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要約

私たちは、ヒト腎臓全体を処理して一次腎近位尿細管上皮細胞を単離および培養するための最適化されたプロトコルと、これらの細胞を3次元、マイクロ流体、微生理学的プラットフォームで適用して腎近位尿細管を再現するためのプロトコールを提示します。

要約

腎臓病は、3,700万人のアメリカ人を含む、世界中で8億5,000万人以上が罹患しています。慢性腎臓病の危険因子には、環境の影響、遺伝的素因、併存する病状、急性腎障害の病歴などがあります。これらの要因は、多くの場合、発症するのに数か月または数年かかるため、疾患の病因と病態生理学の縦断的研究が複雑になります。医薬品開発における疾患メカニズムの理解を深め、腎毒性予測を強化するためには、高度な腎臓モデルが必要です。腎臓の近位尿細管上皮細胞(PTEC)は、生体異物や毒素のクリアランス、および必須栄養素の再吸収に重要な役割を果たします。私たちはこれまでに、単離された一次PTECを装着した3次元(3D)微小生理学的システム(MPS)プラットフォームを使用して、腎薬物相互作用の調査、化合物の腎毒性の評価、および薬物クリアランスの予測に使用できることを実証しました。ここでは、ヒトの腎臓全体から一次PTECを単離および培養し、 in vivo 腎生理学を模倣した3D MPSプラットフォームに播種するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルにより、PTECの生存率、生理学的形態、およびMPSデバイスにおける主要なトランスポータータンパク質の機能的分極を最大6ヶ月間サポートする長期研究が可能になります。

概要

腎臓は、さまざまな生体異物、毒素、および内因性化合物を体から除去および排除する上で重要な役割を果たします。これは、血液をろ過して老廃物を除去し、電解質のバランス、体液レベル、pHを調節することによって達成されます。各ヒト腎臓には、腎臓の構造的および機能的単位である約100万個のネフロンが含まれています1。これらのネフロン内では、近位尿細管上皮細胞(PTEC)として知られる近位尿細管の特殊な上皮細胞が、グルコース、アミノ酸、イオンなどの必須分子を再吸収するだけでなく、薬物基質や潜在的に有毒な物質を尿中に分泌する役割を担っています2,3,4。場合によっては、PTECは尿から化合物を再吸収して血流に戻すこともあります4。ヒトの腎臓から単離された一次PTECは、薬物と毒素の相互作用に重要な役割を果たすため、腎臓の薬物間相互作用(DDI)を研究し、化合物の腎毒性を評価するための貴重なツールを提供します。

薬物誘発性腎毒性は、急性腎障害や慢性腎臓病5につながる可能性があるため、重大な臨床的課題をもたらします。したがって、薬物や毒素の腎毒性の可能性を正確に予測し、特徴付けるためには、腎臓近位尿細管の生理学をより深く理解することが不可欠です。不死化腎細胞株(RPTEC-TERT1、HK-2など)を含む従来のin vitroモデルでは、動的な層流(低レイノルズ数)とin vivoで均一な細胞外マトリックス(ECM)の下で作動するヒト近位尿細管6の複雑な構造と機能を模倣することに限界があります7,8.さらに、従来の二次元(2D)モデルは、これらのタンパク質の急速な分解と内部化のために、主要な腎トランスポーター(例えば、有機陰イオントランスポーター1および3(OAT1およびOAT3)、有機カチオントランスポーター2(OCT2))を機能的に発現できないことがよくあります6,9,10,11.動物モデルは、有益ではあるが、ヒトの腎臓生理機能を完全に再現するわけではなく、トランスポーターの発現と活性の種差により翻訳性を欠くことが多い12。例えば、mOct1はマウスPTECでは基底外側に発現しているが、ヒトでは腎臓でのOCT1の膜タンパク質発現は検出できない13,14。

微小生理学的システム(MPS)と臓器チップ技術の進歩により、研究者は、ヒトの臓器の3次元(3D)構造と動的な流体流条件を厳密に模倣したin vitroモデルを開発することが可能になった15。私たちのグループは、以前にPTEC16、17で2つのMPSモデルを特徴付け、これらのモデルを利用して毒性試験18、19、20を実施し、薬物動態を正確に予測しました21。これらのモデルで一次PTECを使用すると、in vivoで観察された機能特性を保持できるため、大きな利点があります。

ここでは、United Network for Organ Sharing(UNOS)が承認した臓器調達組織を介して死亡したドナーから入手した無傷のヒト腎臓からヒトPTECを分離し、これらの培養ヒトPTECをMPSプラットフォーム内で適用するためのプロトコルを紹介します。

プロトコル

すべての作業は、ワシントン大学のヒト組織の取り扱いガイドラインに準拠して行われました。適切なドナーは、次の要件を満たしています: 寒冷虚血時間 (CIT) が 36 時間未満であること、腎臓病、透析、またはその他の病状 (例: 1 型または 2 型糖尿病、B 型肝炎、C 型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス (HIV)、ウイルス性/細菌性髄膜炎、メチシリン耐性 黄色ブドウ球 菌感染症、梅毒、敗血症、または Covid-19)。この研究で使用された全ヒト腎臓は、UNOSが承認したOPOを通じて供給されました。

1.バイオセーフティキャビネットの準備

  1. フードに70%エタノールをスプレーします。キャビネット内のすべての表面とアイテムを除染して、無菌環境を作り出します。
  2. 青い吸収パッドを置きます。これらのパッドですべての組織作業を行います。
  3. 必要な機器がバイオセーフティキャビネットに用意されており、適切に滅菌されていることを確認してください(カミソリの刃、血清ピペットチップ、血清ピペットガン、100 μmセルストレーナー、p1000チップ、1000 μLマイクロピペット、15 cm円形培養皿、コニカルチューブ)。

2.腎臓の前処理の準備

  1. カルシウムとマグネシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に0.75 mg/mLコラゲナーゼIV + 0.75 mg/mLディスパーゼIIを加えて、腎臓消化液を調製します。0.2 μmの滅菌メンブレンフィルターで溶液をろ過します。
    注:ヒトの成人腎臓全体には、約14本の50 mLコニカルチューブが必要で、それぞれに~35 mLの消化液(合計500 mL)が含まれています。.
  2. 4.425 gのダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)/ F12粉末(グルコースなし)、0.5 gのD-グルコース粉末、0.6 gの重炭酸ナトリウム粉末、5 mLの100xインスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント(1000 mg / Lインスリン、550 mg / Lトランスフェリン、および0.67 mg / Lの亜セレン酸ナトリウムを含む)、0.5 mLの50 μMヒドロコルチゾン、および5 mLの100x抗生物質-抗真菌溶液(10000ユニット/ mLのペニシリンGナトリウム、 10000 μg/mL 硫酸ストレプトマイシン、および 25 μg/mL アムホテリシン B 0.85% 生理食塩水溶液)を 500 mL の滅菌オートクレーブ滅菌超純水(タイプ 1)に入れます。0.2 μmの滅菌メンブレンフィルターで培地をろ過します。ウシ胎児血清(FBS)を解凍し、14本の50mLコニカルチューブで10mLのアリコートを作ります。
  3. 追加の50 mLコニカルチューブのセットを集めて標識します。このステップでは、50 mLチューブが14本3セットあることを確認します。
  4. オービタルシェーカーを37°Cに予温します。

3. 腎臓全体からのPTECの分離

  1. 滅菌技術を使用して、組織サンプルを入れた輸送用コンテナをバイオセーフティフードに入れます。バッグを箱から取り出し、フードに入れる前に外側に70%エタノールをスプレーします。
  2. 腎臓を丸い15cmの培養皿に置きます。残りのメディアを吸引/廃棄します。
  3. 滅菌カミソリの刃を使用して、周囲の脂肪と腎カプセルを取り除きます。腎臓カプセルにそっと切り込みを入れて、中央にスリットを作ります。
  4. ピンセットを使用してカプセルを引き抜き、かみそりの刃を使用して腎臓に付着した脂肪を切り取ります。カプセルと脂肪の両方を別の15cmの培養皿に捨てます。
  5. 皮質(厚さ~1cm)を髄質から分離します。髄質を捨てます。
    注:皮質は、髄質に比べて明るい茶色がかった黄色をしています。
  6. カミソリの刃を使用して、組織を<1 cm3 ピースにスラリー状になるまでミンチにします。
  7. 少量の腎臓消化緩衝液を皿に加え、35 mLの腎臓消化液を含む50 mLチューブの最初のセットにスラリーを移します。均等に分配し、各チューブの総容量が45 mLを超えないようにします。
  8. すべてのチューブを37°Cのオービタルシェーカーに移し、チューブが脱落しない最高速度で30分間インキュベートします。チューブに70%エタノールを噴霧した後、チューブをバイオセーフティキャビネットに戻します。
  9. チューブを反転させて混合し、大きな組織片が底に沈殿するのを待ちます。無傷の組織を移さずに、10 mLのウシ胎児血清(FBS)が入った50 mLのコニカルチューブにできるだけ多くの溶液を移します。均等に分配し、各チューブの総容量が45 mLを超えないようにします。
  10. チューブを200gで7分間遠心分離します。チューブに70%エタノールを噴霧した後、チューブをバイオセーフティキャビネットに戻します。
  11. 上澄みを慎重に吸引します。各チューブに10 mLのPTEC培地を加え、ペレットを再懸濁します。
  12. 得られた細胞懸濁液を100 μmの細胞ストレーナーで新しい50 mLコニカルチューブに濾します。
  13. 得られた細胞濾液を400gで5分間遠心分離します。チューブに70%エタノールを噴霧した後、チューブをバイオセーフティキャビネットに戻します。
  14. ペレットを5mLのDPBSで洗浄します。p1000チップを使用してペレットを再懸濁します。
  15. チューブを400gで5分間遠心分離します。70%エタノールを噴霧した後、チューブをバイオセーフティキャビネットに戻し、上清を吸引します。
  16. 手順3.15をさらに2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。次に、細胞ペレットを15 mLのPTEC培地で再懸濁し、無菌細胞培養T-75フラスコに細胞をプレートします。
  17. フラスコに適切に標識し、細胞を37°Cおよび5%CO2の滅菌インキュベーターで増殖させます。PTECがインキュベーター内で48時間乱されずに成長するのを待ってから、最初の培地交換を行います。

4. メディアの変更

  1. フラスコからメディアを吸引します。
  2. 予熱したDPBS5 mLで細胞を洗浄します。
  3. 予熱したPTEC培地5mLをT-25フラスコに加えます。
  4. フラスコをインキュベーターに戻します。
  5. フラスコが少なくとも70%のコンフルエント度に達するまで、48時間ごとに培地を交換してください。

5. PTECの継代

  1. フラスコからメディアを吸引します。予め温めた0.05%トリプシン-EDTAを5 mLを各T-25フラスコに加え、トリプシン消化を可能にするために37°Cで1〜2分間インキュベートします。
  2. 細胞が剥離したら、予め温めた定義済みトリプシン阻害剤溶液5mLでトリプシンを中和します。
  3. フラスコに付着したままの細胞を取り除くために、5回再懸濁します。次に、細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、400 g で5分間遠心分離します。
  4. 上清を吸引します。
    注:ここでPTECを凍結保存し、そのプロトコルに移行してください。
  5. 細胞ペレットをチューブあたり14 mLのPTEC培地で再懸濁します。細胞懸濁液をT-75フラスコ(フラスコあたり1チューブ)に移します。
  6. Tシェイクを実行して、細胞をフラスコ全体に均等に分散させます。細胞を監視し、48時間ごとに培地を交換します。

6. 凍結保存PTECs

  1. ステップ5.6.の後、15 mLコニカルチューブごとに2 mLの10% DMSOおよび90%低グルコースPTEC培地に細胞ペレットを再懸濁し、1 mLを1つのクライオバイアルに移します。
  2. クライオバイアルを温度制御凍結可能な細胞凍結容器に移し、容器を-80°Cの冷凍庫に24時間置きます。-80°Cで24時間後、クライオバイアルを液体窒素タンクに移して長期保存します。

7. PTECの解凍

  1. バイアルを-80°Cから37°Cの水浴で解凍します。室温(RT)で解凍しないでください。バイアルが部分的に解凍されたら(小さな氷片が見えるはずです)、10 mLの予熱したPTEC培地を入れた15 mLのコニカルチューブに1 mLの細胞懸濁液を加えます。
  2. 細胞懸濁液を400 g で5分間スピンダウンします。上清を吸引し、予熱した低グルコースPTEC培地5mLに細胞を再懸濁します。
  3. 5 mLの細胞懸濁液をT-25フラスコに移し、Tシェイクを行ってフラスコ全体に細胞を均等に分布させます。ここからは、メディアの変更に関するセクション 4 に従ってください。

8. MPSデバイスをI型コラーゲンマトリックスでコーティングする

  1. MPSデバイスからPBSを吸引し、デバイスをパッケージから取り出します。デバイスを医療用ワイプで乾かし、必要に応じてラベルを付けます。
  2. MPSデバイスを15cmの円形培養皿に入れ、使用する準備ができるまで4°Cに置きます。MPSデバイスの湿気を防ぐために、医療用ワイプを皿の底に置いてください。
  3. コラーゲンI注射に使用するまで、22 GのLuer-Lokニードルブラントを-20°Cで取り付けた1 mLシリンジを保管してください。
  4. 充填が必要なMPSデバイス4個ごとに、15 mLコニカルチューブ1本を氷上に置いておきます。15 mLコニカルチューブごとにニードルブラントが取り付けられた1 mLシリンジを1つ使用します。.
  5. バイオセーフティキャビネットで滅菌技術を使用して、MPSデバイスのすべてのポートを開きます。各スクリューバルブの上部にあるスリットがポートと垂直に揃っていることを確認してください。
  6. 1 mLシリンジ/ニードルブラントアセンブリを使用して、1 mLのエタノールを含むECMチャンバーをポート#1、#3、および#6にフラッシュします。エタノールを吸引し、ポート#2、#4、および#5からMPSデバイスに浸透しないように、完全に(少なくとも30秒)蒸発させます。
  7. MPSデバイスを4°Cに戻し、PTECメディア、M199、および1 N NaOHを氷上に保ちます。
  8. 表 1 に従って、約 4 台の MPS デバイスに対する 1 mL のタイプ I コラーゲン混合物のマトリックス組成を計算します(必要に応じてスケールします)。バイオセーフティキャビネットで、上記の計算に従って、PTEC培地、M199、および1 N NaOHをこの順序で混合し、すべてのチューブを氷上に保ちます。
  9. I型コラーゲンストックを1mLのシリンジでプレメイドミックスに慎重に加えます。コラーゲン混合物をピペッティングで上下に動かして、混合物が安定したサーモンオレンジピンク色になるまで混合します。
  10. チューブを短時間遠心分離して、底部に溶液を回収します。溶液に気泡がないことを確認してください。
  11. 22 GのLuer-LokニードルブラントとMPSデバイスを入らせた予冷した1 mLシリンジをバイオセーフティキャビネットに入れ、氷上に置きます。あらかじめ冷やした1mLのシリンジにコラーゲン混合物を入れ、泡が完全に入らないようにします。
  12. コラーゲン溶液を非常にゆっくりと穏やかに、冷却したデバイスチャンバーのポート#1、#3、および#6に注入します。ポートを下に向けてデバイスを垂直に保持し、気泡がポート#2、#4、および#5から流れ出るようにします。
    注:ポート#2、#4、および#5にコラーゲン混合物の液滴があり、チャンバーが完全にコーティングされていることを示しています。
  13. シリンジを取り外し、氷の上の15 mLチューブに戻します。.ポート#2、#4、および#5のスクリューバルブを回して、充填されたチップをシールし、チップを4°Cで30分間培養皿に置きます。
  14. 30分後、チップをディッシュと一緒に無菌状態でバイオセーフティキャビネットに移し、チップを均一かつ個別に広げて、均一に温まるようにします。
  15. 湿らせた医療用ワイプを各皿に入れ(コラーゲンIマトリックスが乾燥してMPSデバイスの壁から剥がれるのを防ぐため)、半透明の柔軟なシーリングフィルムで皿を密封します。コラーゲンをRTで一晩重合させます。

9. MPSデバイスのECMとしてIV型コラーゲンを使用した管状内腔の作成

  1. C-flexチューブを超純水(タイプ1)と純エタノールで洗浄して滅菌し、チューブの全ラインをオートクレーブします。
  2. バイオセーフティキャビネットで、I型コラーゲン充填MPSデバイスのすべてのポートを開き(スクリューバルブはポートに対して垂直になります)、ポート#1、#3、および#6から突き出ているワイヤーを取り外して、管状内腔を形成します。
  3. 金属製カプラーをポート #1、#3、および #6 に挿入します。
  4. PTEC培地に5 μg/mL IV型コラーゲンの10 mL溶液を調製します。
  5. ポート#1、#3、および#6から突き出た金属製の鈍器に24インチの滅菌Cフレックスチューブを挿入します。
  6. 22 G Luer-Lokニードルブラントを装着した1 mLシリンジに0.5 mLのIV型コラーゲン溶液を充填します。.
  7. 充填されたシリンジをシリンジ輸液ポンプに置き、ポート#1からのチューブをシリンジに接続します。ポート #3 と #6 に対してこの手順を繰り返します。
  8. シリンジポンプを使用して、IV型コラーゲン溶液を10μL/minの速度で30分間MPSポートに送達します。ポートを注入したら、コラーゲンを37°Cのインキュベーターで一晩固化させてから、翌日使用します。
    注:IV型コラーゲンコーティングMPSデバイスは、4°Cで最大1週間保存できます。

10. MPSデバイスでのプライマリPTECのシード

  1. 顕微鏡でMPSデバイスを検査し、ルーメンが正しく形成されていることを確認します。
  2. 滅菌済みの5mLシリンジと22Gの針を、5mLのエタノールが入った15mLのチューブに入れます。
  3. 手順5.1に従って、T-25フラスコから15 mLコニカルチューブに入ったPTEC細胞ペレットを取得します。を 5.3 に設定します。細胞ペレットに80 μLのPTEC培地を加え、穏やかに再懸濁します。
  4. 細胞懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移します。
  5. MPSデバイスが入ったディッシュをインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネットに入れます。ポート#2、#4、および#5を閉じ、スクリューバルブをポートに対して水平に回します。
  6. PTEC含有チューブを静かにフリックして、細胞を再懸濁します。シリンジに細胞を充填し、スクリューバルブのポートから最も遠い注入ポートに針を挿入します。
  7. シリンジのプランジャーを慎重に押し下げて細胞を注入します。注射後の細胞を顕微鏡で可視化します。
    注:細胞は内腔を通って移動している必要があります。内腔に細胞が観察されない場合は、針が注入口にしっかりと挿入されているかどうかを確認し、必要に応じて針を再挿入します。細胞のフルシリンジは、デバイス上の3つのルーメンすべてを満たすことができます。
  8. 他の2つのポートで細胞注入を続けます。注入後、ポート#2、#4、および#5を閉じ、MPSデバイスを37°Cインキュベーターに戻します。細胞が重力によって内腔から移動しないように、プレートを水平に保ちます。
  9. 追加のMPSデバイスについては、シリンジを空にした後にエタノールで洗浄し、細胞を描画する前にDPBSで洗浄します。
  10. MPSデバイスを邪魔されずに一晩置いておきます。
  11. 翌日、MPSデバイスをシリンジポンプに接続します。
  12. バイオセーフティキャビネットに、5 mLシリンジにPTEC培地を充填します。次に、22 G Luer-Lokチップブラントをシリンジに取り付けられたC-flexチューブの24インチセクションに取り付けます。
  13. PTECメディアロードシリンジをシリンジポンプに入れます。ラインをプライミングして、気泡を取り除きます。
  14. 下塗りされたチューブラインをポート#1、#3、および#6に取り付け、スクリューバルブを垂直位置に回してメディアの流れを導入します。
  15. シリンジポンプの流量を0.5μL/minに設定してください。MPSデバイスを装着したディッシュを37°Cインキュベーターに戻し、連続培地灌流下で細胞が細管を形成するのを待ってから、実験を開始します。

結果

2D培養における単離された初代PTECの経時的な形態と合流性
腎皮質からの分離後、PTECは最初の培地交換の前に少なくとも48時間邪魔されずに成長することを許可されました。細胞を培養してから約1週間後、PTECの小さなバッチが培養フラスコ全体に現れ、均一な上皮の丸石のような形態になります(図1A、B)。さまざまな...

ディスカッション

MPS(Organ-on-a-chip)技術は、ヒトの生理学の重要な側面を再現するための非常に関連性の高い in vitro プラットフォームを提供し、それによって医薬品開発や毒物学的評価における動物モデルへの依存を減らします。最近、FDA近代化法2.0(2022年)により、他の代替薬とともにMPSを治験薬申請に含めることが許可されました29。このプロトコルは、ヒト?...

開示事項

著者らは、この研究に関連する利益相反や財務開示がないことを宣言します。

謝辞

この作業の一部は、NASAの契約80ARC023CA001、National Center for Advancing Translational Sciences(NCATS)(U2CTR004867、UH3TR000504、UG3TR002158)、NCATSとCenter for the Advancement of Science in Space（CASIS）（UG3TR002178、National Institute of Environmental Health Sciences（NIEHS）(P30ES00703)、National Institute of General Medical Sciences（T32GM007750)が共同で提供した、Northwest Kidney CentersからKidney Researchへの無制限の寄贈により支援されましたInstitute、およびワシントン大学薬学部(Ji-Ping Wang AwardおよびBradley Fellowship)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific14-959-53A
3D microphysiological DeviceNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagenase, Type IV, powderThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Defined Trypsin InhibitorThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, powderThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o GlucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidneyNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Incubating Orbital ShakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Internal Thread Cryogenic VialsCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inchesInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Small Benchtop CentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metal Coupler (blunt)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Freezing ContainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Original model discontinued 
Nunc Non-treated Flasks, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, SterileGreiner Bio-One607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")Cole-Parmer06422-00
Single edge razor blade (sterile)BiosealKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Sodium HydroxideMilliporeSigmaS8045
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermoFisher Scientific567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm VentedGenesee Scientific25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Type I collagen, rat tailCorning354236
Type IV Collagen, MouseCorning354233

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