JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Primer renal proksimal tübül epitel hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için tüm insan böbreklerinin işlenmesi ve bu hücrelerin renal proksimal tübülü özetlemek için üç boyutlu, mikroakışkan, mikrofizyolojik bir platformda uygulanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Özet

Böbrek hastalığı, 37 milyon Amerikalı da dahil olmak üzere dünya çapında 850 milyondan fazla insanı etkilemektedir. Kronik böbrek hastalığı için risk faktörleri arasında çevresel etkiler, genetik yatkınlıklar, birlikte var olan tıbbi durumlar ve akut böbrek hasarı öyküsü yer alır. Bu faktörlerin gelişmesi genellikle aylar veya yıllar alır ve hastalık etiyolojisi ve patofizyolojisi ile ilgili uzunlamasına çalışmaları karmaşıklaştırır. Hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamamızı sağlamak ve ilaç geliştirmede nefrotoksisite tahminini geliştirmek için gelişmiş böbrek modellerine ihtiyaç vardır. Böbrekteki proksimal tübül epitel hücreleri (PTEC'ler), ksenobiyotik ve toksin klirensinin yanı sıra temel besin maddelerinin yeniden emilmesinde kritik bir rol oynar. Daha önce, izole edilmiş primer PTEC'lerle doldurulmuş üç boyutlu (3D) mikrofizyolojik sistem (MPS) platformlarının, renal ilaç etkileşimlerini araştırmak, bileşiklerin nefrotoksisitesini değerlendirmek ve ilaç klerensini tahmin etmek için kullanılabileceğini göstermiştik. Burada, tüm insan böbreklerinden birincil PTEC'leri izole etmek ve kültürlemek ve bunları in vivo böbrek fizyolojisini taklit eden bir 3D MPS platformuna tohumlamak için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, MPS cihazlarında 6 aya kadar PTEC canlılığını, fizyolojik morfolojisini ve anahtar taşıyıcı proteinlerin fonksiyonel polarizasyonunu destekleyen uzun vadeli çalışmalara olanak tanır.

Giriş

Böbrek, çok çeşitli ksenobiyotiklerin, toksinlerin ve endojen bileşiklerin vücuttan temizlenmesinde ve ortadan kaldırılmasında kritik bir rol oynar. Bu, atık ürünleri uzaklaştırmak için kanın filtrelenmesi ve elektrolit dengesinin, sıvı seviyelerinin ve pH'ın düzenlenmesiyle elde edilir. Her insan böbreği, böbreğin yapısal ve işlevsel birimleri olan yaklaşık bir milyon nefron içerir1. Bu nefronlar içinde, proksimal tübül epitel hücreleri (PTEC'ler) olarak bilinen proksimal tübüllerdeki özel epitel hücreleri, glikoz, amino asitler ve iyonlar gibi temel moleküllerin yeniden emilmesinden ve ayrıca ilaç substratlarının ve potansiyel olarak toksik maddelerin idrara salgılanmasından sorumludur 2,3,4. Bazı durumlarda, PTEC'ler ayrıca idrardaki bileşikleri kan dolaşımına geri emebilir4. İlaç ve toksin etkileşimlerindeki kritik rolleri nedeniyle, insan böbreklerinden izole edilen primer PTEC'ler, renal ilaç-ilaç etkileşimlerini (DDI'ler) incelemek ve bileşiklerin nefrotoksisitesini değerlendirmek için değerli bir araç sağlar.

İlaca bağlı nefrotoksisite, akut böbrek hasarına ve kronik böbrek hastalığına yol açabileceğinden önemli bir klinik zorluk teşkil etmektedir5. Bu nedenle, ilaçların ve toksinlerin nefrotoksik potansiyelini doğru bir şekilde tahmin etmek ve karakterize etmek için renal proksimal tübül fizyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması esastır. Ölümsüzleştirilmiş renal hücre hatları (örneğin, RPTEC-TERT1, HK-2) dahil olmak üzere geleneksel in vitro modeller, dinamik, laminer akış (düşük Reynolds sayısı ile) ve in vivo7,8 altında çalışan insan proksimal tübüllerinin6 karmaşık yapısını ve işlevini taklit etmede sınırlamalara sahiptir. Ek olarak, geleneksel iki boyutlu (2D) modeller, bu proteinlerin hızlı bozunması ve içselleştirilmesi nedeniyle genellikle ana böbrek taşıyıcılarını (örneğin, organik anyon taşıyıcı 1 ve 3 (OAT1 ve OAT3), organik katyon taşıyıcı 2 (OCT2)) işlevsel olarak ifade edemez 6,9,10,11. Hayvan modelleri, bilgilendirici olmakla birlikte, insan böbrek fizyolojisini tam olarak kopyalayamayabilir ve taşıyıcı ekspresyonu ve aktivitesindeki tür farklılıkları nedeniyle genellikle çevrilebilirlikten yoksundur12. Örneğin, mOct1 fare PTEC'lerinde bazolateral olarak eksprese edilirken, insanlarda böbrekte OCT1'in membran protein ekspresyonu tespit edilemez13,14.

Mikrofizyolojik sistemlerdeki (MPS) ve çip üzerinde organ teknolojilerindeki gelişmeler, araştırmacıların insan organlarının üç boyutlu (3D) mimarisini ve dinamik sıvı akış koşullarını yakından taklit eden in vitro modeller geliştirmelerini sağlamıştır15. Grubumuz daha önce PTEC'ler16,17 ile iki MPS modelini karakterize etmiş ve bu modelleri toksisite çalışmaları 18,19,20 yapmak ve ilaç dağılımını doğru bir şekilde tahmin etmek için kullanmıştır21. Bu modellerde birincil PTEC'lerin kullanılması, in vivo olarak gözlemlenen fonksiyonel özellikleri koruma yetenekleri nedeniyle önemli avantajlar sağlar.

Burada, Birleşik Organ Paylaşımı Ağı (UNOS) onaylı bir organ tedarik organizasyonu aracılığıyla vefat etmiş bir donörden elde edilen sağlam bir insan böbreğinden insan PTEC'lerinin izolasyonu ve bu kültürlenmiş insan PTEC'lerinin bir MPS platformu içinde uygulanması için protokolleri sunuyoruz.

Protokol

Tüm çalışmalar, Washington Üniversitesi'nin insan dokusu işleme yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Uygun donörler aşağıdaki gereksinimleri karşılar: 36 saatten az soğuk iskemik zaman (CIT), bilinen böbrek hastalığı öyküsü, diyaliz veya başka herhangi bir tıbbi durum (ör., diabetes mellitus tip 1 veya 2, hepatit B, hepatit C, insan immün yetmezlik virüsleri (HIV), viral/bakteriyel menenjit, metisiline dirençli Staphylococcus aureus enfeksiyonu, sifiliz, sepsis veya Covid-19). Bu çalışmada kullanılan tüm insan böbrekleri, UNOS onaylı bir OPO aracılığıyla elde edildi.

1. Biyogüvenlik kabini hazırlığı

  1. Kaputa %70 etanol püskürtün. Steril bir ortam oluşturmak için kabinin içindeki tüm yüzeyleri ve eşyaları dekontamine edin.
  2. Mavi emici pedleri yere koyun. Tüm doku işlemlerini bu pedler üzerinden gerçekleştirin.
  3. Biyogüvenlik kabininde gerekli ekipmanların mevcut olduğundan ve uygun şekilde sterilize edildiğinden emin olun (tıraş bıçakları, serolojik pipet uçları, serolojik pipet tabancası, 100 μm hücre süzgeçleri, p1000 uçlar, 1000 μL mikropipet, 15 cm dairesel kültür kapları ve konik tüpler).

2. Böbrek ön işleme hazırlığı

  1. Kalsiyum ve magnezyum ile Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin'ine (DPBS) 0.75 mg / mL kollajenaz IV + 0.75 mg / mL dispas II ekleyerek böbrek sindirim solüsyonu hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm steril membran filtreden süzün.
    NOT: Bütün bir insan yetişkin böbreği için, her biri ~ 35 mL sindirim çözeltisi (toplam 500 mL) içeren yaklaşık 14 adet 50 mL konik tüp gereklidir.
  2. 4.425 g Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) / F12 tozu, 0.5 g D-glikoz tozu, 0.6 g sodyum bikarbonat tozu, 5 mL 100x insülin-transferrin-selenyum takviyesi (1000 mg / L insülin, 550 mg / L transferrin ve 0.67 mg / L sodyum selenit içerir), 0.5 mL 50 μM hidrokortizon ve 5 mL 100x antibiyotik-antimikotik çözelti (10000 birim / mL penisilin G sodyum içeren) ekleyerek PTEC ortamını hazırlayın, 10000 μg/mL streptomisin sülfat ve %0.85 tuzlu su içinde 25 μg/mL amfoterisin B) 500 mL steril otoklavlanmış ultra saf (Tip 1) su içine. Ortamı 0,2 μm steril membran filtreden süzün. Fetal sığır serumunu (FBS) çözün ve 14 50 mL konik tüpte 10 mL alikot yapın.
  3. Ek bir 50 mL konik boru seti toplayın ve etiketleyin. Bu adımda, 3 set 14 50 mL tüp olduğundan emin olun.
  4. Orbital çalkalayıcıyı 37 °C'ye önceden ısıtın.

3. PTEC'lerin tüm böbrekten izolasyonu

  1. Steril bir teknik kullanarak, doku numunesinin bulunduğu nakliye konteynerini biyogüvenlik başlığına yerleştirin. Torbayı kutudan çıkarın ve davlumbaza koymadan önce dışına% 70 etanol püskürtün.
  2. Böbreği 15 cm'lik yuvarlak bir kültür kabına yerleştirin. Kalan ortamı aspire edin/atın.
  3. Steril tıraş bıçağı kullanarak çevredeki yağı ve böbrek kapsülünü çıkarın. Merkezde bir yarık oluşturmak için böbrek kapsülünü nazikçe çizin.
  4. Cımbız kullanarak kapsülü çıkarın ve böbreğe bağlı yağları kesmek için tıraş bıçağı kullanın. Hem kapsülü hem de yağı 15 cm'lik başka bir kültür kabına atın.
  5. Korteks (~ 1 cm kalınlığında) medulladan ayırın. Medullayı atın.
    NOT: Korteks, medullaya kıyasla daha açık kahverengimsi sarı bir renge sahiptir.
  6. Bir tıraş bıçağı kullanarak, bulamaç benzeri bir görünüm elde edene kadar dokuyu <1 cm3 parçaya bölün.
  7. Tabağa az miktarda böbrek sindirim tamponu ekleyin ve bulamacı 35 mL böbrek sindirim solüsyonu içeren ilk 50 mL tüp setine aktarın. Eşit olarak dağıtın ve her tüp için toplam 45 mL hacmi aşmayın.
  8. Tüm tüpleri 37 °C orbital çalkalayıcıya aktarın ve tüplerin düşmesine neden olmayacak en yüksek hızda 30 dakika inkübe edin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra tekrar biyogüvenlik kabinine aktarın.
  9. Karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve daha büyük doku parçalarının dibe çökmesine izin verin. Sağlam dokuyu transfer etmeden 10 mL fetal sığır serumu (FBS) içeren 50 mL'lik konik tüplere mümkün olduğunca çok çözelti aktarın. Eşit olarak dağıtın ve her tüp için toplam 45 mL hacmi aşmayın.
  10. Tüpleri 200 g'da 7 dakika santrifüjleyin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra tekrar biyogüvenlik kabinine taşıyın.
  11. Süpernatanı dikkatlice aspire edin. Her tüpe 10 mL PTEC ortamı ekleyin ve peletleri yeniden süspanse edin.
  12. Elde edilen hücre süspansiyonlarını 100 μm hücre süzgeçlerinden yeni 50 mL'lik konik tüplere süzün.
  13. Elde edilen hücre filtratlarını 400 g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra tekrar biyogüvenlik kabinine taşıyın.
  14. Peletleri 5 mL DPBS ile yıkayın. Bir p1000 ucu kullanarak peletleri yeniden askıya alın.
  15. Tüpleri 400 g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpleri %70 etanol püskürttükten sonra biyogüvenlik kabinine geri koyun, ardından süpernatanları aspire edin.
  16. Toplam üç yıkama için adım 3.15'i iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, hücre peletlerini 15 mL PTEC ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri steril hücre kültürü T-75 şişeleri üzerine yerleştirin.
  17. Şişeleri uygun şekilde etiketleyin ve hücrelerin 37 °C ve% 5 CO2'de steril bir inkübatörde büyümesine izin verin. İlk ortam değişiminden önce PTEC'lerin inkübatörde 48 saat boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verin.

4. Medya değişiklikleri

  1. Şişelerden ortamı aspire edin.
  2. Hücreleri 5 mL önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın.
  3. T-25 şişelerine 5 mL önceden ısıtılmış PTEC ortamı ekleyin.
  4. Şişeyi inkübatöre geri koyun.
  5. Şişe, geçiş veya deneylerde kullanım için en az% 70 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin.

5. PTEC'leri Geçirme

  1. Şişeden ortamı aspire edin. Her bir T-25 şişesine 5 mL önceden ısıtılmış %0,05 Tripsin-EDTA ekleyin ve tripsin sindirimine izin vermek için 37 °C'de 1 ila 2 dakika inkübe edin.
  2. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini 5 mL önceden ısıtılmış tanımlanmış tripsin inhibitörü çözeltisi ile nötralize edin.
  3. Şişeye hala bağlı olan hücreleri çıkarmak için 5 kez yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mL konik tüplere aktarın ve 5 dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı aspire edin.
    NOT: PTEC'leri dondurarak saklamak için burada durun ve bu protokole geçin.
  5. Hücre peletlerini tüp başına 14 mL PTEC ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını T-75 şişelerine aktarın (şişe başına 1 tüp).
  6. Hücreleri şişeye eşit olarak dağıtmak için bir T-shake yapın. Hücreleri izleyin ve ortamı her 48 saatte bir değiştirin.

6. Kriyoprezervasyon PTEC'ler

  1. Adım 5.6'dan sonra, hücre peletlerini her 15 mL konik tüp için 2 mL %10 DMSO ve %90 düşük glikozlu PTEC ortamında yeniden süspanse edin ve 1 mL'yi bir kriyoviyal içine aktarın.
  2. Kriyoviyalleri, sıcaklık kontrollü dondurmaya izin veren bir hücre dondurma kabına aktarın ve kabı 24 saat boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun. -80 °C'de 24 saat sonra, kriyoviyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tankına aktarın.

7. PTEC'lerin çözülmesi

  1. Şişeyi -80 °C'den 37 °C su banyosunda çözdürün. Oda sıcaklığında (RT) çözdürmeyin. Flakon kısmen çözüldükten sonra (görünür küçük bir buz parçası olmalıdır), 10 mL önceden ısıtılmış PTEC ortamı ile 15 mL'lik konik bir tüpe 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
  2. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 400 g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 5 mL önceden ısıtılmış düşük glikozlu PTEC ortamında yeniden süspanse edin.
  3. 5 mL hücre süspansiyonunu bir T-25 şişesine aktarın ve hücreleri şişe boyunca eşit olarak dağıtmak için bir T-shake gerçekleştirin. Buradan, medya değişiklikleri için bölüm 4'ü takip edin.

8. MPS cihazının Tip I Kollajen matrisi ile kaplanması

  1. PBS'yi MPS cihazından aspire edin ve cihazı paketinden çıkarın. Cihazı tıbbi mendillerle kurulayın ve istediğiniz gibi etiketleyin.
  2. MPS cihazını 15 cm'lik dairesel bir kültür kabına yerleştirin ve kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de bekletin. MPS cihazındaki nemi önlemek için tıbbi mendilleri tabağın dibinde tutun.
  3. Kollajen I enjeksiyonu için kullanılana kadar -20 ° C'de 22 G Luer-Lok iğne köreltleri takılı 1 mL şırıngaları saklayın.
  4. Doldurulması gereken her dört MPS cihazı için bir adet 15 mL'lik konik tüpü buz üzerinde tutun. Her 15 mL'lik konik tüp için iğne köreltilmiş bir 1 mL şırınga kullanın.
  5. Biyogüvenlik kabininde steril bir teknik kullanarak, MPS cihazındaki tüm bağlantı noktalarını açın. Her vidalı valfin üst kısmındaki yarıkların bağlantı noktasıyla dikey olarak hizalandığından emin olun.
  6. 1 mL'lik bir şırınga/iğne künt tertibatı kullanarak, ECM odasını 1 mL etanol ile Bağlantı Noktaları #1, #3 ve #6'ya yıkayın. Etanolü aspire edin ve tamamen buharlaşmasına izin verin (en az 30 s), böylece MPS cihazına Bağlantı Noktaları #2, #4 ve #5'ten nüfuz etmez.
  7. MPS cihazını tekrar 4 °C'ye getirin ve PTEC ortamını, M199'u ve 1 N NaOH'yi buz üzerinde tutun.
  8. Tablo 1'e göre yaklaşık dört MPS cihazı için Tip I kollajen karışımının 1 mL'si için matris bileşimini hesaplayın (gerektiği gibi ölçeklendirin). Biyogüvenlik kabininde PTEC ortamı, M199 ve 1 N NaOH'yi yukarıdaki hesaplamalara göre bu sırayla karıştırın ve tüm tüpleri buz üzerinde tutun.
  9. Tip I kollajen stoğunu 1 mL'lik bir şırınga ile önceden hazırlanmış karışıma dikkatlice ekleyin. Kollajen karışımını, karışım sabit bir somon turuncu-pembe rengine sahip olana kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
  10. Çözeltiyi altta toplamak için tüpü kısaca santrifüjleyin. Solüsyonda kabarcık olmadığından emin olun.
  11. Önceden soğutulmuş 1 mL'lik şırıngaları 22 G Luer-Lok iğne köreltleri ve MPS cihazını biyogüvenlik kabinine ve buzun üzerine yerleştirin. Önceden soğutulmuş 1 mL şırıngayı kollajen karışımıyla doldurun ve kabarcıkları tamamen önleyin.
  12. Kollajen solüsyonunu soğutulmuş cihaz odalarının #1, #3 ve #6 numaralı portlarına çok yavaş ve nazikçe enjekte edin. Hava kabarcıklarının Bağlantı Noktaları #2, #4 ve #5'ten yukarı ve dışarı akmasına izin vermek için cihazı bağlantı noktaları aşağı bakacak şekilde dikey olarak tutun.
    NOT: #2, #4 ve #5 numaralı Bağlantı Noktalarında bir damla kollajen karışımı olmalıdır, bu da odaların tamamen kaplandığını gösterir.
  13. Şırıngayı çıkarın ve buz üzerindeki 15 mL'lik tüpe geri yerleştirin. Doldurulmuş çipi kapatmak için #2, #4 ve #5 numaralı Bağlantı Noktaları için vidalı valfi çevirin ve çipi 4 dakika boyunca 30 °C'de kültür kabına yerleştirin.
  14. 30 dakika sonra, çipi çanakla birlikte steril bir şekilde biyogüvenlik kabinine aktarın ve talaşları eşit ve ayrı ayrı yayın, böylece eşit şekilde ısınırlar.
  15. Her tabağa nemli bir tıbbi mendil koyun (kollajen I matrisinin kurumasını ve MPS cihaz duvarlarından soyulmasını önlemek için) ve bulaşıkları yarı saydam esnek bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Kollajenin RT'de gece boyunca polimerize olmasına izin verin.

9. Bir MPS cihazında ECM olarak Tip IV Kollajen ile boru şeklinde bir lümen oluşturma

  1. Tüpleri ultra saf (Tip 1) su ve saf etanol ile yıkayarak C-flex borularını sterilize edin, ardından tüm boru hattını otoklavlayın.
  2. Biyogüvenlik kabininde, Tip I kollajen dolgulu MPS cihazının tüm portlarını açın (vidalı valf, portlarla birlikte dikey olacaktır) ve boru şeklindeki lümenleri oluşturmak için #1, #3 ve #6 numaralı Portlardan çıkıntı yapan kabloyu çıkarın.
  3. Metal kuplörleri #1, #3 ve #6 Bağlantı Noktalarına yerleştirin.
  4. PTEC ortamında 10 mL'lik 5 μg/mL Tip IV kollajen çözeltisi hazırlayın.
  5. 24 inç steril C-flex boruyu Bağlantı Noktaları #1, #3 ve #6'dan çıkıntı yapan metal köreltlerin üzerine yerleştirin.
  6. 22 G Luer-Lok iğne ile donatılmış 1 mL şırıngaları 0.5 mL Tip IV kollajen solüsyonu ile köreltin.
  7. Doldurulmuş şırıngayı bir şırınga infüzyon pompasına yerleştirin ve boruyu Port #1'den şırıngaya bağlayın. Bağlantı Noktaları #3 ve #6 için bu adımı tekrarlayın.
  8. Şırınga pompasını kullanarak, Tip IV kollajen solüsyonunu 30 dakika boyunca 10 μL/dk hızında MPS portlarına verin. Portlar infüze edildikten sonra, ertesi gün kullanmadan önce kollajenin gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde katılaşmasına izin verin.
    NOT: Tip IV kollajen kaplı MPS cihazları 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.

10. Bir MPS cihazında birincil PTEC'lerin tohumlanması

  1. Lümenin doğru şekilde oluştuğundan emin olmak için MPS cihazını mikroskop altında inceleyin.
  2. 22 G iğne ile önceden sterilize edilmiş 5 mL'lik bir şırıngayı 5 mL etanol içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  3. 5.1 adımlarını izleyerek bir T-25 şişesinden 15 mL'lik bir konik tüpte bir PTEC hücre peleti elde edin. 5.3'e kadar. Hücre peletine 80 μL PTEC ortamı ekleyin ve yavaşça yeniden süspanse edin.
  4. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
  5. MPS cihazını içeren kabı kuvözden çıkarın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. #2, #4 ve #5 Bağlantı Noktalarını kapatın ve vidalı valfi bağlantı noktalarına yatay olarak çevirin.
  6. Hücreleri yeniden süspanse etmek için PTEC içeren tüpü hafifçe vurun. Şırıngayı hücrelerle doldurun ve iğneyi vidalı valflerin bağlantı noktalarından en uzak olan enjeksiyon portuna yerleştirin.
  7. Hücreleri enjekte etmek için şırınganın pistonunu dikkatlice aşağı doğru bastırın. Enjeksiyondan sonra hücreleri mikroskop altında görselleştirin.
    NOT: Hücreler lümen boyunca hareket etmelidir. Lümende herhangi bir hücre gözlenmezse, iğnenin enjeksiyon portuna güvenli bir şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol edin ve gerekirse iğneyi yeniden takın. Tam bir hücre şırıngası, cihazdaki üç lümeni de doldurabilir.
  8. Diğer iki port ile hücre enjeksiyonlarına devam edin. Enjeksiyonlardan sonra #2, #4 ve #5 numaralı Bağlantı Noktalarını kapatın ve MPS cihazını tekrar 37 °C inkübatöre yerleştirin. Plakayı düz tutun, böylece hücreler yerçekimi ile lümenden dışarı çıkmaz.
  9. Ek MPS cihazları için, şırıngayı boşaltıldıktan sonra etanol ile yıkayın ve hücreleri çekmeden önce DPBS ile yıkayın.
  10. MPS cihazlarının gece boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin.
  11. Ertesi gün, MPS cihazlarını şırınga pompalarına bağlayın.
  12. Biyogüvenlik kabininde 5 mL'lik şırıngaları PTEC ortamı ile doldurun. Ardından, şırıngalara takılı 22 inçlik C-flex boru bölümü ile 24 G Luer-Lok uç köreltlerini takın.
  13. PTEC medya yüklü şırıngaları şırınga pompasına yerleştirin. Hava kabarcıklarını gidermek için çizgileri astarlayın.
  14. Doldurulmuş boru hatlarını Bağlantı Noktaları #1, #3 ve #6'ya takın ve ortam akışını sağlamak için vidalı valfleri dikey konuma çevirin.
  15. Şırınga pompası akış hızını 0,5 μL/dk'ya ayarlayın. Çanağı MPS cihazıyla birlikte 37 °C inkübatöre geri yerleştirin ve bir deneye başlamadan önce hücrelerin sürekli ortam perfüzyonu altında tübüller oluşturmasına izin verin (5 ila 7 gün içinde).

Sonuçlar

2D kültürde zaman içinde izole edilmiş primer PTEC'lerin morfolojisi ve birleşmesi
Böbrek korteksinden izolasyonun ardından, PTEC'lerin ilk ortam değişikliğinden önce en az 48 saat boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verildi. Hücrelerin kültürlenmesinden yaklaşık bir hafta sonra, kültür şişesi boyunca tek tip bir epitelyal, parke taşı benzeri morfoloji ile küçük PTEC partileri görünmelidir (Şekil 1A,B...

Tartışmalar

MPS veya çip üzerinde organ teknolojileri, insan fizyolojisinin temel yönlerini özetlemek için son derece ilgili bir in vitro platform sunar ve böylece ilaç geliştirme ve toksikolojik değerlendirmelerde hayvan modellerine olan bağımlılığı azaltır. Son zamanlarda, FDA Modernizasyon Yasası 2.0 (2022), diğer alternatiflerin yanı sıra MPS'nin Araştırma Amaçlı Yeni İlaç uygulamalarına dahil edilmesine izin vermiştir29. Bu protokol, ...

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışma ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması veya finansal açıklama yapmadıklarını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışmanın bazı bölümleri, NASA sözleşmesi 80ARC023CA001, Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), NCATS ve Uzayda Bilimin İlerlemesi Merkezi (CASIS) (UG3TR002178), Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS) (P30ES00703), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (T32GM007750), Kuzeybatı Böbrek Merkezlerinden Böbrek Araştırmalarına sınırsız bir hediye tarafından desteklenmiştir. Enstitü ve Washington Üniversitesi Eczacılık Okulu (Ji-Ping Wang Ödülü ve Bradley Bursu).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific14-959-53A
3D microphysiological DeviceNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagenase, Type IV, powderThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Defined Trypsin InhibitorThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, powderThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o GlucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidneyNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Incubating Orbital ShakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Internal Thread Cryogenic VialsCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inchesInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Small Benchtop CentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metal Coupler (blunt)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Freezing ContainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Original model discontinued 
Nunc Non-treated Flasks, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, SterileGreiner Bio-One607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")Cole-Parmer06422-00
Single edge razor blade (sterile)BiosealKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Sodium HydroxideMilliporeSigmaS8045
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermoFisher Scientific567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm VentedGenesee Scientific25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Type I collagen, rat tailCorning354236
Type IV Collagen, MouseCorning354233

Referanslar

  1. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  2. Zhang, X. et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational study. BMC Nephrol. 21, 108 (2020).
  3. Wang, K., Kestenbaum, B. Proximal tubular secretory clearance. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (8), 1291-1296 (2018).
  4. Yin, J., Wang, J. Renal drug transporters and their significance in drug-drug interactions. Acta Pharm Sin B. 6 (5), 363-373 (2016).
  5. Connor, S., Roberts, R. A., Tong, W. Drug-induced kidney injury: challenges and opportunities. Toxicol Res (Camb). 13 (4), tfae119 (2024).
  6. Meijer, T. et al. Characterization of organic anion and cation transport in three human renal proximal tubular epithelial models. Cells. 13 (12), 1008 (2024).
  7. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 97, 4-27 (2016).
  8. Miceli, C. et al. Fluid flow-induced shear stress controls the metabolism of proximal tubule kidney epithelial cells through primary cilium-dependent lipophagy and mitochondria biogenesis. Autophagy. 16 (12), 2287-2288 (2020).
  9. Tsang, Y. P., Hao, T., Mao, Q., Kelly, E. J., Unadkat, J. D. Dysregulation of the mRNA expression of human renal drug transporters by proinflammatory cytokines in primary human proximal tubular epithelial cells. Pharmaceutics. 16 (2), 285 (2024).
  10. Bajaj, P. et al. Freshly isolated primary human proximal tubule cells as an in vitro model for the detection of renal tubular toxicity. Toxicology. 442, 152535 (2020).
  11. Brown, C. D. A. et al. Characterisation of human tubular cell monolayers as a model of proximal tubular xenobiotic handling. Toxicol Appl Pharmacol. 233 (3), 428-438 (2008).
  12. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28 (10), 2432-2438 (2013).
  13. Morse, B. L. et al. Pharmacokinetics of organic cation transporter 1 (OCT1) substrates in Oct1/2 knockout mice and species difference in hepatic OCT1-mediated uptake. Drug Metab Dispos. 48 (2), 93-105 (2020).
  14. Samodelov, S. L., Kullak-Ublick, G. A., Gai, Z., Visentin, M. Organic cation transporters in human physiology, pharmacology, and toxicology. Int J Mol Sci. 21 (21), 7890 (2020).
  15. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  16. Weber, E. J. et al. Development of a microphysiological model of human kidney proximal tubule function. Kidney Int. 90 (3), 627-637 (2016).
  17. Chapron, A. et al. An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion. ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).
  18. Adler, M. et al. A quantitative approach to screen for nephrotoxic compounds in vitro. J Am Soc Nephrol. 27 (4), 1015-1028 (2016).
  19. Chang, S. et al. Human liver-kidney model elucidates the mechanisms of aristolochic acid nephrotoxicity. JCI Insight. 2 (22), e95978 (2017).
  20. Weber, E. J. et al. Human kidney on a chip assessment of polymyxin antibiotic nephrotoxicity. JCI Insight. 3 (24), e123673 (2018).
  21. Imaoka, T. et al. Bridging the gap between in silico and in vivo by modeling opioid disposition in a kidney proximal tubule microphysiological system. Sci Rep. 11 (1), 21356 (2021).
  22. Van Ness, K. P., Chang, S., Weber, E. J., Zumpano, D., Eaton, D. L., Kelly, E. J. Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity. Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).
  23. Lidberg, K. A. et al. Serum protein exposure activates a core regulatory program driving human proximal tubule injury. J Am Soc Nephrol. 33 (5), 949-965 (2022).
  24. Sakolish, C. et al. Technology transfer of the microphysiological systems: a case study of the human proximal tubule tissue chip. Sci Rep. 8 (1), 14882 (2018).
  25. Hart, A. et al. Identification of prognostic biomarkers for antibiotic associated nephrotoxicity in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 23 (2), 293-299 (2024).
  26. Lidberg, K. A. et al. Antisense oligonucleotide development for the selective modulation of CYP3A5 in renal disease. Sci Rep. 11 (1), 4722 (2021).
  27. Imaoka, T. et al. Microphysiological system modeling of ochratoxin A-associated nephrotoxicity. Toxicology. 444, 152582 (2020).
  28. Chapron, B. D. et al. Reevaluating the role of megalin in renal vitamin D homeostasis using a human cellderived microphysiological system. ALTEX. 35 (4), 504-515 (2018).
  29. Adashi, E. Y., O'Mahony, D. P., Cohen, I. G. The FDA modernization act 2.0: drug testing in animals is rendered optional. Am J Med. 136 (9), 853-854 (2023).
  30. Qi, W., Johnson, D. W., Vesey, D. A., Pollock, C. A., Chen, X. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (methods in renal research). Nephrology. 12 (2), 155-159 (2007).
  31. Mihevc, M., Petreski, T., Maver, U., Bevc, S. Renal proximal tubular epithelial cells: review of isolation, characterization, and culturing techniques. Mol Biol Rep. 47 (12), 9865-9882 (2020).
  32. Shaver, C. M. et al. Cellfree hemoglobin augments acute kidney injury during experimental sepsis. Am J Physiol Renal Physiol. 317 (4), F922-F929 (2019).
  33. Sbarbati, R. Separation of human endothelial cells from fibroblasts by centrifugation in Percoll gradients. Biosci Rep. 5 (6), 469-472 (1985).
  34. Horn, P. et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 10 (7), 676-685 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır