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摘要

我们提出了一种优化的方案，用于处理整个人肾脏以分离和培养原代肾近端肾小管上皮细胞，并将这些细胞应用于三维、微流体、微生理平台以概括肾近端小管。

摘要

肾病影响着全球超过 8.5 亿人，其中包括 3700 万美国人。慢性肾病的危险因素包括环境影响、遗传易感性、共存的疾病和急性肾损伤史。这些因素通常需要数月或数年才能形成，使疾病病因和病理生理学的纵向研究复杂化。需要先进的肾脏模型来提高我们对疾病机制的理解，并增强药物开发中的肾毒性预测。肾脏中的近端小管上皮细胞 （PTEC） 在外源性物质和毒素清除以及必需营养素的重吸收中起着关键作用。我们之前已经证明，填充有分离的原发性 PTEC 的三维 （3D） 微生理系统 （MPS） 平台可用于研究肾脏药物相互作用、评估化合物的肾毒性和预测药物清除。在这里，我们提出了从整个人类肾脏中分离和培养原代 PTEC 并将其接种到模拟 体内 肾脏生理学的 3D MPS 平台中的方案。该方案能够进行长达 6 个月的长期研究，支持 MPS 装置中关键转运蛋白的 PTEC 活力、生理形态和功能极化。

引言

肾脏在清除和消除体内各种外源性物质、毒素和内源性化合物方面起着关键作用。这是通过过滤血液以去除废物以及调节电解质平衡、液体浓度和 pH 值来实现的。每个人类肾脏包含大约 100 万个肾单位，这是肾脏的结构和功能单位1。在这些肾单位中，近端肾小管中的特化上皮细胞，称为近端肾小管上皮细胞 （PTEC），负责重吸收葡萄糖、氨基酸和离子等必需分子，以及将药物底物和潜在有毒物质分泌到尿液中 2,3,4。在某些情况下，PTEC 还可以将尿液中的化合物重新吸收回血液中4。由于它们在药物和毒素相互作用中起关键作用，从人肾脏中分离的原代 PTEC 为研究肾脏药物相互作用 （DDI） 和评估化合物的肾毒性提供了有价值的工具。

药物诱导的肾毒性构成了重大的临床挑战，因为它可导致急性肾损伤和慢性肾病5。因此，更深入地了解肾近端肾小管生理学对于准确预测和表征药物和毒素的肾毒性潜力至关重要。传统的体外模型，包括永生化肾细胞系（例如 RPTEC-TERT1、HK-2），在模拟人近端肾小管6 的复杂结构和功能方面存在局限性，这些小管在动态层流（具有低雷诺数）和均匀的细胞外基质 （ECM） 下运行体内 7,8.此外，由于这些蛋白的快速降解和内化，传统的二维 （2D） 模型通常无法在功能上表达主要的肾脏转运蛋白（例如，有机阴离子转运蛋白 1 和 3（OAT1 和 OAT3）、有机阳离子转运蛋白 2 （OCT2）） 6,9,10,11 .动物模型虽然信息量很大，但可能无法完全复制人类肾脏生理学，并且由于转运蛋白表达和活性的物种差异，通常缺乏可翻译性12。例如，mOct1 在小鼠 PTEC 中基底外侧表达，而在人类中，OCT1 在肾脏中的膜蛋白表达检测不到13,14。

微生理系统 （MPS） 和器官芯片技术的进步使研究人员能够开发出与人体器官的三维 （3D） 结构和动态流体流动条件密切相关的体外模型15。我们小组之前已经用 PTEC 表征了两个 MPS 模型16,17，并利用这些模型进行毒性研究 18,19,20 并准确预测药物处置 21。在这些模型中使用初级 PTEC 具有显着优势，因为它们能够保留体内观察到的功能特性。

在这里，我们提出了通过器官共享联合网络 （UNOS） 批准的器官获取组织从已故供体获得的完整人肾脏中分离人 PTEC 的方案，并将这些培养的人 PTEC 应用于 MPS 平台。

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研究方案

所有工作均按照华盛顿大学的人体组织处理指南进行。合适的供体满足以下要求：冷缺血时间 （CIT） 少于 36 小时，无已知的肾脏疾病、透析或任何其他疾病史（例如，1 型或 2 型糖尿病、乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒 （HIV）、病毒/细菌性脑膜炎、耐甲氧西林金 黄色葡萄球 菌感染、梅毒、败血症或 Covid-19）。本研究中使用的整个人类肾脏是通过 UNOS 批准的 OPO 获得的。

1. 生物安全柜准备

  1. 用 70% 乙醇喷洒引擎盖。净化柜内的所有表面和物品，以创造一个无菌的环境。
  2. 放下蓝色吸水垫。在这些垫上执行所有组织工作。
  3. 确保生物安全柜中备有必要的设备并经过适当消毒（剃须刀片、血清移液器吸头、血清移液器枪、100 μm 细胞过滤器、p1000 吸头、1000 μL 微量移液器、15 cm 圆形培养皿和锥形管）。

2. 肾脏前处理准备

  1. 通过将 0.75 mg/mL 胶原酶 IV + 0.75 mg/mL 分散酶 II 添加到含有钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中来制备肾脏消化液。通过 0.2 μm 无菌膜过滤器过滤溶液。
    注：对于整个人类成人肾脏，大约需要 14 个 50 mL 锥形管，每个锥形管含有 ~35 mL 消化液（总计 500 mL）。
  2. 通过添加 4.425 g 不含葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）/F12 粉末、0.5 g D-葡萄糖粉末、0.6 g 碳酸氢钠粉末、5 mL 100x 胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂（含有 1000 mg/L 胰岛素、550 mg/L 转铁蛋白和 0.67 mg/L 亚硒酸钠）、0.5 mL 50 μM 氢化可的松和 5 mL 100x 抗生素-抗真菌溶液（含有 10000 单位/mL 青霉素 G 钠、 将 10000 μg/mL 硫酸链霉素和 25 μg/mL 两性霉素 B 加入 0.85% 盐水中）加入 500 mL 无菌高压灭菌超纯（1 型）水中。通过 0.2 μm 无菌膜过滤器过滤培养基。解冻胎牛血清 （FBS），并在 14 个 50 mL 锥形管中制备 10 mL 等分试样。
  3. 收集并标记另一组 50 mL 锥形管。在此步骤中，确保有 3 组 14 个 50 mL 试管。
  4. 将轨道摇床预热至 37 °C。

3. 从整个肾脏中分离 PTEC

  1. 使用无菌技术，将装有组织样本的运输容器放入生物安全罩中。从盒子中取出袋子，用 70% 乙醇喷洒外部，然后再放入引擎盖。
  2. 将肾脏放在 15 厘米的圆形培养皿上。吸出/丢弃剩余的介质。
  3. 使用无菌剃须刀片去除周围的脂肪和肾包膜。轻轻地在肾包膜上划痕，在中心形成一个缝隙。
  4. 使用镊子拉下胶囊，用剃须刀片切掉附着在肾脏上的任何脂肪。将胶囊和脂肪丢弃到另一个 15 厘米的培养皿中。
  5. 将皮质（~1 厘米厚）与延髓分开。丢弃髓质。
    注意：与髓质相比，皮层呈浅棕黄色。
  6. 使用剃须刀片将组织切成 <1 厘米3 块，直到出现浆状外观。
  7. 在培养皿中加入少量肾脏消化缓冲液，并将浆液转移到第一组含有 35 mL 肾脏消化液的 50 mL 试管中。均匀分布，每管的总体积不超过 45 mL。
  8. 将所有试管转移到 37 °C 定轨摇床上，并以不会导致试管脱落的最高速度孵育 30 分钟。用 70% 乙醇喷洒后，将试管转移回生物安全柜中。
  9. 倒置试管以混合，让较大的组织块沉降到底部。将尽可能多的溶液转移到含有 10 mL 胎牛血清 （FBS） 的 50 mL 锥形管中，而不转移完整的组织。均匀分布，每管的总体积不超过 45 mL。
  10. 将试管以 200 g 离心 7 分钟。用 70% 乙醇喷洒后，将试管移回生物安全柜中。
  11. 小心吸出上清液。向每个试管中加入 10 mL PTEC 培养基并重悬沉淀。
  12. 通过 100 μm 细胞过滤器将所得细胞悬液过滤到新的 50 mL 锥形管中。
  13. 将所得细胞滤液以 400 g 离心 5 分钟。用 70% 乙醇喷洒后，将试管移回生物安全柜中。
  14. 用 5 mL DPBS 洗涤沉淀。使用 p1000 尖端重悬沉淀。
  15. 将试管以 400 g 离心 5 分钟。用 70% 乙醇喷洒后，将试管移回生物安全柜中，然后吸出上清液。
  16. 再重复步骤 3.15 两次，总共洗涤 3 次。然后，用 15 mL PTEC 培养基重悬细胞沉淀，并将细胞接种在无菌细胞培养 T-75 培养瓶上。
  17. 适当标记烧瓶，并让细胞在 37 °C 和 5% CO2 的无菌培养箱中生长。在第一次更换培养基之前，让 PTEC 在培养箱中不受干扰地生长 48 小时。

4. 媒体更改

  1. 从培养瓶中吸出培养基。
  2. 用 5 mL 预热的 DPBS 洗涤细胞。
  3. 向 T-25 培养瓶中加入 5 mL 预热的 PTEC 培养基。
  4. 将培养瓶放回培养箱中。
  5. 每 48 小时更换一次培养基，直到培养瓶达到至少 70% 的汇合度，用于传代或用于实验。

5. PTEC 的传代

  1. 从培养瓶中吸出培养基。向每个 T-25 培养瓶中加入 5 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 °C 下孵育 1 至 2 分钟，以便胰蛋白酶消化。
  2. 细胞分离后，用 5 mL 预热的确定胰蛋白酶抑制剂溶液中和胰蛋白酶。
  3. 重悬 5 次以去除仍附着在培养瓶上的任何细胞。然后，将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，并以 400 g 离心 5 分钟。
  4. 吸出上清液。
    注意：在此处停止冷冻保存 PTEC 并转到该方案。
  5. 每管用 14 mL PTEC 培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移到 T-75 培养瓶中（每个培养瓶 1 管）。
  6. 进行 T 摇动，使细胞均匀分布在培养瓶中。监测细胞并每 48 小时更换一次培养基。

6. 冻存 PTEC

  1. 在步骤 5.6. 之后，将细胞沉淀重悬于每 15 mL 锥形管的 2 mL 10% DMSO 和 90% 低葡萄糖 PTEC 培养基中，并将 1 mL 转移到一个冻存管中。
  2. 将冻存管转移到允许温度控制冷冻的细胞冷冻容器中，并将容器置于 -80 °C 冰箱中 24 小时。在 -80 °C 下 24 小时后，将冻存管转移到液氮罐中长期储存。

7. 解冻 PTEC

  1. 在 37 °C 水浴中从 -80 °C 解冻样品瓶。不要在室温 （RT） 下解冻。样品瓶部分解冻后（应该可以看到一小块冰），将 1 mL 细胞悬液加入装有 10 mL 预热 PTEC 培养基的 15 mL 锥形管中。
  2. 将细胞悬液以 400 g 离心 5 分钟。吸出上清液，将细胞重悬于 5 mL 预热的低葡萄糖 PTEC 培养基中。
  3. 将 5 mL 细胞悬液转移到 T-25 培养瓶中，然后进行 T 摇动，使细胞均匀分布在培养瓶中。从这里开始，按照第 4 节进行媒体更改。

8. 用 I 型胶原基质涂覆 MPS 设备

  1. 从 MPS 设备中吸出 PBS，然后从包装中取出设备。用医用湿巾将设备擦干，并根据需要贴上标签。
  2. 将 MPS 设备放入 15 厘米的圆形培养皿中，并将其置于 4 °C 中直至准备好使用。将医用湿巾放在培养皿底部，以防止受潮 MPS 设备。
  3. 将装有 22 G Luer-Lok 针钝器的 1 mL 注射器保持在 -20 °C，直到用于胶原蛋白 I 注射。
  4. 对于需要填充的每 4 个 MPS 设备，请将一个 15 mL 锥形管放在冰上。每 15 mL 锥形管使用一个 1 mL 注射器，并连接针头钝器。
  5. 在生物安全柜中使用无菌技术，打开 MPS 设备上的所有端口。确保每个螺杆阀顶部的狭缝与端口垂直对齐。
  6. 使用 1 mL 注射器/针头钝器组件，用 1 mL 乙醇将 ECM 腔室冲洗到端口 #1、#3 和 #6 中。吸出乙醇并使其完全蒸发（至少 30 秒），使其不会从端口 #2、#4 和 #5 渗透到 MPS 设备中。
  7. 将 MPS 设备放回 4 °C，并将 PTEC 培养基、M199 和 1 N NaOH 置于冰上。
  8. 根据 表 1 （根据需要缩放）计算大约四个 MPS 装置的 1 mL I 型胶原混合物的基质组成。在生物安全柜中，根据上述计算，按此顺序混合 PTEC 培养基、M199 和 1 N NaOH，并将所有试管保持在冰上。
  9. 用 1 mL 注射器小心地将 I 型胶原蛋白原液添加到预制混合物中。通过上下吹打混合胶原蛋白混合物，直到混合物具有稳定的鲑鱼橙粉色。
  10. 短暂离心试管以收集底部的溶液。确保溶液中没有气泡。
  11. 将预冷的 1 mL 注射器和 22 G Luer-Lok 针头钝器和 MPS 装置放入生物安全柜中并置于冰上。将胶原蛋白混合物填充到预冷的 1 mL 注射器中，并完全避免气泡。
  12. 非常缓慢和轻柔地将胶原蛋白溶液注射到冷藏设备室的端口 #1、#3 和 #6 中。垂直握住设备，使端口朝下，让气泡从端口 #2、#4 和 #5 中向上和流出。
    注意：端口 #2、#4 和 #5 处应有一滴胶原蛋白混合物，这表明腔室已完全包被。
  13. 取出注射器并将其放回冰上的 15 mL 试管中。转动端口 #2、#4 和 #5 的螺旋阀以密封填充的芯片，并将芯片放在 4 °C 的培养皿上 30 分钟。
  14. 30 分钟后，以无菌方式将带有培养皿的芯片转移到生物安全柜中，并将芯片均匀地单独摊开，以便它们均匀加热。
  15. 在每个培养皿中放入湿润的医用湿巾（以防止胶原蛋白 I 基质变干并从 MPS 设备壁上剥落），并用半透明的柔性密封膜密封培养皿。让胶原蛋白在 RT 下聚合过夜。

9. 在 MPS 设备中以 IV 型胶原蛋白作为 ECM 创建管腔

  1. 用超纯（1 型）水和纯乙醇冲洗试管，然后对整个管线进行高压灭菌，对 C-flex 管进行消毒。
  2. 在生物安全柜中，打开 I 型胶原蛋白填充 MPS 装置的所有端口（螺阀将与端口垂直），并取下从端口 #1、#3 和 #6 伸出的电线，形成管腔。
  3. 将金属耦合器插入端口 #1、#3 和 #6。
  4. 在 PTEC 培养基中制备 10 mL 的 5 μg/mL IV 型胶原溶液。
  5. 将 24 英寸的无菌 C-flex 管插入从端口 #1、#3 和 #6 突出的金属钝头上。
  6. 用 0.5 mL IV 型胶原溶液填充装有 22 G Luer-Lok 针钝的 1 mL 注射器。
  7. 将装满的注射器放在注射器输液泵上，并将端口 #1 的管道连接到注射器。对端口 #3 和 #6 重复此步骤。
  8. 使用注射泵，以 10 μL/min 的速率将 IV 型胶原蛋白溶液输送到 MPS 端口中，持续 30 分钟。输注端口后，让胶原蛋白在 37 °C 培养箱中凝固过夜，然后在第二天使用。
    注：IV 型胶原包被的 MPS 装置可在 4 °C 下储存长达 1 周。

10. 在 MPS 设备中植入初级 PTEC

  1. 在显微镜下检查 MPS 设备，以确保管腔已正确形成。
  2. 将带有 22 G 针头的预消毒 5 mL 注射器放入含有 5 mL 乙醇的 15 mL 试管中。
  3. 按照步骤 5.1 从 T-25 培养瓶中获取 15 mL 锥形管中的 PTEC 细胞沉淀。更改为 5.3。向细胞沉淀中加入 80 μL PTEC 培养基并轻轻重悬。
  4. 将细胞悬液转移至 1.5 mL 微管中。
  5. 从培养箱中取出装有 MPS 装置的培养皿，并将其放入生物安全柜中。关闭端口 #2、#4 和 #5，然后将螺杆阀水平旋转至端口。
  6. 轻轻轻弹含有 PTEC 的试管以重悬细胞。用细胞填充注射器，然后将针头插入离螺阀端口最远的注射口。
  7. 小心地向下推注射器的柱塞以注射细胞。在显微镜下观察注射后的细胞。
    注意：细胞应该穿过管腔。如果在管腔中没有观察到细胞，请检查针头是否已牢固插入注射口，并在需要时重新插入针头。装满细胞的注射器可以填充设备上的所有三个管腔。
  8. 使用其他两个端口继续细胞注射。注射后，关闭端口 #2、#4 和 #5，然后将 MPS 设备放回 37 °C 培养箱中。保持板水平，使细胞不会因重力而移出管腔。
  9. 对于其他 MPS 设备，在排空注射器后用乙醇清洗注射器，并在吸取细胞之前用 DPBS 清洗。
  10. 让 MPS 设备静置一夜，不受干扰。
  11. 第二天，将 MPS 设备连接到注射泵。
  12. 在生物安全柜中，用 PTEC 培养基填充 5 mL 注射器。然后，将 22 G Luer-Lok 尖端钝器与连接到注射器的 24 英寸截面 C-flex 管安装在一起。
  13. 将装有 PTEC 介质的注射器放入注射泵中。灌注管路以去除任何气泡。
  14. 将灌注管路连接到端口 #1、#3 和 #6，然后将螺杆阀转到垂直位置以引入介质流。
  15. 将注射泵流速设置为 0.5 μL/min。将装有 MPS 装置的培养皿放回 37 °C 培养箱中，并在开始实验前在连续培养基灌注下让细胞形成小管（在 5 至 7 天内）。

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结果

2D 培养中分离的原代 PTEC 的形态和汇合度随时间的变化
从肾皮层分离后，在第一次更换培养基之前，让 PTECs 不受干扰地生长至少 48 小时。培养细胞后大约一周，小批量的 PTEC 应出现在整个培养瓶中，具有均匀的上皮、鹅卵石状形态（图 1A、B）。根据来自不同供体的 PTEC 的生长速率，培养 10 天后（平均）细胞汇合度应达...

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讨论

MPS 或器官芯片技术提供了一个高度相关的 体外 平台，可以概括人类生理学的关键方面，从而减少药物开发和毒理学评估中对动物模型的依赖。最近，FDA 现代化法案 2.0 （2022） 允许在研究性新药申请中包括 MPS 等替代品29。该协议详细介绍了 PTEC 从人类供体皮质组织中解离及其随后在 MPS 平台中的使用的标准作程序，旨在模拟人类近端小管功能并?...

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披露声明

作者声明他们没有与本研究相关的利益冲突或财务披露。

致谢

这项工作的部分内容得到了 NASA 合同 80ARC023CA001、国家促进转化科学中心 （NCATS） （U2CTR004867、UH3TR000504、UG3TR002158）、NCATS 和太空科学促进中心 （CASIS） （UG3TR002178）、国家环境健康科学研究所 （NIEHS） （P30ES00703）、国家普通医学科学研究所 （T32GM007750） 的支持，这是西北肾脏中心对肾脏研究的无限制礼物研究所和华盛顿大学药学院（Ji-Ping Wang 奖和 Bradley 奖学金）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific14-959-53A
3D microphysiological DeviceNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagenase, Type IV, powderThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Defined Trypsin InhibitorThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, powderThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o GlucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidneyNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Incubating Orbital ShakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Internal Thread Cryogenic VialsCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inchesInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Small Benchtop CentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metal Coupler (blunt)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Freezing ContainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Original model discontinued 
Nunc Non-treated Flasks, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, SterileGreiner Bio-One607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")Cole-Parmer06422-00
Single edge razor blade (sterile)BiosealKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Sodium HydroxideMilliporeSigmaS8045
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermoFisher Scientific567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm VentedGenesee Scientific25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Type I collagen, rat tailCorning354236
Type IV Collagen, MouseCorning354233

参考文献

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