JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا محسنا لمعالجة الكلى البشرية الكاملة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية للنبيبات الكلوية القريبة الأولية وتطبيق هذه الخلايا في منصة ثلاثية الأبعاد ، ميكروفلويديك ، فيزيولوجية دقيقة لتلخيص النبيبات الكلوية القريبة.

Abstract

يصيب مرض الكلى أكثر من 850 مليون شخص على مستوى العالم ، بما في ذلك 37 مليون أمريكي. تشمل عوامل الخطر لأمراض الكلى المزمنة التأثيرات البيئية ، والاستعدادات الوراثية ، والحالات الطبية المصاحبة ، وتاريخ إصابة الكلى الحادة. غالبا ما تستغرق هذه العوامل شهورا أو سنوات لتطويرها ، مما يعقد الدراسات الطولية لمسببات المرض والفيزيولوجيا المرضية. هناك حاجة إلى نماذج الكلى المتقدمة لتحسين فهمنا لآليات المرض وتعزيز التنبؤ بالسمية الكلوية في تطوير الأدوية. تلعب الخلايا الظهارية النبيبية القريبة (PTECs) في الكلى دورا مهما في إزالة الكائنات الحيوية والسموم بالإضافة إلى إعادة امتصاص العناصر الغذائية الأساسية. لقد أثبتنا سابقا أن منصات نظام الفيزيولوجيا الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) (MPS) ، المأهولة ب PTECs الأولية المعزولة ، يمكن استخدامها للتحقيق في التفاعلات الدوائية الكلوية ، وتقييم السمية الكلوية للمركبات ، والتنبؤ بإزالة الأدوية. هنا ، نقدم بروتوكولات لعزل واستزراع PTECs الأولية من الكلى البشرية الكاملة ولبذرها في منصة MPS ثلاثية الأبعاد تحاكي فسيولوجيا الكلى في الجسم الحي . يتيح هذا البروتوكول إجراء دراسات طويلة الأجل تدعم جدوى PTEC ، والتشكل الفسيولوجي ، والاستقطاب الوظيفي لبروتينات النقل الرئيسية في أجهزة MPS لمدة تصل إلى 6 أشهر.

Introduction

تلعب الكلى دورا مهما في إزالة وإزالة مجموعة واسعة من الكائنات الغريبة الحيوية والسموم والمركبات الذاتية من الجسم. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصفية الدم لإزالة الفضلات وتنظيم توازن الإلكتروليت ومستويات السوائل ودرجة الحموضة. تحتوي كل كلية بشرية على حوالي مليون نفرون ، الوحدات الهيكلية والوظيفية للكلية1. داخل هذه النيفرون ، تكون الخلايا الظهارية المتخصصة في الأنابيب القريبة ، والمعروفة باسم الخلايا الظهارية للأنابيب القريبة (PTECs) ، مسؤولة عن إعادة امتصاص الجزيئات الأساسية مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية والأيونات ، وكذلك عن إفراز ركائز الدواء والمواد السامة المحتملة في البول2،3،4. في بعض الحالات ، قد تعيد PTECs أيضا امتصاص المركبات من البول مرة أخرى إلى مجرىالدم 4. نظرا لدورها الحاسم في تفاعلات الأدوية والسموم ، توفر PTECs الأولية المعزولة من الكلى البشرية أداة قيمة لدراسة التفاعلات بين الأدوية الكلوية والأدوية (DDIs) وتقييم السمية الكلوية للمركبات.

تشكل السمية الكلوية التي تسببها الأدوية تحديا سريريا كبيرا ، حيث يمكن أن تؤدي إلى إصابة حادة في الكلى وأمراض الكلىالمزمنة 5. لذلك ، فإن الفهم الأعمق لفسيولوجيا النبيبات الكلوية القريبة أمر ضروري للتنبؤ بدقة وتوصيف إمكانات السمية الكلوية للأدوية والسموم. النماذج التقليدية في المختبر ، بما في ذلك خطوط الخلايا الكلوية الخالدة (على سبيل المثال ، RPTEC-TERT1 ، HK-2) ، لها قيود في تقليد الهيكل المعقد ووظيفة الأنابيب القريبة البشرية6 ، والتي تعمل في ظل تدفق ديناميكي رقائقي (مع رقم رينولدز منخفض) ومصفوفة موحدة خارج الخلية (ECM) في الجسم الحي7،8. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تفشل النماذج التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) في التعبير وظيفيا عن الناقلات الكلوية الرئيسية (على سبيل المثال ، ناقل الأنيون العضوي 1 و 3 (OAT1 و OAT3) ، ناقل الكاتيون العضوي 2 (OCT2)) بسبب التحلل السريع واستيعاب هذه البروتينات6،9،10،11. على الرغم من أن النماذج الحيوانية غنية بالمعلومات ، قد لا تكرر بشكل كامل فسيولوجيا الكلى البشرية وغالبا ما تفتقر إلى قابلية الترجمة بسبب اختلافات الأنواع في تعبير الناقلونشاطه 12. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن mOct1 بشكل جانبي في PTECs للفأر ، بينما في البشر ، لا يمكن اكتشاف تعبير البروتين الغشائي ل OCT1 في الكلى13،14.

مكنت التطورات في أنظمة الفيزيولوجيا الدقيقة (MPS) وتقنيات الأعضاء على الرقاقة الباحثين من تطوير نماذج في المختبر تحاكي عن كثب الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وظروف تدفق السوائل الديناميكية للأعضاء البشرية15. قامت مجموعتنا سابقا بتمييز نموذجين من MPS باستخدام PTECs16،17 ، واستخدمت هذه النماذج لإجراء دراسات السمية18،19،20 والتنبؤ بالتخلص من الدواء بدقة21. يوفر استخدام PTECs الأولية في هذه النماذج مزايا كبيرة نظرا لقدرتها على الاحتفاظ بالخصائص الوظيفية التي لوحظت في الجسم الحي.

هنا ، نقدم بروتوكولات عزل PTECs البشرية عن كلية بشرية سليمة تم الحصول عليها من متبرع متوفى عبر منظمة شراء الأعضاء المعتمدة من الشبكة المتحدة لمشاركة الأعضاء (UNOS) وتطبيق هذه المعالجات المؤقتة البكتيرية البشرية المثقفة داخل منصة MPS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إجراء جميع الأعمال وفقا لإرشادات جامعة واشنطن للتعامل مع الأنسجة البشرية. يستوفي المتبرعون المناسبون المتطلبات التالية: أقل من 36 ساعة من وقت الإقفار البارد (CIT) ، ولا يوجد تاريخ معروف لأمراض الكلى ، أو غسيل الكلى ، أو أي حالات طبية أخرى (على سبيل المثال ، داء السكري من النوع 1 أو 2 ، أو التهاب الكبد B ، أو التهاب الكبد C ، أو فيروسات نقص المناعة البشرية (HIV) ، أو التهاب السحايا الفيروسي / الجرثومي ، أو عدوى المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ، أو مرض الزهري ، أو الإنتان ، أو Covid-19). تم الحصول على الكلى البشرية بأكملها المستخدمة في هذه الدراسة من خلال OPO المعتمد من UNOS.

1. إعداد خزانة السلامة الحيوية

  1. رش غطاء المحرك بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتطهير جميع الأسطح والعناصر الموجودة داخل الخزانة لخلق بيئة معقمة.
  2. ضع وسادات ماصة زرقاء. قم بإجراء جميع أعمال الأنسجة على هذه الفوط.
  3. تأكد من توفر المعدات اللازمة في خزانة السلامة الحيوية وتعقيمها بشكل صحيح (شفرات الحلاقة، وأطراف الماصة المصلية، ومسدس الماصة المصلي، ومصافي الخلايا 100 ميكرومتر، وأطراف p1000، وماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر، وأطباق استزراع دائرية مقاس 15 سم، وأنابيب مخروطية).

2. تحضير المعالجة المسبقة للكلى

  1. تحضير محلول هضم الكلى عن طريق إضافة 0.75 مجم / مل كولاجيناز IV + 0.75 مجم / مل ديسباز II في محلول ملحي بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco مع الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح غشاء معقم 0.2 ميكرومتر.
    ملاحظة: بالنسبة للكلية البشرية البالغة بأكملها ، يلزم وجود ما يقرب من 14 أنبوبا مخروطيا سعة 50 مل ، يحتوي كل منها على ~ 35 مل من محلول الهضم (إجمالي 500 مل).
  2. تحضير وسائط PTEC بإضافة 4.425 جم من مسحوق Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 بدون جلوكوز ، و 0.5 جم من مسحوق D-glucose ، و 0.6 جم من مسحوق بيكربونات الصوديوم ، و 5 مل من مكمل الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم 100x (يحتوي على 1000 مجم / لتر من الأنسولين ، و 550 مجم / لتر ترانسفيرين ، و 0.67 مجم / لتر سيلينيت الصوديوم) ، و 0.5 مل من 50 ميكرومتر من الهيدروكورتيزون ، و 5 مل من محلول المضادات الحيوية المضادة للفطريات 100x (يحتوي على 10000 وحدة / مل من البنسلين G الصوديوم ، 10000 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب في محلول ملحي 0.85٪) في 500 مل من الماء المعقم فائق النقاء (النوع 1). قم بتصفية الوسائط من خلال مرشح غشاء معقم 0.2 ميكرومتر. قم بإذابة مصل الأبقار الجنينية (FBS) وصنع 10 مل من الحصص في 14 50 مل من الأنابيب المخروطية الشكل.
  3. اجمع وتسمية مجموعة إضافية من الأنابيب المخروطية سعة 50 مل. في هذه الخطوة ، تأكد من وجود 3 مجموعات من 14 50 أنابيب مل.
  4. قم بتسخين الخلاط المداري مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

3. عزل PTECs من الكلى بأكملها

  1. باستخدام تقنية معقمة ، ضع حاوية الشحن مع عينة الأنسجة في غطاء السلامة الحيوية. أخرج الكيس من الصندوق ورش الجزء الخارجي بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعه في الغطاء.
  2. ضع الكلية في طبق استزراع دائري مقاس 15 سم. شفط / تجاهل الوسائط المتبقية.
  3. قم بإزالة الدهون المحيطة والكبسولة الكلوية باستخدام شفرات حلاقة معقمة. قم بتقطيع الكبسولة الكلوية برفق لإنشاء شق في المنتصف.
  4. باستخدام الملقط ، اسحب الكبسولة واستخدم شفرات الحلاقة لتقطيع أي دهون ملتصقة بالكلى. تخلص من كل من الكبسولة والدهون في طبق آخر بحجم 15 سم.
  5. افصل القشرة (~ 1 سم) عن النخاع. تخلص من النخاع.
    ملاحظة: القشرة لها لون أصفر بني فاتح مقارنة بالنخاع.
  6. باستخدام شفرة حلاقة ، افرم المنديل إلى <1 سم3 قطع حتى يصبح مظهره يشبه الملاط.
  7. أضف كمية صغيرة من محلول هضم الكلى إلى الطبق وانقل الملاط إلى المجموعة الأولى من أنابيب سعة 50 مل تحتوي على 35 مل من محلول هضم الكلى. وزعي بالتساوي ولا تتجاوز الحجم الإجمالي 45 مل لكل أنبوب.
  8. انقل جميع الأنابيب إلى شاكر المداري 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة 30 دقيقة بأعلى سرعة لا تتسبب في سقوط الأنابيب. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  9. اقلب الأنابيب للخلط واترك القطع الكبيرة من الأنسجة تستقر في الأسفل. نقل أكبر قدر ممكن من المحلول إلى الأنابيب المخروطية سعة 50 مل التي تحتوي على 10 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) دون نقل الأنسجة السليمة. وزعي بالتساوي ولا تتجاوز الحجم الإجمالي 45 مل لكل أنبوب.
  10. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 200 جم لمدة 7 دقائق. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  11. استنشق بعناية من المادة الطافية أضف 10 مل من وسائط PTEC في كل أنبوب وأعد تعليق الكريات.
  12. قم بتصفية معلقات الخلية الناتجة من خلال مصافي خلية 100 ميكرومتر في أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مل.
  13. الطرد المركزي ، يتم ترشيح الخلية الناتجة عند 400 جم لمدة 5 دقائق. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  14. اغسل الكريات ب 5 مل من DPBS. أعد تعليق الكريات باستخدام طرف p1000.
  15. الطرد المركزي الأنابيب عند 400 جم لمدة 5 دقائق. انقل الأنابيب مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية بعد رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم استنشق المواد الطافية
  16. كرر الخطوة 3.15 مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق كريات الخلايا ب 15 مل من وسائط PTEC وقم بوضع الخلايا على قوارير T-75 لزراعة الخلايا المعقمة.
  17. قم بتسمية القوارير بشكل مناسب واسمح للخلايا بالنمو في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. اسمح ل PTECs بالنمو دون إزعاج في الحاضنة لمدة 48 ساعة قبل تغيير الوسائط الأول.

4. تغييرات الوسائط

  1. استنشق الوسائط من القوارير.
  2. اغسل الخلايا ب 5 مل من DPBS الدافئ مسبقا.
  3. أضف 5 مل من وسائط PTEC الدافئة مسبقا إلى قوارير T-25.
  4. أعد القارورة إلى الحاضنة.
  5. قم بتغيير الوسائط كل 48 ساعة حتى تصل القارورة إلى 70٪ على الأقل للمرور أو استخدامها في التجارب.

5. تمرير PTECs

  1. استنشق الوسائط من القارورة. أضف 5 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA الدافئ مسبقا في كل قارورة T-25 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 دقيقة للسماح بهضم التربسين.
  2. بمجرد فصل الخلايا ، قم بتحييد التربسين باستخدام 5 مل من محلول مثبط التربسين المحدد مسبقا.
  3. قم بتعليق 5 مرات لإخراج أي خلايا لا تزال متصلة بالقارورة. بعد ذلك ، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 400 جم لمدة 5 دقائق.
  4. استنشق الطاف.
    ملاحظة: توقف هنا لحفظ PTECs بالتبريد والانتقال إلى هذا البروتوكول.
  5. قم بتعليق كريات الخلية ب 14 مل من وسائط PTEC لكل أنبوب. انقل معلقات الخلية إلى قوارير T-75 (أنبوب واحد لكل قارورة).
  6. قم بإجراء T Jer لتوزيع الخلايا عبر القارورة بالتساوي. مراقبة الخلايا وتغيير الوسائط كل 48 ساعة.

6. PTECs الحفظ بالتبريد

  1. بعد الخطوة 5.6 ، أعد تعليق كريات الخلية في 2 مل من وسائط PTEC منخفضة الجلوكوز بنسبة 10٪ و 90٪ لكل أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وانقل 1 مل إلى أنبوب مبرد واحد.
  2. انقل المبردات إلى حاوية تجميد الخلايا التي تسمح بالتجميد بالتحكم في درجة الحرارة وضع الحاوية في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة عند -80 درجة مئوية ، انقل المبردات إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

7. ذوبان PTECs

  1. قم بإذابة القارورة من -80 درجة مئوية في حمام مائي 37 درجة مئوية. لا تذوب في درجة حرارة الغرفة (RT). بمجرد إذابة القارورة جزئيا (يجب أن تكون هناك قطعة صغيرة من الثلج مرئية) ، أضف 1 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 10 مل من وسائط PTEC الدافئة مسبقا.
  2. قم بتدوير معلق الخلية عند 400 جم لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسائط PTEC منخفضة الجلوكوز الدافئة مسبقا.
  3. انقل معلق الخلية سعة 5 مل إلى قارورة T-25 وقم بإجراء اهتزاز على شكل حرف T لتوزيع الخلايا عبر القارورة بالتساوي. من هنا، اتبع القسم 4 للاطلاع على تغييرات الوسائط.

8. طلاء جهاز MPS بمصفوفة الكولاجين من النوع الأول

  1. استنشق PBS من جهاز MPS وقم بإزالة الجهاز من العبوة. امسح الجهاز حتى يجف بمناديل طبية وقم بتسميتها حسب الرغبة.
  2. ضع جهاز MPS في طبق ثقافة دائري مقاس 15 سم وضعه في 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. احتفظ بمناديل طبية في قاع الطبق لمنع الرطوبة على جهاز MPS.
  3. احتفظ بمحاقن 1 مل مع 22 جم من إبرة Luer-Lok متصلة عند -20 درجة مئوية حتى استخدامها لحقن الكولاجين I.
  4. لكل أربعة أجهزة MPS تحتاج إلى التعبئة ، احتفظ بأنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل على الجليد. استخدم حقنة واحدة سعة 1 مل مع إبرة حادة متصلة لكل أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  5. باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة الحيوية ، افتح جميع المنافذ الموجودة على جهاز MPS. تأكد من محاذاة الشقوق الموجودة في الجزء العلوي من كل صمام لولبي عموديا مع المنفذ.
  6. باستخدام مجموعة حادة من حقنة / إبرة سعة 1 مل ، قم بغسل غرفة ECM ب 1 مل من الإيثانول في المنافذ # 1 و # 3 و # 6. استنشق الإيثانول واتركه يتبخر تماما (30 ثانية على الأقل) حتى لا يخترق جهاز MPS من المنافذ # 2 و # 4 و # 5.
  7. ضع جهاز MPS مرة أخرى عند 4 درجات مئوية ، واحتفظ بوسائط PTEC و M199 و 1 N NaOH على الجليد.
  8. احسب تكوين المصفوفة ل 1 مل من خليط الكولاجين من النوع الأول لما يقرب من أربعة أجهزة MPS وفقا للجدول 1 (المقياس حسب الحاجة). في خزانة السلامة الحيوية ، امزج وسائط PTEC و M199 و 1 N هيدروكسيد الصوديوم بهذا الترتيب ، وفقا للحسابات المذكورة أعلاه ، واحتفظ بجميع الأنابيب على الجليد.
  9. أضف بعناية مرق الكولاجين من النوع الأول مع حقنة 1 مل إلى المزيج الجاهز. اخلطي خليط الكولاجين عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل حتى يصبح لون السلمون البرتقالي والوردي مستقر.
  10. لفترة وجيزة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لجمع المحلول في الأسفل. تأكد من عدم وجود فقاعات في المحلول.
  11. ضع المحاقن المبردة مسبقا سعة 1 مل مع حادة إبرة 22 G Luer-Lok وجهاز MPS في خزانة السلامة الحيوية وعلى الثلج. املأ المحقنة المبردة مسبقا سعة 1 مل بخليط الكولاجين وتجنب الفقاعات تماما.
  12. قم بحقن محلول الكولاجين ببطء شديد وبرفق في المنافذ # 1 و # 3 و # 6 من غرف الجهاز المبرد. أمسك الجهاز عموديا بحيث تكون المنافذ متجهة لأسفل للسماح لفقاعات الهواء بالتدفق لأعلى والخارج من المنافذ #2 و#4 و#5.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك قطرة من خليط الكولاجين في المنافذ # 2 و # 4 و # 5 ، مما يشير إلى أن الغرف مغلفة بالكامل.
  13. قم بإزالة المحقنة وضعها مرة أخرى في أنبوب 15 مل على الثلج. أدر الصمام اللولبي للمنافذ # 2 و # 4 و # 5 لإغلاق الشريحة المملوءة ووضع الشريحة على طبق الثقافة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  14. بعد 30 دقيقة ، انقل الشريحة مع الطبق إلى خزانة السلامة الحيوية بطريقة معقمة وافرد الرقائق بالتساوي والفردي حتى تسخن بشكل موحد.
  15. ضع منديلا طبيا مبللا في كل طبق (لمنع مصفوفة الكولاجين I من الجفاف والتقشير بعيدا عن جدران جهاز MPS) وأغلق الأطباق بغشاء مانع للتسرب مرن شبه شفاف. اسمح للكولاجين بالبلمرة طوال الليل في RT.

9. إنشاء تجويف أنبوبي باستخدام الكولاجين من النوع الرابع كوحدة التحكم في الميكروفون في جهاز MPS

  1. تعقيم أنابيب C-flex عن طريق شطف الأنابيب بماء فائق النقاء (النوع 1) والإيثانول النقي ، ثم قم بتعقيم خط الأنابيب بالكامل.
  2. في خزانة السلامة الحيوية ، افتح جميع منافذ جهاز MPS المملوء بالكولاجين من النوع الأول (سيكون الصمام اللولبي عموديا مع المنافذ) وقم بإزالة السلك البارز من المنافذ # 1 و # 3 و # 6 لتشكيل التجويف الأنبوبي.
  3. أدخل قارنات التوصيل المعدنية في المنافذ #1 و#3 و#6.
  4. قم بإعداد محلول 10 مل من 5 ميكروغرام / مل من النوع الرابع من الكولاجين في وسائط PTEC.
  5. أدخل 24 بوصة من الأنابيب المرنة C المعقمة على الحواد المعدنية البارزة من المنافذ # 1 و # 3 و # 6.
  6. املأ 1 مل من المحاقن المزودة بإبرة Luer-Lok 22 جم مع 0.5 مل من محلول الكولاجين من النوع الرابع.
  7. ضع المحقنة المملوءة على مضخة ضخ حقنة وقم بتوصيل الأنبوب من المنفذ # 1 بالمحقنة. كرر هذه الخطوة للمنفذين #3 و#6.
  8. باستخدام مضخة الحقنة، قم بتوصيل محلول الكولاجين من النوع الرابع إلى منافذ MPS بمعدل 10 ميكرولتر/دقيقة لمدة 30 دقيقة. بمجرد غرس المنافذ ، اترك الكولاجين يتجمد في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل قبل استخدامها في اليوم التالي.
    ملاحظة: يمكن تخزين أجهزة MPS المطلية بالكولاجين من النوع الرابع لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية.

10. بذر PTECs الأولية في جهاز MPS

  1. افحص جهاز MPS تحت المجهر للتأكد من تكوين التجويف بشكل صحيح.
  2. ضع حقنة معقمة مسبقا سعة 5 مل بإبرة 22 جم في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من الإيثانول.
  3. احصل على حبيبات خلية PTEC في أنبوب مخروطي سعة 15 مل من قارورة T-25 باتباع الخطوات 5.1. إلى 5.3. أضف 80 ميكرولتر من وسائط PTEC إلى حبيبات الخلية وأعدها برفق.
  4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
  5. قم بإزالة الطبق الذي يحتوي على جهاز MPS من الحاضنة وضعه في خزانة السلامة الحيوية. أغلق المنافذ #2 و#4 و#5، وأدر الصمام اللولبي أفقيا إلى المنافذ.
  6. قم بنقر الأنبوب المحتوي على PTEC برفق لإعادة تعليق الخلايا. املأ المحقنة بالخلايا وأدخل الإبرة في منفذ الحقن الأبعد عن منافذ الصمامات اللولبية.
  7. اضغط بعناية على مكبس المحقنة لحقن الخلايا. تصور الخلايا بعد الحقن تحت المجهر.
    ملاحظة: يجب أن تتحرك الخلايا عبر التجويف. إذا لم يتم ملاحظة أي خلايا في التجويف ، فتحقق مما إذا كانت الإبرة قد تم إدخالها بإحكام في منفذ الحقن وأعد إدخال الإبرة إذا لزم الأمر. يمكن أن تملأ حقنة كاملة من الخلايا جميع اللومن الثلاثة على الجهاز.
  8. استمر في حقن الخلايا مع المنفذين الآخرين. بعد الحقن، أغلق المنافذ #2 و#4 و#5 وأعد جهاز MPS إلى الحاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. حافظ على مستوى اللوحة حتى لا تتحرك الخلايا خارج التجويف عن طريق الجاذبية.
  9. بالنسبة لأجهزة MPS الإضافية ، اغسل المحقنة بالإيثانول بعد إفراغها واغسلها باستخدام DPBS قبل سحب الخلايا.
  10. اسمح لأجهزة MPS بالجلوس طوال الليل دون إزعاج.
  11. في اليوم التالي ، قم بتوصيل أجهزة MPS بمضخات الحقنة.
  12. في خزانة السلامة الحيوية ، املأ محاقن سعة 5 مل بوسائط PTEC. بعد ذلك ، قم بتركيب 22 G Luer-Lok مع قسم 24 بوصة من الأنابيب C-flex المرفقة بالمحاقن.
  13. ضع المحاقن المحملة بالوسائط PTEC في مضخة المحقنة. قم بتجهيز الخطوط لإزالة أي فقاعات هواء.
  14. قم بتوصيل خطوط الأنابيب المعدة بالمنافذ # 1 و # 3 و # 6 وقم بتدوير الصمامات اللولبية إلى وضع رأسي لإدخال تدفق الوسائط.
  15. اضبط معدل تدفق مضخة الحقنة على 0.5 ميكرولتر / دقيقة. ضع الطبق مع جهاز MPS مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية واسمح للخلايا بتكوين أنابيب (في غضون 5 إلى 7 أيام) تحت نضح الوسائط المستمر قبل بدء التجربة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

مورفولوجيا وتقاء PTECs الأولية المعزولة بمرور الوقت في ثقافة ثنائية الأبعاد
بعد العزلة عن قشرة الكلى ، سمح ل PTECs بالنمو دون إزعاج لمدة 48 ساعة على الأقل قبل أول تغيير للوسائط. بعد أسبوع تقريبا من زراعة الخلايا ، يجب أن تظهر دفعات صغيرة من PTECs في جميع أنحاء قارورة ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

توفر MPS ، أو تقنيات الأعضاء على الرقاقة ، منصة مختبرية ذات صلة كبيرة لتلخيص الجوانب الرئيسية لعلم وظائف الأعضاء البشري ، وبالتالي تقليل الاعتماد على النماذج الحيوانية في تطوير الأدوية والتقييمات السمية. في الآونة الأخيرة ، سمح قانون تحديث إدارة الغذاء والدواء 2.0 (202...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح أو إفصاحات مالية ذات صلة بهذه الدراسة.

Acknowledgements

تم دعم أجزاء من هذا العمل من خلال عقد ناسا 80ARC023CA001 ، والمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية (NCATS) (U2CTR004867 ، UH3TR000504 ، UG3TR002158) ، بالاشتراك مع NCATS ومركز تقدم العلوم في الفضاء (CASIS) (UG3TR002178) ، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (NIEHS) (P30ES00703) ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (T32GM007750) ، وهدية غير مقيدة من مراكز الكلى الشمالية الغربية لأبحاث الكلى معهد وكلية الصيدلة بجامعة واشنطن (جائزة جي بينغ وانغ وزمالة برادلي).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific14-959-53A
3D microphysiological DeviceNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagenase, Type IV, powderThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Defined Trypsin InhibitorThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, powderThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o GlucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidneyNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Incubating Orbital ShakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Internal Thread Cryogenic VialsCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inchesInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Small Benchtop CentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metal Coupler (blunt)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Freezing ContainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Original model discontinued 
Nunc Non-treated Flasks, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, SterileGreiner Bio-One607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")Cole-Parmer06422-00
Single edge razor blade (sterile)BiosealKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Sodium HydroxideMilliporeSigmaS8045
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermoFisher Scientific567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm VentedGenesee Scientific25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Type I collagen, rat tailCorning354236
Type IV Collagen, MouseCorning354233

References

  1. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  2. Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational study. BMC Nephrol. 21, 108(2020).
  3. Wang, K., Kestenbaum, B. Proximal tubular secretory clearance. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (8), 1291-1296 (2018).
  4. Yin, J., Wang, J. Renal drug transporters and their significance in drug-drug interactions. Acta Pharm Sin B. 6 (5), 363-373 (2016).
  5. Connor, S., Roberts, R. A., Tong, W. Drug-induced kidney injury: challenges and opportunities. Toxicol Res (Camb). 13 (4), tfae119(2024).
  6. Meijer, T., et al. Characterization of organic anion and cation transport in three human renal proximal tubular epithelial models. Cells. 13 (12), 1008(2024).
  7. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 97, 4-27 (2016).
  8. Miceli, C., et al. Fluid flow-induced shear stress controls the metabolism of proximal tubule kidney epithelial cells through primary cilium-dependent lipophagy and mitochondria biogenesis. Autophagy. 16 (12), 2287-2288 (2020).
  9. Tsang, Y. P., Hao, T., Mao, Q., Kelly, E. J., Unadkat, J. D. Dysregulation of the mRNA expression of human renal drug transporters by proinflammatory cytokines in primary human proximal tubular epithelial cells. Pharmaceutics. 16 (2), 285(2024).
  10. Bajaj, P., et al. Freshly isolated primary human proximal tubule cells as an in vitro model for the detection of renal tubular toxicity. Toxicology. 442, 152535(2020).
  11. Brown, C. D. A., et al. Characterisation of human tubular cell monolayers as a model of proximal tubular xenobiotic handling. Toxicol Appl Pharmacol. 233 (3), 428-438 (2008).
  12. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28 (10), 2432-2438 (2013).
  13. Morse, B. L., et al. Pharmacokinetics of organic cation transporter 1 (OCT1) substrates in Oct1/2 knockout mice and species difference in hepatic OCT1-mediated uptake. Drug Metab Dispos. 48 (2), 93-105 (2020).
  14. Samodelov, S. L., Kullak-Ublick, G. A., Gai, Z., Visentin, M. Organic cation transporters in human physiology, pharmacology, and toxicology. Int J Mol Sci. 21 (21), 7890(2020).
  15. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  16. Weber, E. J., et al. Development of a microphysiological model of human kidney proximal tubule function. Kidney Int. 90 (3), 627-637 (2016).
  17. Chapron, A., et al. An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion. ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).
  18. Adler, M., et al. A quantitative approach to screen for nephrotoxic compounds in vitro. J Am Soc Nephrol. 27 (4), 1015-1028 (2016).
  19. Chang, S., et al. Human liver-kidney model elucidates the mechanisms of aristolochic acid nephrotoxicity. JCI Insight. 2 (22), e95978(2017).
  20. Weber, E. J., et al. Human kidney on a chip assessment of polymyxin antibiotic nephrotoxicity. JCI Insight. 3 (24), e123673(2018).
  21. Imaoka, T., et al. Bridging the gap between in silico and in vivo by modeling opioid disposition in a kidney proximal tubule microphysiological system. Sci Rep. 11 (1), 21356(2021).
  22. Van Ness, K. P., Chang, S., Weber, E. J., Zumpano, D., Eaton, D. L., Kelly, E. J. Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity. Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).
  23. Lidberg, K. A., et al. Serum protein exposure activates a core regulatory program driving human proximal tubule injury. J Am Soc Nephrol. 33 (5), 949-965 (2022).
  24. Sakolish, C., et al. Technology transfer of the microphysiological systems: a case study of the human proximal tubule tissue chip. Sci Rep. 8 (1), 14882(2018).
  25. Hart, A., et al. Identification of prognostic biomarkers for antibiotic associated nephrotoxicity in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 23 (2), 293-299 (2024).
  26. Lidberg, K. A., et al. Antisense oligonucleotide development for the selective modulation of CYP3A5 in renal disease. Sci Rep. 11 (1), 4722(2021).
  27. Imaoka, T., et al. Microphysiological system modeling of ochratoxin A-associated nephrotoxicity. Toxicology. 444, 152582(2020).
  28. Chapron, B. D., et al. Reevaluating the role of megalin in renal vitamin D homeostasis using a human cellderived microphysiological system. ALTEX. 35 (4), 504-515 (2018).
  29. Adashi, E. Y., O'Mahony, D. P., Cohen, I. G. The FDA modernization act 2.0: drug testing in animals is rendered optional. Am J Med. 136 (9), 853-854 (2023).
  30. Qi, W., Johnson, D. W., Vesey, D. A., Pollock, C. A., Chen, X. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (methods in renal research). Nephrology. 12 (2), 155-159 (2007).
  31. Mihevc, M., Petreski, T., Maver, U., Bevc, S. Renal proximal tubular epithelial cells: review of isolation, characterization, and culturing techniques. Mol Biol Rep. 47 (12), 9865-9882 (2020).
  32. Shaver, C. M., et al. Cellfree hemoglobin augments acute kidney injury during experimental sepsis. Am J Physiol Renal Physiol. 317 (4), F922-F929 (2019).
  33. Sbarbati, R. Separation of human endothelial cells from fibroblasts by centrifugation in Percoll gradients. Biosci Rep. 5 (6), 469-472 (1985).
  34. Horn, P., et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 10 (7), 676-685 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved