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Neste Artigo

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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Apresentamos um protocolo otimizado para o processamento de rins humanos inteiros para isolar e cultivar células epiteliais primárias do túbulo proximal renal e a aplicação dessas células em uma plataforma microfluídica tridimensional e microfisiológica para recapitular o túbulo proximal renal.

Resumo

A doença renal afeta mais de 850 milhões de pessoas em todo o mundo, incluindo 37 milhões de americanos. Os fatores de risco para doença renal crônica incluem influências ambientais, predisposições genéticas, condições médicas coexistentes e história de lesão renal aguda. Esses fatores geralmente levam meses ou anos para se desenvolver, complicando os estudos longitudinais de etiologia e fisiopatologia da doença. Modelos renais avançados são necessários para melhorar nossa compreensão dos mecanismos da doença e melhorar a previsão de nefrotoxicidade no desenvolvimento de medicamentos. As células epiteliais do túbulo proximal (PTECs) no rim desempenham um papel crítico na depuração de xenobióticos e toxinas, bem como na reabsorção de nutrientes essenciais. Demonstramos anteriormente que plataformas de sistema microfisiológico (MPS) tridimensionais (3D), preenchidas com PTECs primários isolados, podem ser usadas para investigar interações medicamentosas renais, avaliar a nefrotoxicidade de compostos e prever a depuração de medicamentos. Aqui, apresentamos protocolos para isolar e cultivar PTECs primários de rins humanos inteiros e para semeá-los em uma plataforma MPS 3D que imita a fisiologia renal in vivo . Este protocolo permite estudos de longo prazo que apoiam a viabilidade do PTEC, morfologia fisiológica e polarização funcional das principais proteínas transportadoras em dispositivos MPS por até 6 meses.

Introdução

O rim desempenha um papel crítico na depuração e eliminação de uma ampla gama de xenobióticos, toxinas e compostos endógenos do corpo. Isso é conseguido filtrando o sangue para remover resíduos e regulando o equilíbrio eletrolítico, os níveis de fluidos e o pH. Cada rim humano contém cerca de um milhão de néfrons, as unidades estruturais e funcionais do rim1. Dentro desses néfrons, células epiteliais especializadas nos túbulos proximais, conhecidas como células epiteliais do túbulo proximal (PTECs), são responsáveis pela reabsorção de moléculas essenciais, como glicose, aminoácidos e íons, bem como pela secreção de substratos de drogas e substâncias potencialmente tóxicas na urina 2,3,4. Em alguns casos, os PTECs também podem reabsorver compostos da urina de volta para a corrente sanguínea4. Devido ao seu papel crítico nas interações medicamentosas e toxinas, os PTECs primários isolados de rins humanos fornecem uma ferramenta valiosa para estudar as interações medicamentosas renais (DDIs) e avaliar a nefrotoxicidade dos compostos.

A nefrotoxicidade induzida por drogas representa um desafio clínico significativo, pois pode levar a lesão renal aguda e doença renal crônica5. Portanto, uma compreensão mais profunda da fisiologia do túbulo proximal renal é essencial para prever e caracterizar com precisão o potencial nefrotóxico de drogas e toxinas. Modelos in vitro tradicionais, incluindo linhagens de células renais imortalizadas (por exemplo, RPTEC-TERT1, HK-2), têm limitações em mimetizar a estrutura complexa e a função dos túbulos proximais humanos6, que operam sob fluxo laminar dinâmico (com baixo número de Reynolds) e uma matriz extracelular (MEC) uniforme in vivo 7,8. Além disso, os modelos bidimensionais (2D) tradicionais muitas vezes falham em expressar funcionalmente os principais transportadores renais (por exemplo, transportador de ânions orgânicos 1 e 3 (OAT1 e OAT3), transportador de cátions orgânicos 2 (OCT2)) devido à rápida degradação e internalização dessas proteínas 6,9,10,11 . Os modelos animais, embora informativos, podem não replicar totalmente a fisiologia renal humana e muitas vezes carecem de traduzibilidade devido às diferenças de espécies na expressão e atividade do transportador12. Por exemplo, mOct1 é expresso basolateralmente em PTECs de camundongos, enquanto em humanos, a expressão da proteína de membrana de OCT1 no rim é indetectável 13,14.

Os avanços nos sistemas microfisiológicos (MPS) e nas tecnologias de órgãos em um chip permitiram que os pesquisadores desenvolvessem modelos in vitro que imitam de perto a arquitetura tridimensional (3D) e as condições dinâmicas de fluxo de fluidos dos órgãos humanos15. Nosso grupo caracterizou anteriormente dois modelos de MPS com PTECs16,17 e utilizou esses modelos para conduzir estudos de toxicidade 18,19,20 e prever a disposição do medicamentocom precisão 21. O uso de PTECs primários nesses modelos oferece vantagens significativas devido à sua capacidade de reter características funcionais observadas in vivo.

Aqui, apresentamos os protocolos para o isolamento de PTECs humanos de um rim humano intacto obtido de um doador falecido por meio de uma organização de aquisição de órgãos aprovada pela United Network for Organ Sharing (UNOS) e aplicando esses PTECs humanos cultivados em uma plataforma MPS.

Protocolo

Todo o trabalho foi conduzido em conformidade com as diretrizes de manuseio de tecidos humanos da Universidade de Washington. Os doadores adequados atendem aos seguintes requisitos: menos de 36 h de tempo isquêmico frio (CIT), sem histórico conhecido de doenças renais, diálise ou quaisquer outras condições médicas (por exemplo, diabetes mellitus tipo 1 ou 2, hepatite B, hepatite C, vírus da imunodeficiência humana (HIV), meningite viral/bacteriana, infecção por Staphylococcus aureus resistente à meticilina, sífilis, sepse ou Covid-19). Todos os rins humanos usados neste estudo foram obtidos por meio de um OPO aprovado pela UNOS.

1. Preparação do gabinete de biossegurança

  1. Pulverize o capô com etanol a 70%. Descontamine todas as superfícies e itens dentro do gabinete para criar um ambiente estéril.
  2. Coloque almofadas absorventes azuis. Execute todo o trabalho de tecido sobre essas almofadas.
  3. Certifique-se de que o equipamento necessário esteja disponível na cabine de biossegurança e devidamente esterilizado (lâminas de barbear, pontas de pipeta sorológica, pistola de pipeta sorológica, filtros de células de 100 μm, ponteiras p1000, micropipeta de 1000 μL, placas de cultura circulares de 15 cm e tubos cônicos).

2. Preparação de pré-processamento renal

  1. Prepare a solução de digestão renal adicionando 0,75 mg / mL de colagenase IV + 0,75 mg / mL de dispase II na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) com cálcio e magnésio. Filtrar a solução através de um filtro de membrana estéril de 0,2 μm.
    NOTA: Para um rim adulto humano inteiro, são necessários aproximadamente 14 tubos cônicos de 50 mL, cada um contendo ~ 35 mL de solução de digestão (totalizando 500 mL).
  2. Prepare o meio PTEC adicionando 4,425 g de meio de Eagle modificado (DMEM) / F12 pó de Dulbecco sem glicose, 0,5 g de pó de D-glicose, 0,6 g de pó de bicarbonato de sódio, 5 mL de suplemento de insulina-transferrina-selênio 100x (contendo 1000 mg / L de insulina, 550 mg / L de transferrina e 0,67 mg / L de selenito de sódio), 0,5 mL de 50 μM de hidrocortisona e 5 mL de solução antibiótica-antimicótica 100x (contendo 10000 unidades / mL de penicilina G de sódio, 10000 μg/mL de sulfato de estreptomicina e 25 μg/mL de anfotericina B em solução salina a 0,85%) em 500 mL de água ultrapura autoclavada estéril (Tipo 1). Filtrar o meio através de um filtro de membrana estéril de 0,2 μm. Descongele o soro fetal bovino (FBS) e faça alíquotas de 10 mL em 14 tubos cônicos de 50 mL.
  3. Reúna e rotule um conjunto adicional de tubos cônicos de 50 mL. Nesta etapa, certifique-se de que haja 3 conjuntos de 14 tubos de 50 mL.
  4. Pré-aqueça o agitador orbital a 37 °C.

3. Isolamento de PTECs de todo o rim

  1. Usando uma técnica estéril, coloque o contêiner de transporte com a amostra de tecido na capa de biossegurança. Retire o saco da caixa e borrife a parte externa com etanol 70% antes de colocá-lo no capô.
  2. Coloque o rim em uma placa de cultura redonda de 15 cm. Aspirar/Descartar a mídia restante.
  3. Remova a gordura circundante e a cápsula renal usando lâminas de barbear estéreis. Marque suavemente a cápsula renal para criar uma fenda no centro.
  4. Usando uma pinça, retire a cápsula e use lâminas de barbear para cortar qualquer gordura presa ao rim. Rejeitar a cápsula e a gordura noutra placa de cultura de 15 cm.
  5. Separe o córtex (~ 1 cm de espessura) da medula. Descarte a medula.
    NOTA: O córtex tem uma cor amarelo-acastanhada mais clara em comparação com a medula.
  6. Usando uma lâmina de barbear, pique o tecido em <1 cm3 pedaços até obter uma aparência de pasta.
  7. Adicione uma pequena quantidade de tampão de digestão renal no prato e transfira a pasta para o primeiro conjunto de tubos de 50 mL contendo 35 mL da solução de digestão renal. Distribua uniformemente e não exceda um volume total de 45 mL para cada tubo.
  8. Transfira todos os tubos para o agitador orbital a 37 °C e incube por 30 min na velocidade mais alta que não cause a queda dos tubos. Transfira os tubos de volta para o gabinete de biossegurança após pulverizá-los com etanol 70%.
  9. Inverta os tubos para misturar e permitir que os pedaços maiores de tecido se depositem no fundo. Transfira o máximo possível da solução para os tubos cônicos de 50 mL contendo 10 mL de soro fetal bovino (FBS) sem transferir tecido intacto. Distribua uniformemente e não exceda um volume total de 45 mL para cada tubo.
  10. Centrifugar os tubos a 200 g durante 7 min. Mova os tubos de volta para o gabinete de biossegurança depois de pulverizá-los com etanol a 70%.
  11. Aspire cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 10 mL de meio PTEC em cada tubo e ressuspenda os pellets.
  12. Coe as suspensões celulares resultantes através de filtros celulares de 100 μm em novos tubos cônicos de 50 mL.
  13. Centrifugue os filtrados celulares resultantes a 400 g por 5 min. Mova os tubos de volta para o gabinete de biossegurança depois de pulverizá-los com etanol a 70%.
  14. Lave os pellets com 5 mL de DPBS. Ressuspenda os pellets usando uma ponta p1000.
  15. Centrifugar os tubos a 400 g durante 5 min. Mova os tubos de volta para o gabinete de biossegurança depois de pulverizá-los com etanol a 70% e, em seguida, aspire os sobrenadantes.
  16. Repita a etapa 3.15 mais duas vezes para um total de três lavagens. Em seguida, ressuspenda os grânulos celulares com 15 ml de meio PTEC e coloque as células em frascos estéreis de cultura de células T-75.
  17. Rotular os frascos adequadamente e deixar as células crescerem numa incubadora estéril a 37 °C e 5% de CO2. Permita que os PTECs cresçam sem perturbações na incubadora por 48 h antes da primeira troca de meio.

4. Mudanças de mídia

  1. Aspirar os meios dos frascos.
  2. Lave as células com 5 mL de DPBS pré-aquecido.
  3. Adicionar 5 ml de meio PTEC pré-aquecido aos balões T-25.
  4. Retorne o frasco à incubadora.
  5. Mudar o meio de 48 em 48 h até que o balão atinja pelo menos 70% de confluência para passagem ou utilização em experiências.

5. PTECs de passagem

  1. Aspirar o meio do balão. Adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% pré-aquecido em cada frasco T-25 e incube a 37 ° C por 1 a 2 min para permitir a digestão da tripsina.
  2. Uma vez que as células são destacadas, neutralize a tripsina com 5 mL de solução inibidora de tripsina definida pré-aquecida.
  3. Ressuspenda 5 vezes para desalojar quaisquer células ainda presas ao frasco. Em seguida, transfira a suspensão da célula para tubos cônicos de 15 mL e centrifugue a 400 g por 5 min.
  4. Aspire o sobrenadante.
    NOTA: Pare aqui para criopreservar PTECs e mude para esse protocolo.
  5. Ressuspenda os grânulos celulares com 14 mL de meio PTEC por tubo. Transferir as suspensões celulares para balões T-75 (1 tubo por balão).
  6. Execute um T-shake para distribuir as células uniformemente pelo balão. Monitore as células e troque a mídia a cada 48 h.

6. PTECs de criopreservação

  1. Após a etapa 5.6., ressuspenda os grânulos celulares em 2 mL de meio PTEC com 10% de DMSO e 90% de baixa glicose para cada tubo cônico de 15 mL e transfira 1 mL para um criovial.
  2. Transfira os criogenianos para um recipiente de congelamento de células que permita o congelamento com temperatura controlada e coloque o recipiente em um freezer a -80 °C por 24 h. Após 24 h a -80 °C, transferir os criogenianos para um tanque de azoto líquido para armazenamento a longo prazo.

7. Descongelamento de PTECs

  1. Descongelar o frasco a -80 °C em banho-maria a 37 °C. Não descongele à temperatura ambiente (RT). Uma vez que o frasco tenha sido parcialmente descongelado (deve haver um pequeno pedaço de gelo visível), adicione 1 mL de suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL com 10 mL de meio PTEC pré-aquecido.
  2. Gire a suspensão celular a 400 g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 mL de meio PTEC pré-aquecido com baixo teor de glicose.
  3. Transfira a suspensão de células de 5 ml para um balão T-25 e execute um T-shake para distribuir as células uniformemente pelo frasco. A partir daqui, siga a seção 4 para alterações de mídia.

8. Revestindo o dispositivo MPS com matriz de colágeno tipo I

  1. Aspire o PBS do dispositivo MPS e remova o dispositivo da embalagem. Seque o dispositivo com lenços umedecidos e etiquete-o conforme desejado.
  2. Coloque o dispositivo MPS em uma placa de cultura circular de 15 cm e coloque-o a 4 °C até que esteja pronto para uso. Mantenha lenços umedecidos no fundo do prato para evitar umidade no dispositivo MPS.
  3. Manter seringas de 1 ml com agulhas Luer-Lok de 22 G fixadas a -20 °C até à utilização para injeção de colagénio I.
  4. Para cada quatro dispositivos MPS que precisam ser preenchidos, mantenha um tubo cônico de 15 mL no gelo. Use uma seringa de 1 mL com a agulha sem corte acoplada para cada tubo cônico de 15 mL.
  5. Usando uma técnica estéril em um gabinete de biossegurança, abra todas as portas do dispositivo MPS. Certifique-se de que as fendas na parte superior de cada válvula de parafuso estejam alinhadas verticalmente com a porta.
  6. Usando um conjunto rombo de seringa/agulha de 1 mL, lave a câmara ECM com 1 mL de etanol nas portas #1, #3 e #6. Aspire o etanol e deixe-o evaporar completamente (pelo menos 30 s) para que não penetre no dispositivo MPS das portas #2, #4 e #5.
  7. Coloque o dispositivo MPS de volta a 4 °C e mantenha o meio PTEC, M199 e 1 N NaOH no gelo.
  8. Calcule a composição da matriz para 1 mL da mistura de colágeno Tipo I para aproximadamente quatro dispositivos MPS de acordo com a Tabela 1 (escala conforme necessário). No gabinete de biossegurança, misture o meio PTEC, M199 e 1 N NaOH nesta ordem, de acordo com os cálculos acima, e mantenha todos os tubos no gelo.
  9. Adicione cuidadosamente o estoque de colágeno Tipo I com uma seringa de 1 mL à mistura pré-fabricada. Misture a mistura de colágeno pipetando para cima e para baixo até que a mistura tenha uma cor laranja-rosa salmão estável.
  10. Centrifugue brevemente o tubo para coletar a solução na parte inferior. Certifique-se de que não haja bolhas na solução.
  11. Coloque as seringas pré-resfriadas de 1 mL com agulhas Luer-Lok de 22 G e o dispositivo MPS na cabine de biossegurança e no gelo. Encha a seringa pré-resfriada de 1 mL com a mistura de colágeno e evite bolhas completamente.
  12. Muito lenta e suavemente injete a solução de colágeno nas portas # 1, # 3 e # 6 das câmaras do dispositivo resfriado. Segure o dispositivo verticalmente com as portas voltadas para baixo para permitir que as bolhas de ar fluam para cima e para fora das portas #2, #4 e #5.
    NOTA: Deve haver uma gota da mistura de colágeno nas portas # 2, # 4 e # 5, o que indica que as câmaras estão totalmente revestidas.
  13. Retire a seringa e volte a colocá-la no tubo de 15 ml sobre gelo. Gire a válvula de parafuso para as portas #2, #4 e #5 para selar o cavaco cheio e coloque o cavaco na placa de cultura a 4 °C por 30 min.
  14. Após 30 min, transfira o chip com o prato para o armário de biossegurança de maneira estéril e espalhe os chips de maneira uniforme e individual para que aqueçam uniformemente.
  15. Coloque um lenço umedecido em cada prato (para evitar que a matriz de colágeno I seque e descasque das paredes do dispositivo MPS) e sele os pratos com um filme de vedação flexível semitransparente. Deixe o colágeno polimerizar durante a noite em RT.

9. Criando um lúmen tubular com colágeno tipo IV como ECM em um dispositivo MPS

  1. Esterilize a tubulação C-flex lavando os tubos com água ultrapura (Tipo 1) e etanol puro e, em seguida, autoclave toda a linha de tubos.
  2. No gabinete de biossegurança, abra todas as portas do dispositivo MPS preenchido com colágeno Tipo I (a válvula de parafuso ficará vertical com as portas) e remova o fio que se projeta das portas #1, #3 e #6 para formar os lúmens tubulares.
  3. Insira os acopladores de metal nas portas #1, #3 e #6.
  4. Prepare uma solução de 10 ml de 5 μg/ml de colagénio tipo IV em meio PTEC.
  5. Insira 24 polegadas de tubo C-flex estéril nos blunts de metal que se projetam das portas #1, #3 e #6.
  6. Encha as seringas de 1 mL equipadas com uma agulha Luer-Lok 22-G sem corte com 0,5 mL de solução de colágeno tipo IV.
  7. Coloque a seringa cheia em uma bomba de infusão de seringa e conecte a tubulação da porta #1 à seringa. Repita esta etapa para as portas #3 e #6.
  8. Usando a bomba de seringa, administre a solução de colágeno Tipo IV nas portas MPS a uma taxa de 10 μL/min por 30 min. Uma vez que as portas tenham sido infundidas, deixe o colágeno solidificar em uma incubadora a 37 ° C durante a noite antes de usá-los no dia seguinte.
    NOTA: Os dispositivos MPS revestidos com colágeno tipo IV podem ser armazenados por até 1 semana a 4 °C.

10. Semeando PTECs primários em um dispositivo MPS

  1. Inspecione o dispositivo MPS sob o microscópio para garantir que o lúmen se formou corretamente.
  2. Coloque uma seringa pré-esterilizada de 5 mL com uma agulha de 22 G em um tubo de 15 mL contendo 5 mL de etanol.
  3. Obtenha um pellet de célula PTEC em um tubo cônico de 15 mL de um frasco T-25 seguindo as etapas 5.1. para 5.3. Adicione 80 μL de meio PTEC ao pellet celular e ressuspenda suavemente.
  4. Transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mL.
  5. Retire o prato que contém o dispositivo MPS da incubadora e coloque-o no gabinete de biossegurança. Feche as portas #2, #4 e #5 e gire a válvula de parafuso horizontalmente para as portas.
  6. Agite suavemente o tubo contendo PTEC para ressuspender as células. Encha a seringa com células e insira a agulha na porta de injeção mais distante das portas das válvulas de parafuso.
  7. Empurre cuidadosamente o êmbolo da seringa para injetar as células. Visualize as células após a injeção ao microscópio.
    NOTA: As células devem estar se movendo através do lúmen. Se nenhuma célula for observada no lúmen, verifique se a agulha foi inserida com segurança na porta de injeção e reinsira a agulha, se necessário. Uma seringa cheia de células pode preencher todos os três lúmens do dispositivo.
  8. Continue as injeções de células com as outras duas portas. Após as injeções, feche as portas #2, #4 e #5 e coloque o dispositivo MPS de volta na incubadora a 37 °C. Mantenha a placa nivelada para que as células não saiam do lúmen por gravidade.
  9. Para dispositivos MPS adicionais, lave a seringa com etanol após o esvaziamento e lave com DPBS antes de aspirar as células.
  10. Permita que os dispositivos MPS permaneçam durante a noite sem serem perturbados.
  11. No dia seguinte, conecte os dispositivos MPS às bombas de seringa.
  12. Na cabine de biossegurança, encha as seringas de 5 mL com meio PTEC. Em seguida, encaixe os blunts de ponta Luer-Lok de 22 G com a seção de 24 polegadas do tubo C-flex preso às seringas.
  13. Coloque as seringas carregadas com meio PTEC na bomba de seringa. Prepare as linhas para remover quaisquer bolhas de ar.
  14. Conecte as linhas de tubulação preparadas às portas #1, #3 e #6 e gire as válvulas de parafuso para a posição vertical para introduzir o fluxo de mídia.
  15. Defina a taxa de fluxo da bomba de seringa em 0.5 μL/min. Colocar a placa com o dispositivo MPS de volta na incubadora a 37 °C e deixar as células formarem túbulos (dentro de 5 a 7 dias) sob perfusão contínua do meio antes de iniciar uma experiência.

Resultados

Morfologia e confluência de PTECs primários isolados ao longo do tempo em cultura 2D
Após o isolamento do córtex renal, os PTECs cresceram sem perturbações por pelo menos 48 h antes da primeira mudança de meio. Aproximadamente uma semana após a cultura das células, pequenos lotes de PTECs devem aparecer em todo o frasco de cultura com uma morfologia epitelial uniforme, semelhante a paralelepípedos (Figura 1A, B)...

Discussão

MPS, ou tecnologias organ-on-a-chip, oferecem uma plataforma in vitro altamente relevante para recapitular aspectos-chave da fisiologia humana, reduzindo assim a dependência de modelos animais no desenvolvimento de medicamentos e avaliações toxicológicas. Recentemente, a Lei de Modernização 2.0 da FDA (2022) permitiu a inclusão de MPS, entre outras alternativas, em aplicações de Novos Medicamentos Investigacionais29. Este protocolo detalha um pro...

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse ou divulgações financeiras relevantes para este estudo.

Agradecimentos

Partes deste trabalho foram apoiadas pelo contrato da NASA 80ARC023CA001, o Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), em conjunto pelo NCATS e o Centro para o Avanço da Ciência no Espaço (CASIS) (UG3TR002178), o Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (NIEHS) (P30ES00703), o Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (T32GM007750), um presente irrestrito dos Centros Renais do Noroeste para a Pesquisa Renal e a Escola de Farmácia da Universidade de Washington (Prêmio Ji-Ping Wang e Bradley Fellowship).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific14-959-53A
3D microphysiological DeviceNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagenase, Type IV, powderThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Defined Trypsin InhibitorThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, powderThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o GlucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidneyNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Incubating Orbital ShakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Internal Thread Cryogenic VialsCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inchesInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Small Benchtop CentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metal Coupler (blunt)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Freezing ContainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Original model discontinued 
Nunc Non-treated Flasks, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, SterileGreiner Bio-One607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")Cole-Parmer06422-00
Single edge razor blade (sterile)BiosealKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Sodium HydroxideMilliporeSigmaS8045
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermoFisher Scientific567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm VentedGenesee Scientific25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Type I collagen, rat tailCorning354236
Type IV Collagen, MouseCorning354233

Referências

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