Isolierung primärer humaner proximaler Tubula-Epithelzellen und ihre Verwendung bei der Erstellung eines mikrophysiologischen Modells des proximalen Tubulus der Niere

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein optimiertes Protokoll für die Verarbeitung ganzer menschlicher Nieren zur Isolierung und Kultivierung primärer proximaler Tubulus-Epithelzellen und die Anwendung dieser Zellen in einer dreidimensionalen, mikrofluidischen, mikrophysiologischen Plattform zur Rekapitulation des proximalen Nierentubuli.

Zusammenfassung

Weltweit sind über 850 Millionen Menschen von Nierenerkrankungen betroffen, darunter 37 Millionen Amerikaner. Zu den Risikofaktoren für eine chronische Nierenerkrankung gehören Umwelteinflüsse, genetische Veranlagungen, Begleiterkrankungen und akute Nierenschäden in der Vorgeschichte. Es dauert oft Monate oder Jahre, bis sich diese Faktoren entwickeln, was Längsschnittstudien zur Ätiologie und Pathophysiologie der Krankheit erschwert. Fortschrittliche Nierenmodelle werden benötigt, um unser Verständnis der Krankheitsmechanismen zu verbessern und die Vorhersage der Nephrotoxizität in der Arzneimittelentwicklung zu verbessern. Proximale Tubulus-Epithelzellen (PTECs) in der Niere spielen eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung von Xenobiotika und Toxinen sowie bei der Resorption essentieller Nährstoffe. Wir haben bereits gezeigt, dass dreidimensionale (3D) mikrophysiologische Systemplattformen (MPS), die mit isolierten primären PTECs bestückt sind, verwendet werden können, um renale Arzneimittelwechselwirkungen zu untersuchen, die Nephrotoxizität von Verbindungen zu beurteilen und die Wirkstoffclearance vorherzusagen. Hier stellen wir Protokolle für die Isolierung und Kultivierung primärer PTECs aus ganzen menschlichen Nieren und für deren Einbettung in eine 3D-MPS-Plattform vor, die in vivo die Nierenphysiologie nachahmt. Dieses Protokoll ermöglicht Langzeitstudien, die die PTEC-Lebensfähigkeit, physiologische Morphologie und funktionelle Polarisation von Schlüsseltransporterproteinen in MPS-Geräten für bis zu 6 Monate unterstützen.

Einleitung

Die Niere spielt eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung und Ausscheidung einer Vielzahl von Xenobiotika, Toxinen und endogenen Verbindungen aus dem Körper. Dies wird durch das Filtern des Blutes erreicht, um Abfallprodukte zu entfernen, und durch die Regulierung des Elektrolythaushalts, des Flüssigkeitsspiegels und des pH-Werts. Jede menschliche Niere enthält etwa eine Million Nephrone, die strukturellen und funktionellen Einheiten der Niere¹. Innerhalb dieser Nephrone sind spezialisierte Epithelzellen in den proximalen Tubuli, die als proximale Tubulus-Epithelzellen (PTECs) bekannt sind, für die Resorption essentieller Moleküle wie Glukose, Aminosäuren und Ionen sowie für die Sekretion von Arzneimittelsubstraten und potenziell toxischen Substanzen in den Urin verantwortlich ^2,3,4. In einigen Fällen können PTECs auch Verbindungen aus dem Urin wieder in den Blutkreislauf resorbieren⁴. Aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei Arzneimittel- und Toxinwechselwirkungen stellen primäre PTECs, die aus menschlichen Nieren isoliert wurden, ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von renalen Arzneimittelwechselwirkungen (DDIs) und die Bewertung der Nephrotoxizität von Verbindungen dar.

Die medikamenteninduzierte Nephrotoxizität stellt eine große klinische Herausforderung dar, da sie zu akutem Nierenversagen und chronischer Nierenerkrankung führen kann⁵. Daher ist ein tieferes Verständnis der Physiologie des proximalen Nierentubuli unerlässlich, um das nephrotoxische Potenzial von Arzneimitteln und Toxinen genau vorherzusagen und zu charakterisieren. Traditionelle In-vitro-Modelle, einschließlich immortalisierter Nierenzelllinien (z. B. RPTEC-TERT1, HK-2), weisen Einschränkungen bei der Nachahmung der komplexen Struktur und Funktion der humanen proximalen Tubuli⁶ auf, die in vivo unter dynamischer, laminarer Strömung (mit einer niedrigen Reynolds-Zahl) und einer einheitlichen extrazellulären Matrix (ECM) arbeiten ^7,8. Darüber hinaus gelingt es traditionellen zweidimensionalen (2D) Modellen oft, wichtige renale Transporter (z. B. organische Anionentransporter 1 und 3 (OAT1 und OAT3), organischer Kationentransporter 2 (OCT2)) aufgrund des schnellen Abbaus und der Internalisierung dieser Proteine nicht funktionell zu exprimieren 6,9,10,11 . Tiermodelle sind zwar informativ, replizieren aber möglicherweise nicht vollständig die menschliche Nierenphysiologie und sind aufgrund von Speziesunterschieden in der Expression und Aktivität des Transporters oft nicht übertragbar¹². Zum Beispiel wird mOct1 in Maus-PTECs basolateral exprimiert, während beim Menschen die Membranproteinexpression von OCT1 in der Niere nicht nachweisbar ist^13,14.

Fortschritte bei mikrophysiologischen Systemen (MPS) und Organ-on-a-Chip-Technologien haben es Forschern ermöglicht, In-vitro-Modelle zu entwickeln, die die dreidimensionale (3D) Architektur und die dynamischen Strömungsbedingungen menschlicher Organe genau nachahmen¹⁵. Unsere Gruppe hat zuvor zwei MPS-Modelle mit PTECs^16,17 charakterisiert und diese Modelle verwendet, um Toxizitätsstudien 18,19,20 durchzuführen und die Arzneimitteldisposition genau vorherzusagen ²¹. Die Verwendung von primären PTECs in diesen Modellen bietet erhebliche Vorteile, da sie in vivo beobachtete funktionale Eigenschaften beibehalten können.

Hier stellen wir die Protokolle für die Isolierung von humanen PTECs aus einer intakten menschlichen Niere vor, die von einem verstorbenen Spender über eine vom United Network for Organ Sharing (UNOS) anerkannte Organbeschaffungsorganisation gewonnen wurden, und die Anwendung dieser kultivierten humanen PTECs innerhalb einer MPS-Plattform.

Protokoll

Alle Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Washington zum Umgang mit menschlichem Gewebe durchgeführt. Geeignete Spender erfüllen die folgenden Anforderungen: weniger als 36 Stunden kalte ischämische Zeit (CIT), keine bekannte Vorgeschichte von Nierenerkrankungen, Dialyse oder anderen Erkrankungen (z. B. Diabetes mellitus Typ 1 oder 2, Hepatitis B, Hepatitis C, humane Immundefizienzviren (HIV), virale/bakterielle Meningitis, Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Infektion , Syphilis, Sepsis oder Covid-19). Die gesamten menschlichen Nieren, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden von einem von der UNOS zugelassenen OPO bezogen.

1. Vorbereitung der Biosicherheitswerkbank

1. Sprühen Sie die Haube mit 70 % Ethanol ein. Dekontaminieren Sie alle Oberflächen und Gegenstände im Schrank, um eine sterile Umgebung zu schaffen.
2. Legen Sie blaue Saugeinlagen aus. Führen Sie alle Gewebearbeiten über diesen Polstern durch.
3. Stellen Sie sicher, dass die notwendige Ausrüstung in der Biosicherheitswerkbank verfügbar und ordnungsgemäß sterilisiert ist (Rasierklingen, serologische Pipettenspitzen, serologische Pipettenpistole, 100 μm Zellsiebe, p1000 Spitzen, 1000 μl Mikropipette, 15 cm zirkuläre Kulturschalen und konische Röhrchen).

2. Vorbereitung der Nierenaufbereitung

1. Bereiten Sie eine Nierenverdauungslösung vor, indem Sie 0,75 mg/ml Kollagenase IV + 0,75 mg/ml Dispase II in die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco mit Calcium und Magnesium geben. Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2 μm sterilen Membranfilter.
   HINWEIS: Für eine ganze menschliche Erwachsenenniere sind ca. 14 konische 50-ml-Röhrchen erforderlich, die jeweils ~35 ml Aufschlusslösung (insgesamt 500 ml) enthalten.
2. Bereiten Sie PTEC-Medien vor, indem Sie 4,425 g Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 Pulver ohne Glukose, 0,5 g D-Glukosepulver, 0,6 g Natriumbicarbonatpulver, 5 ml 100x Insulin-Transferrin-Selen-Präparat (enthalten 1000 mg/l Insulin, 550 mg/l Transferrin und 0,67 mg/l Natriumselenit), 0,5 ml 50 μM Hydrocortison und 5 ml 100x antibiotisch-antimykotische Lösung (enthält 10000 Einheiten/ml Penicillin G-Natrium, 10000 μg/ml Streptomycinsulfat und 25 μg/ml Amphotericin B in 0,85 % Kochsalzlösung) in 500 ml steriles autoklaviertes Reinstwasser (Typ 1). Filtern Sie das Medium durch einen 0,2 μm sterilen Membranfilter. Tauen Sie das fötale Rinderserum (FBS) auf und stellen Sie 10 ml-Aliquote in 14 konischen Röhrchen zu 50 ml her.
3. Sammeln und beschriften Sie einen zusätzlichen Satz konischer 50-ml-Röhrchen. Stellen Sie in diesem Schritt sicher, dass 3 Sätze mit 14 50-ml-Röhrchen vorhanden sind.
4. Den Orbitalschüttler auf 37 °C vorwärmen.

3. Isolierung von PTECs aus der gesamten Niere

1. Legen Sie den Versandbehälter mit der Gewebeprobe in einer sterilen Technik in die Biosicherheitshaube. Nehmen Sie den Beutel aus der Schachtel und besprühen Sie die Außenseite mit 70% Ethanol, bevor Sie ihn in die Haube legen.
2. Legen Sie die Niere auf eine runde 15 cm große Kulturschale. Aspirieren/Verwerfen des restlichen Mediums.
3. Entfernen Sie das umliegende Fett und die Nierenkapsel mit sterilen Rasierklingen. Ritzen Sie die Nierenkapsel vorsichtig ein, um einen Schlitz in der Mitte zu erzeugen.
4. Ziehen Sie mit einer Pinzette die Kapsel ab und schneiden Sie mit Rasierklingen das an der Niere haftende Fett ab. Entsorgen Sie sowohl die Kapsel als auch das Fett in eine weitere 15-cm-Kulturschale.
5. Trennen Sie die Rinde (~1 cm dick) von der Medulla. Entsorgen Sie das Mark.
   HINWEIS: Die Hirnrinde hat im Vergleich zur Medulla eine hellere bräunlich-gelbe Farbe.
6. Mit einer Rasierklinge das Taschentuch in <1 cm³ Stücke hacken, bis es eine Aufschlämmung aufweist.
7. Geben Sie eine kleine Menge Nierenverdauungspuffer in die Schale und geben Sie die Aufschlämmung in den ersten Satz von 50-ml-Röhrchen mit 35 ml der Nierenverdauungslösung. Gleichmäßig verteilen und ein Gesamtvolumen von 45 ml pro Röhrchen nicht überschreiten.
8. Übertragen Sie alle Röhrchen auf den 37 °C Orbitalschüttler und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei höchster Geschwindigkeit, bei der die Röhrchen nicht herausfallen. Übertragen Sie die Röhrchen zurück in die Biosicherheitswerkstatt, nachdem Sie sie mit 70% Ethanol besprüht haben.
9. Drehen Sie die Röhrchen zum Mischen um und lassen Sie die größeren Gewebestücke am Boden absetzen. Übertragen Sie so viel wie möglich der Lösung in die konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml fötalem Rinderserum (FBS), ohne intaktes Gewebe zu übertragen. Gleichmäßig verteilen und ein Gesamtvolumen von 45 ml pro Röhrchen nicht überschreiten.
10. Die Röhrchen bei 200 g 7 min zentrifugieren. Schieben Sie die Röhrchen zurück in die Biosicherheitswerkstatt, nachdem Sie sie mit 70 % Ethanol besprüht haben.
11. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. Geben Sie 10 mL PTEC-Medium in jedes Röhrchen und resuspendieren Sie die Pellets.
12. Die resultierenden Zellsuspensionen werden durch 100-μm-Zellsiebe in neue konische 50-ml-Röhrchen abgeseiht.
13. Die resultierenden Zellfiltrate bei 400 g für 5 min zentrifugieren. Schieben Sie die Röhrchen zurück in die Biosicherheitswerkstatt, nachdem Sie sie mit 70 % Ethanol besprüht haben.
14. Waschen Sie die Pellets mit 5 mL DPBS. Resuspendieren Sie die Pellets mit einer p1000-Spitze.
15. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g für 5 min. Schieben Sie die Röhrchen nach dem Besprühen mit 70 % Ethanol zurück in die Biosicherheitswerkbank und saugen Sie dann die Überstände ab.
16. Wiederholen Sie Schritt 3.15 noch zwei weitere Male für insgesamt drei Wäschen. Anschließend werden die Zellpellets mit 15 ml PTEC-Medien resuspendiert und die Zellen auf sterile T-75-Zellkulturkolben aufgefüllt.
17. Die Kolben sind entsprechend zu beschriften und die Zellen in einem sterilen Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ wachsen zu lassen. Lassen Sie PTECs 48 h lang ungestört im Inkubator wachsen, bevor es zum ersten Medienwechsel kommt.

4. Änderungen in den Medien

1. Das Medium wird aus den Kolben abgesaugt.
2. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL vorgewärmtem DPBS.
3. Geben Sie 5 mL vorgewärmtes PTEC-Medium in die T-25-Kolben.
4. Setzen Sie den Kolben wieder in den Brutkasten ein.
5. Das Medium wird alle 48 Stunden gewechselt, bis der Kolben eine Konfluenz von mindestens 70 % erreicht hat, um es zu passieren oder in Versuchen zu verwenden.

5. PTECs passieren

1. Das Medium wird aus dem Kolben abgesaugt. 5 ml vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin-EDTA werden in jeden T-25-Kolben gegeben und 1 bis 2 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um den Trypsinaufschluss zu ermöglichen.
2. Sobald die Zellen abgelöst sind, neutralisieren Sie Trypsin mit 5 ml vorgewärmter, definierter Trypsin-Inhibitor-Lösung.
3. 5 Mal resuspendieren, um alle noch am Kolben anhaftenden Zellen zu entfernen. Dann die Zellsuspension in konische 15-ml-Röhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 400 g zentrifugieren.
4. Saugen Sie den Überstand ab.
   HINWEIS: Hören Sie hier auf, um PTECs zu kryokonservieren, und gehen Sie zu diesem Protokoll über.
5. Resuspendieren Sie die Zellpellets mit 14 mL PTEC-Medien pro Röhrchen. Die Zellsuspensionen werden in T-75-Kolben überführt (1 Röhrchen pro Kolben).
6. Führen Sie einen T-Shake durch, um die Zellen gleichmäßig über den Kolben zu verteilen. Überwachen Sie die Zellen und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden.

6. Kryokonservierung von PTECs

1. Nach Schritt 5.6 werden die Zellpellets in 2 ml 10 % DMSO- und 90 % PTEC-Medien mit niedrigem Glukosegehalt für jedes konische 15-ml-Röhrchen resuspendiert und 1 ml in ein Kryofläschchen überführt.
2. Füllen Sie die Kryofläschchen in einen Gefrierbehälter um, der ein temperaturkontrolliertes Einfrieren ermöglicht, und stellen Sie den Behälter für 24 Stunden in einen -80 °C-Gefrierschrank. Nach 24 Stunden bei -80 °C werden die Kryofläschchen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank umgefüllt.

7. Auftauen von PTECs

1. Tauen Sie das Fläschchen ab -80 °C im 37 °C warmen Wasserbad auf. Nicht bei Raumtemperatur (RT) auftauen. Nachdem die Durchstechflasche teilweise aufgetaut wurde (es sollte ein kleines Stück Eis sichtbar sein), geben Sie 1 ml Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml vorgewärmtem PTEC-Medium.
2. Schleudern Sie die Zellsuspension bei 400 g für 5 Min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml vorgewärmtem PTEC-Medium mit niedrigem Glukosegehalt.
3. Die 5-ml-Zellsuspension wird in einen T-25-Kolben überführt und ein T-Shake durchgeführt, um die Zellen gleichmäßig über den Kolben zu verteilen. Von hier aus folgen Sie Abschnitt 4 für Medienänderungen.

8. Beschichtung des MPS-Geräts mit Kollagenmatrix vom Typ I

1. Saugen Sie das PBS aus dem MPS-Gerät an und nehmen Sie das Gerät aus der Verpackung. Wischen Sie das Gerät mit medizinischen Tüchern trocken und beschriften Sie es wie gewünscht.
2. Stellen Sie das MPS-Gerät in eine 15 cm breite runde Kulturschale und stellen Sie es bis zur Verwendung bei 4 °C auf. Bewahren Sie medizinische Tücher auf dem Boden der Schale auf, um Feuchtigkeit auf dem MPS-Gerät zu vermeiden.
3. Bewahren Sie 1 ml-Spritzen mit 22 g Luer-Lok-Nadelabstufungen bei -20 °C auf, bis Sie sie für die Kollagen-I-Injektion verwenden.
4. Bewahren Sie für jeweils vier MPS-Geräte, die befüllt werden müssen, ein konisches 15-ml-Röhrchen auf Eis auf. Verwenden Sie für jedes konische 15-ml-Röhrchen eine 1-ml-Spritze mit aufgesetzter Nadel stumpf.
5. Öffnen Sie mit einer sterilen Technik in einer Biosicherheitswerkbank alle Anschlüsse am MPS-Gerät. Stellen Sie sicher, dass die Schlitze an der Oberseite jedes Schraubventils senkrecht mit dem Anschluss ausgerichtet sind.
6. Spülen Sie die ECM-Kammer mit einer 1-ml-Spritze/Nadel-Blunt-Baugruppe mit 1 ml Ethanol in die Anschlüsse #1, #3 und #6. Saugen Sie das Ethanol ab und lassen Sie es vollständig verdampfen (mindestens 30 s), damit es nicht von den Anschlüssen #2, #4 und #5 in das MPS-Gerät eindringt.
7. Stellen Sie das MPS-Gerät wieder auf 4 °C und halten Sie das PTEC-Medium, M199 und 1 N NaOH auf Eis.
8. Berechnen Sie die Matrixzusammensetzung für 1 ml der Typ-I-Kollagenmischung für etwa vier MPS-Geräte gemäß Tabelle 1 (Skala nach Bedarf). In der Biosicherheitswerkbank werden die PTEC-Medien, M199 und 1 N NaOH in dieser Reihenfolge gemäß den obigen Berechnungen gemischt und alle Röhrchen auf Eis gelegt.
9. Geben Sie den Kollagenfond Typ I vorsichtig mit einer 1-ml-Spritze zur vorgefertigten Mischung. Mischen Sie die Kollagenmischung, indem Sie auf und ab pipettieren, bis die Mischung eine stabile lachsorange-rosa Farbe hat.
10. Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um die Lösung am Boden aufzufangen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Lösung befinden.
11. Legen Sie die vorgekühlten 1-mL-Spritzen mit 22 g Luer-Lok-Nadelabstufungen und das MPS-Gerät in die Biosicherheitswerkbank und auf Eis. Füllen Sie die vorgekühlte 1 mL Spritze mit der Kollagenmischung und vermeiden Sie Blasen vollständig.
12. Injizieren Sie die Kollagenlösung sehr langsam und vorsichtig in die Ports #1, #3 und #6 der gekühlten Gerätekammern. Halten Sie das Gerät senkrecht mit den Anschlüssen nach unten, damit Luftblasen nach oben und aus den Anschlüssen #2, #4 und #5 strömen können.
    HINWEIS: An den Anschlüssen #2, #4 und #5 sollte sich ein Tröpfchen der Kollagenmischung befinden, was darauf hinweist, dass die Kammern vollständig beschichtet sind.
13. Entfernen Sie die Spritze und legen Sie sie wieder in das 15-ml-Röhrchen auf Eis. Drehen Sie das Schraubventil für die Anschlüsse #2, #4 und #5, um den gefüllten Chip zu verschließen, und legen Sie den Chip 30 Minuten lang bei 4 °C auf die Kulturschale.
14. Nach 30 min geben Sie den Chip mit der Schale steril in die Biosicherheitswerkbank und verteilen die Chips gleichmäßig und einzeln, so dass sie sich gleichmäßig erwärmen.
15. Geben Sie in jede Schale ein angefeuchtetes medizinisches Tuch (um zu verhindern, dass die Kollagen-I-Matrix austrocknet und sich von den Wänden des MPS-Geräts ablöst) und verschließen Sie die Schalen mit einer halbtransparenten, flexiblen Dichtungsfolie. Lassen Sie das Kollagen über Nacht bei RT polymerisieren.

9. Erstellen eines röhrenförmigen Lumens mit Kollagen Typ IV als ECM in einem MPS-Gerät

1. Sterilisieren Sie C-Flex-Schläuche, indem Sie die Schläuche mit hochreinem Wasser (Typ 1) und reinem Ethanol spülen und dann die gesamte Schlauchleitung autoklavieren.
2. Öffnen Sie in der Biosicherheitswerkbank alle Anschlüsse des mit Kollagen gefüllten MPS-Geräts vom Typ I (das Schraubenventil befindet sich vertikal zu den Anschlüssen) und entfernen Sie den Draht, der aus den Anschlüssen #1, #3 und #6 herausragt, um die röhrenförmigen Lumen zu bilden.
3. Setzen Sie die Metallkoppler in die Anschlüsse #1, #3 und #6 ein.
4. Bereiten Sie eine 10-ml-Lösung von 5 μg/ml Typ-IV-Kollagen in PTEC-Medien vor.
5. Führen Sie 24 Zoll sterilen C-Flex-Schlauch auf die Metallstumpfe ein, die aus den Anschlüssen #1, #3 und #6 herausragen.
6. Füllen Sie 1-ml-Spritzen, die mit einem 22-g-Luer-Lok-Nadelstumpf bestückt sind, mit 0,5 ml Kollagenlösung vom Typ IV.
7. Setzen Sie die gefüllte Spritze auf eine Spritzeninfusionspumpe und verbinden Sie den Schlauch von Anschluss #1 mit der Spritze. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Ports #3 und #6.
8. Geben Sie mit der Spritzenpumpe die Kollagenlösung Typ IV 30 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 10 μl/min in die MPS-Ports. Lassen Sie das Kollagen nach der Infusion über Nacht in einem 37 °C heißen Inkubator verfestigen, bevor Sie es am nächsten Tag verwenden.
   HINWEIS: Kollagenbeschichtete MPS-Geräte vom Typ IV können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.

10. Seeding primärer PTECs in einem MPS-Gerät

1. Überprüfen Sie das MPS-Gerät unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich das Lumen korrekt gebildet hat.
2. Legen Sie eine vorsterilisierte 5-ml-Spritze mit einer 22-g-Nadel in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 mL Ethanol.
3. Gewinnen Sie ein PTEC-Zellpellet in einem konischen 15-ml-Röhrchen aus einem T-25-Kolben, indem Sie die Schritte 5.1 befolgen. bis 5.3. Geben Sie 80 μl PTEC-Medium zum Zellpellet und resuspendieren Sie es vorsichtig.
4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen.
5. Nehmen Sie die Schale mit dem MPS-Gerät aus dem Inkubator und stellen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Schließen Sie die Anschlüsse #2, #4 und #5 und drehen Sie das Schraubventil horizontal zu den Anschlüssen.
6. Schnippen Sie vorsichtig mit dem PTEC-haltigen Röhrchen, um die Zellen wieder zu resuspendieren. Füllen Sie die Spritze mit Zellen und führen Sie die Nadel in die Injektionsöffnung ein, die am weitesten von den Anschlüssen der Schraubenventile entfernt ist.
7. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben der Spritze, um die Zellen zu injizieren. Visualisieren Sie die Zellen nach der Injektion unter einem Mikroskop.
   HINWEIS: Die Zellen sollten sich durch das Lumen bewegen. Wenn keine Zellen im Lumen zu beobachten sind, überprüfen Sie, ob die Nadel sicher in die Injektionsöffnung eingeführt wurde, und führen Sie die Nadel bei Bedarf wieder ein. Eine volle Spritze mit Zellen kann alle drei Lumen des Geräts füllen.
8. Setzen Sie die Zellinjektionen mit den beiden anderen Ports fort. Schließen Sie nach den Injektionen die Anschlüsse #2, #4 und #5 und setzen Sie das MPS-Gerät wieder in den 37 °C-Inkubator ein. Halten Sie die Platte waagerecht, damit sich die Zellen nicht durch die Schwerkraft aus dem Lumen bewegen.
9. Bei zusätzlichen MPS-Geräten waschen Sie die Spritze nach dem Entleeren mit Ethanol und waschen Sie sie mit DPBS, bevor Sie die Zellen entnehmen.
10. Lassen Sie die MPS-Geräte über Nacht ungestört stehen.
11. Schließen Sie am nächsten Tag die MPS-Geräte an die Spritzenpumpen an.
12. Füllen Sie in der Biosicherheitswerkbank 5 mL-Spritzen mit PTEC-Medien. Setzen Sie dann 22 G Luer-Lok-Spitzenstumpfe mit dem 24-Zoll-Abschnitt des C-Flex-Schlauchs ein, der an den Spritzen befestigt ist.
13. Legen Sie die mit PTEC beladenen Spritzen in die Spritzenpumpe ein. Grundieren Sie die Linien, um Luftblasen zu entfernen.
14. Befestigen Sie die grundierten Schlauchleitungen an den Anschlüssen #1, #3 und #6 und drehen Sie die Schraubenventile in eine vertikale Position, um den Medienfluss einzuführen.
15. Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf 0,5 μl/min ein. Stellen Sie die Schale mit dem MPS-Gerät wieder in den 37 °C-Inkubator und lassen Sie die Zellen (innerhalb von 5 bis 7 Tagen) unter kontinuierlicher Medienperfusion Tubuli bilden, bevor Sie ein Experiment beginnen.

Ergebnisse

Morphologie und Konfluenz isolierter primärer PTECs im Laufe der Zeit in 2D-Kulturen
Nach der Isolierung aus der Nierenrinde durften die PTECs vor dem ersten Medienwechsel mindestens 48 h lang ungestört wachsen. Etwa eine Woche nach der Kultivierung der Zellen sollten kleine Chargen von PTECs im gesamten Kulturkolben mit einer einheitlichen epithelialen, kopfsteinpflasterartigen Morphologie erscheinen (Abbildung 1A, B)....

Diskussion

MPS (Organ-on-a-Chip-Technologien) bieten eine hochrelevante In-vitro-Plattform , um Schlüsselaspekte der menschlichen Physiologie zu rekapitulieren und so die Abhängigkeit von Tiermodellen bei der Arzneimittelentwicklung und toxikologischen Bewertung zu verringern. Kürzlich hat der FDA Modernization Act 2.0 (2022) die Einbeziehung von MPS unter anderem in Investigational New Drug Applications ermöglicht²⁹. Dieses Protokoll beschreibt eine Standardpro...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Luer-Lok Tip Syringes	Becton, Dickinson	309628
1.5 mL microcentrifuge tubes	CELLTREAT Scientific Products	229442
15 mL sterile conical polypropylene tube	Fisher Scientific	14-959-53A
3D microphysiological Device	Nortis	TCC-001
5 mL Luer-Lok Tip Syringes	Becton, Dickinson	309646
50 mL sterile conical polypropylene tube	Fisher Scientific	12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermoFisher Scientific	15240062
Collagenase, Type IV, powder	ThermoFisher Scientific	17104019
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G8270
Defined Trypsin Inhibitor	ThermoFisher Scientific	R007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher Scientific	J66650-AK
Dispase II, powder	ThermoFisher Scientific	17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o Glucose	US Biological Life Sciences	D9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesium	ThermoFisher Scientific	14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium	ThermoFisher Scientific	A5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits	ThermoFisher Scientific	05-719-511	Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidney	Novabiosis	https://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/	Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)	Fisher Scientific	51033556
Hydrocortisone	MilliporeSigma	H0888
Incubating Orbital Shaker	Avantor	12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)	ThermoFisher Scientific	41400045
Internal Thread Cryogenic Vials	Corning	430487
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inches	Instech Laboratories, Inc.	LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)	ThermoFisher Scientific	21180021
Megafuge 8 Small Benchtop Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75007210
Metal Coupler (blunt)	Instech Laboratories, Inc.	SC 20/15
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher Scientific	5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S Microscope	Nikon Instruments	https://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/	Original model discontinued
Nunc Non-treated Flasks, T-25	ThermoFisher Scientific	169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75	ThermoFisher Scientific	156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, Sterile	Greiner Bio-One	607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")	Cole-Parmer	06422-00
Single edge razor blade (sterile)	Bioseal	KI-205/50
Sodium Bicarbonate	MilliporeSigma	S6297
Sodium Hydroxide	MilliporeSigma	S8045
Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	ThermoFisher Scientific	567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm Vented	Genesee Scientific	25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Type I collagen, rat tail	Corning	354236
Type IV Collagen, Mouse	Corning	354233