש ברשת 4X6 על שתי צלחות מתאים יותר ל-8 דגימות, בניגוד לרשת הטיפוסית של 6X6 של טיפות8.
    2. הניחו לצלחות להתייבש באוויר במשך 10 דקות לפני הדגירה. דגרו את צלחות האגר למשך הלילה (~18-24 שעות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לספור את מספר המושבות בכל צלחת.

7. זיהוי qPCR של סלמונלה

  1. מיצוי DNA באמצעות ערכה מסחרית
    1. ערבבו תרביות בבלוק 48 הבארות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. פיפטה 200 מיקרוליטר מכל תרבית לצלחת PCR של 96 בארות.
    2. אוטמים ואז צנטריפוגה את הצלחת ב 6,600 x גרם למשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט והוסף 20 מיקרוליטר של מגיב הערכה לגלולה.
    3. השעו מחדש את הכדור על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. אוטמים ומחממים את הצלחת בחום של 99 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן מצננים ל-20 מעלות צלזיוס.
    4. שוב צנטריפוגה ב 6,600 x גרם למשך 10 דקות. השתמש ב-2 מיקרוליטר של הסופרנטנט לניתוח qPCR.
  2. הגדרת צלחת
    1. הכן את תערובת תגובת ה-qPCR על פי פרוטוקול9 שנקבע כדלקמן: 10 מיקרוליטר של 2x Master Mix; 0.4 מיקרוליטר מכל פריימר ובדיקה (פתרון עבודה של 10 מיקרומטר): invA קדימה: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG-3', invA הפוך: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', invA בדיקה: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3' מסומן בצבע Cal Fluor Orange 560 fluorenes; 0.2 מיקרוליטר של תבנית בקרת הגברה פנימית (IAC) (6 x 104 עותק/מיקרוליטר)9; 0.4 מיקרוליטר מכל פריימר ובדיקה IAC (10 מיקרומטר): IAC קדימה: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', IAC הפוך: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTA-3', בדיקה IAC: 5'-TTACAACGGGAAGACAATGCCACCA-3' מסומן בצבע TAMRA. כוונן את עוצמת הקול עם ddH2O עד 20 μL בסך הכל.
    2. בצע PCR בזמן אמת עם תנאי הרכיבה הבאים9: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (דנטורציה ראשונית של DNA והפעלה של פולימראז התחלה חמה), 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, השתמש בהגדרות ברירת המחדל של Ct כדי לייצא תוצאות לניתוח.

8. זיהוי באמצעות בדיקת MDS של 3M

  1. עקוב אחר פרוטוקול ערכת הסלמונלה של בדיקת זיהוי מולקולרי. ערבבו תרביות בבלוק 48 הבארות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. פיפטה 20 מיקרוליטר מכל דגימה לתוך צינור הליזיס המסופק על ידי הערכה.
  2. מחממים את הדגימות בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הפתרון יהפוך מוורוד לצהוב. דגרו את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הפתרון ישתנה מצהוב לוורוד.
  3. העבירו 20 מיקרוליטר ליזאט לתוך צינור ריאגנט וטענו את צינורות הריאגנט לתוך המחזיק.
  4. הוסף את המחזיק למכשיר MDS והגדר את התוכנה כדי להעביר את המידע על הערכה והדגימה. המכשיר דורש שכל באר תסומן עם מספר האצווה עבור הבדיקה ושם מדגם. הפעל את תוכנת MDS וייצא את הדוח.

9. ניתוח נתונים

  1. סיווג תוצאות חיוביות ושליליות.
    1. עבור ציפוי טיפות 4X6, העריכו כתמים על צלחות אגר עם לפחות מושבה אחת כחיובית וכתמים על צלחות אגר ללא צמיחה כשליליים.
    2. עבור qPCR, העריכו בארות שיש להן Ct קטן או שווה ל-30 כחיוביות ובארות עם Ct גדול מ-30 כשליליות.
    3. עבור MDS, השתמש בתוצאות ממערכת MDS, המדווחות כחיוביות או שליליות.
  2. חישוב MPN
    1. נתח תוצאות חיוביות ושליליות מוערות באמצעות שיטת רזולוציית ההסתברות המקסימלית הפשוטה (SMPR) שתוארה קודם לכן6 או מחשבוני MPN מאומתים חלופיים. 10

תוצאות

בשר מוקרן
בניתוח רגרסיה, שיפוע של 1 מצביע על כך שעבור כל יחידת עלייה במשתנה הבלתי תלוי (ציר x), המשתנה התלוי (ציר y) גדל ביחידה אחת בדיוק. זה מצביע על קשר פרופורציונלי בין שני המשתנים, כלומר השינוי במשתנה התלוי משקף את השינוי במשתנה הבלתי תלוי. יירוט של 0 פירושו שכאש...

Discussion

משמעות הפרוטוקול
סלמונלה נותרה דאגה מרכזית בבטיחות המזון, במיוחד במוצרי עופות, המעורבים לעתים קרובות בהתפרצויות מחלות הנישאות במזון13,14. כגורם מוביל למחלות חיידקיות הנישאות במזון בארצות הברית, שיטות אמינות לאיתור סלמו?...

Disclosures

כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי משרד החקלאות של ארה"ב, שירות המחקר החקלאי (USDA-ARS), התוכנית הלאומית 108, מספרי מערכת המידע המחקרית הנוכחית 8072-42000-093-000-D ו-8072-42000-094-000-D. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה נועד אך ורק למטרת מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקאי. USDA הוא ספק ומעסיק שוויון הזדמנויות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
48 deep well block 4.6mlFisher Scientific International, IncNC1964628
Agar - Solidifying Agent (Difco)Becton, Dickinson and Company (BD)281230
Analytical BalanceMettler ToledoJL602-G/LEquipment 
Analytical BalanceMettler ToledoAB54-SEquipment 
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam SterilizerSteris plcLV-250Equipment 
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+Labconco Corporation302411101Equipment 
Brain Heart Infusion (BHI) BrothBecton, Dickinson and Company (BD)237500
Buffered Peptone WaterBio-Rad Laboratories Inc.3564684
Cell Spreader - L-shapedVWR76208-438
Centrifuge Microcentrifuge 5424Eppendorf5424Equipment
Centrifuge, Avanti J-25Beckman Coulter, Inc. Equipment
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent Thermo Fisher Scientific Inc. 4318930
Ground Chicken Local retailers
IAC forward  primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'Integrated DNA Technologies 
IAC probe: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC
CACCA-3' labeled with 5' TAMRA/3' BHQ-2		Biosearch Technologies
IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'Integrated DNA Technologies 
Incubator - Inova 4230 incubator shakerNew Brunswick Scientific4230Equipment 
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL Fisher Scientific International, Inc22-363-602
invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG
G-3'		Integrated DNA Technologies 
invA probe: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC
CTTCCTC-3' labeled with 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1		Biosearch Technologies
invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'Integrated DNA Technologies 
Irradiation TreatmentTexas A&M Agrilife Research National Center for Electron Beam ResearchService
Luria Bertani (LB) BrothBecton, Dickinson and Company (BD)244620
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Mettler Toledo17014382Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+Mettler Toledo17014384Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+Mettler Toledo17014388Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Mettler Toledo17014391Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Mettler Toledo17014392Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Mettler Toledo17013805Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+Mettler Toledo17013803Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw CapCorning Inc.1396-1LEquipment
Media Storage Bottle -PYREX 2L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw CapCorning Inc.1397-2LEquipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34cm2, sterile, 108/csMilliporeSigmaZ707902
Mixer - Vortex Genie 2Scientific Industries Inc.SI-0236Equipment
Molecular Detection Assay 2-Salmonella kitNeogenMDA2SAL96
Molecular Detection Instrument NeogenMDS100Equipment 
Motorized pipette controller, PIPETBOY2INTEGRA Biosciences Corp.155019Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression Thermo Fisher Scientific Inc. 4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation TurntableFisher Scientific International, Inc3489E20Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)Fisher Scientific International, IncFB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8Mettler Toledo 30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10Mettler Toledo30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10Mettler Toledo30389276
Ready to cook chicken productsLocal retailers
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettorsThermo Fisher Scientific Inc. 8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)2750036476Equipment
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell SpreadersFisher Scientific International, Inc14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter BagsThermo Fisher Scientific Inc. 01-812
Stomacher 80 Biomaster Lab BlenderSeward30010019Equipment
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)Applied Biosystems535028293Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex Elga LabWaterPF2XXXXM1-USEquipment
Whirlpak bags 1.63L VWR11216-777

References

  1. Batz, M., Hoffmann, S., Morris, J. G. Disease-outcome trees, eq-5d scores, and estimated annual losses of quality-adjusted life years (qalys) for 14 foodborne pathogens in the united states. Foodborne Pathogens and Disease. 11 (5), 395-402 (2014).
  2. . The Grand Challenge: Salmonella Available from: https://tellus.ars.usda.gov/stories/articles/the-grand-challenge-salmonella (2024)
  3. National Advisory Committee on Microbiological Criteria in Foods (NACMCF). Response to questions posed by the food safety and inspection service: Enhancing Salmonella control in poultry products. J Food Prot. 82 (4), 645-668 (2019).
  4. Food Safety and Inspection Service. . 4.15 Isolation and identification of Salmonella from meat, poultry, pasteurized egg, siluriformes (Fish) products and carcass and environmental sponges. , (2024).
  5. Irwin, P., Reed, S., Brewster, J., Nguyen, L., He, Y. P. Non-stochastic sampling error in quantal analyses for campylobacter species on poultry products. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (7), 2353-2369 (2013).
  6. Irwin, P., Tu, S., Damert, W., Phillips, J. A modified gauss-newton algorithm and ninety-six well micro-technique for calculating mpn using excel spreadsheets. Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology. 8 (3), 171-191 (2000).
  7. Ravishankar, S., Ahmed, E. Y., Carlstrom, C. Food microbiology: A laboratory manual. Food Microbiology. 21, 489 (2004).
  8. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and mpn enumeration of campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  9. Suo, B., He, Y., Tu, S. I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathogens and Disease. 7 (6), 619-628 (2010).
  10. Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. J Appl Microbiol. 109 (5), 1660-1667 (2010).
  11. Stevens, R., Poppe, K. Validation of clinical prediction models: What does the "calibration slope" really measure. Journal of Clinical Epidemiology. 118, (2019).
  12. Miller, M. E., Hui, S. L., Tierney, W. M. Validation techniques for logistic regression models. Statistics in Medicine. 10 (8), 1213-1226 (1991).
  13. Galán-Relaño, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Salmonella and salmonellosis: An update on public health implications and control strategies. Animals. 13 (23), 3666 (2023).
  14. Gorski, L., et al. Growth assessment of salmonella enterica multi-serovar populations in poultry rinsates with commonly used enrichment and plating media. Food Microbiology. 119, 104431 (2024).
  15. Schmidt, J. W., et al. Evaluation of methods for identifying poultry wing rinses with salmonella concentrations greater than or equal to 10 cfu/ml. J Food Prot. 87 (11), 100362 (2024).
  16. Gorski, A., Liang, L. S. Effect of enrichment medium on real-time detection of salmonella enterica from lettuce and tomato enrichment cultures. Journal of Food Protection. 73 (6), 1047-1056 (2010).
  17. Guillén, S., Nadal, L., Álvarez, I., Mañas, P., Cebrián, G. Impact of the resistance responses to stress conditions encountered in food and food processing environments on the virulence and growth fitness of non-typhoidal salmonellae. Foods. 10 (3), 617 (2021).
  18. Rohde, A., Hammerl, J. A., Appel, B., Dieckmann, R., Al Dahouk, S. Sampling and homogenization strategies significantly influence the detection of foodborne pathogens in meat. BioMed Research International. 2015, (2015).
  19. Wang, D., Wang, Z., He, F., Kinchla, A. J., Nugen, S. R. Enzymatic digestion for improved bacteria separation from leafy green vegetables. Journal of Food Protection. 79 (8), 1378-1386 (2016).
  20. Pitard, F. F. . Theory of sampling and sampling practice. , (2019).
  21. Sharpe, A. . in Detecting pathogens in food. , 52-68 (2003).
  22. Hannah, J., et al. Effect of stomaching on numbers of bacteria recovered from chicken skin. Poultry Science. 90 (2), 491-493 (2011).
  23. Mcmeekin, T., Thomas, C. Retention of bacteria on chicken skin after immersion in bacterial suspensions. Journal of Applied Bacteriology. 45 (3), 383-387 (1978).
  24. Rodrigues-Szulc, U., Ventoura, G., Mackey, B., Payne, M. Rapid physicochemical detachment, separation and concentration of bacteria from beef surfaces. Journal of Applied Bacteriology. 80 (6), 673-681 (1996).
  25. Vibbert, H. B., et al. Accelerating sample preparation through enzyme-assisted microfiltration of salmonella in chicken extract. Biotechnol Prog. 31 (6), 1551-1562 (2015).
  26. Armstrong, C. M., et al. Use of a commercial tissue dissociation system to detect salmonella-contaminated poultry products. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 416 (3), 621-626 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MPNLAMPFSIS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved