JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי לעיבוד כליות אנושיות שלמות כדי לבודד ולתרבית תאי אפיתל של צינורית פרוקסימלית ראשונית של הכליה ויישום תאים אלה בפלטפורמה תלת מימדית, מיקרופלואידית, מיקרופיזיולוגית כדי לסכם את הצינורית הפרוקסימלית הכלייתית.

Abstract

מחלת כליות משפיעה על למעלה מ-850 מיליון אנשים ברחבי העולם, כולל 37 מיליון אמריקאים. גורמי סיכון למחלת כליות כרונית כוללים השפעות סביבתיות, נטיות גנטיות, מצבים רפואיים קיימים והיסטוריה של פגיעה כלייתית חריפה. גורמים אלה לרוב לוקחים חודשים או שנים להתפתח, מה שמסבך מחקרי אורך של אטיולוגיה ופתופיזיולוגיה של מחלות. יש צורך במודלים מתקדמים של כליות כדי לשפר את ההבנה שלנו לגבי מנגנוני מחלה ולשפר את חיזוי הרעילות הכולית בפיתוח תרופות. תאי אפיתל צינורית פרוקסימליים (PTECs) בכליה ממלאים תפקיד קריטי בפינוי קסנוביוטי ורעלנים, כמו גם בספיגה חוזרת של חומרים מזינים חיוניים. הראינו בעבר כי ניתן להשתמש בפלטפורמות תלת מימדיות (3D) של מערכת מיקרופיזיולוגית (MPS), המאוכלסות ב-PTECs ראשוניים מבודדים, כדי לחקור אינטראקציות עם תרופות בכליות, להעריך רעילות כליות של תרכובות ולחזות פינוי תרופות. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לבידוד וטיפוח PTECs ראשוניים מכליות אנושיות שלמות ולזריעתם לתוך פלטפורמת MPS תלת מימדית המחקה פיזיולוגיה של כליות in vivo . פרוטוקול זה מאפשר מחקרים ארוכי טווח התומכים בכדאיות PTEC, מורפולוגיה פיזיולוגית וקיטוב תפקודי של חלבוני טרנספורטר מרכזיים במכשירי MPS למשך עד 6 חודשים.

Introduction

הכליה ממלאת תפקיד קריטי בפינוי וסילוק של מגוון רחב של קסנוביוטיקה, רעלנים ותרכובות אנדוגניות מהגוף. זה מושג על ידי סינון דם להסרת פסולת ועל ידי ויסות מאזן האלקטרוליטים, רמות הנוזלים וה-pH. כל כליה אנושית מכילה כמיליון נפרונים, היחידות המבניות והתפקודיות של הכליה1. בתוך נפרונים אלה, תאי אפיתל מיוחדים בצינורות הפרוקסימליים, הידועים כתאי אפיתל צינוריות פרוקסימליים (PTECs), אחראים לספיגה חוזרת של מולקולות חיוניות כגון גלוקוז, חומצות אמינו ויונים, כמו גם להפרשת מצעי תרופות וחומרים שעלולים להיות רעילים לשתן 2,3,4. במקרים מסוימים, PTECs עשויים גם לספוג מחדש תרכובות מהשתן בחזרה לזרם הדם4. בשל תפקידם הקריטי באינטראקציות בין תרופות ורעלנים, PTECs ראשוניים המבודדים מכליות אנושיות מספקים כלי רב ערך לחקר אינטראקציות בין תרופות לכליות (DDIs) ולהערכת רעילות הכליות של תרכובות.

רעילות כליות הנגרמת על ידי תרופות מהווה אתגר קליני משמעותי, מכיוון שהיא עלולה להוביל לפגיעה כלייתית חריפה ולמחלת כליות כרונית5. לכן, הבנה מעמיקה יותר של הפיזיולוגיה של הצינורית הפרוקסימלית הכלייתית חיונית לחיזוי ואפיון מדויק של הפוטנציאל הנפרוטוקסי של תרופות ורעלים. למודלים מסורתיים במבחנה, הכוללים קווי תאי כליה אימורטליים (למשל, RPTEC-TERT1, HK-2), יש מגבלות בחיקוי המבנה והתפקוד המורכבים של הצינוריות הפרוקסימליות האנושיות6, הפועלות תחת זרימה למינרית דינמית (עם מספר ריינולדס נמוך) ומטריצה חוץ-תאית אחידה (ECM) in vivo 7,8. בנוסף, מודלים דו-ממדיים מסורתיים (2D) לרוב אינם מצליחים לבטא פונקציונלית מובילי כליות עיקריים (למשל, טרנספורטר אניונים אורגני 1 ו-3 (OAT1 ו-OAT3), טרנספורטר קטיון אורגני 2 (OCT2)) עקב פירוק והפנמה מהירים של חלבונים אלה 6,9,10,11 . מודלים של בעלי חיים, למרות שהם אינפורמטיביים, עשויים שלא לשכפל באופן מלא את הפיזיולוגיה הכלייתית האנושית ולעתים קרובות חסרי יכולת תרגום עקב הבדלי מינים בביטוי ובפעילות הטרנספורטר12. לדוגמה, mOct1 מתבטא באופן בסיסי ב-PTECs של עכברים, בעוד שבבני אדם, ביטוי חלבון הממברנה של OCT1 בכליה אינו ניתן לגילוי13,14.

התקדמות במערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS) וטכנולוגיות איבר על שבב אפשרו לחוקרים לפתח מודלים במבחנה המחקים מקרוב את הארכיטקטורה התלת מימדית (3D) ותנאי זרימת הנוזלים הדינמיים של איברים אנושיים15. הקבוצה שלנו אפיינה בעבר שני מודלים של MPS עם PTECs16,17, והשתמשה במודלים אלה כדי לערוך מחקרי רעילות 18,19,20 ולחזות במדויק את נטיית התרופות 21. השימוש ב-PTECs ראשוניים במודלים אלה מספק יתרונות משמעותיים בשל יכולתם לשמור על מאפיינים פונקציונליים שנצפו in vivo.

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים לבידוד של PTECs אנושיים מכליה אנושית שלמה שהושגה מתורם שנפטר באמצעות ארגון רכש איברים מאושר על ידי הרשת המאוחדת לשיתוף איברים (UNOS) ויישום PTECs אנושיים מתורבתים אלה בתוך פלטפורמת MPS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל העבודה בוצעה בהתאם להנחיות הטיפול ברקמות אנושיות של אוניברסיטת וושינגטון. תורמים מתאימים עומדים בדרישות הבאות: פחות מ-36 שעות של זמן איסכמי קר (CIT), ללא היסטוריה ידועה של מחלות כליות, דיאליזה או כל מצב רפואי אחר (למשל, סוכרת מסוג 1 או 2, הפטיטיס B, הפטיטיס C, נגיפי כשל חיסוני אנושי (HIV), דלקת קרום המוח ויראלית/חיידקית, זיהום סטפילוקוקוס זהוב עמיד למתיצילין, עגבת, אלח דם או Covid-19). כל הכליות האנושיות ששימשו במחקר זה מקורן ב-OPO שאושר על ידי UNOS.

1. הכנת ארון בטיחות ביולוגית

  1. רססו את מכסה המנוע עם 70% אתנול. טהר את כל המשטחים והפריטים בתוך הארון כדי ליצור סביבה סטרילית.
  2. הניחו רפידות סופגות כחולות. בצע את כל עבודת הרקמות על רפידות אלה.
  3. ודא שהציוד הדרוש זמין בארון הבטיחות הביולוגית ומעוקר כראוי (סכיני גילוח, קצות פיפטה סרולוגיים, אקדח פיפטה סרולוגי, מסנני תאים של 100 מיקרומטר, קצות p1000, מיקרופיפטה 1000 מיקרוליטר, כלי תרבית עגולים 15 ס"מ וצינורות חרוטיים).

2. הכנה לעיבוד מקדים של הכליה

  1. הכינו תמיסת עיכול כליות על ידי הוספת 0.75 מ"ג/מ"ל קולגנאז IV + 0.75 מ"ג/מ"ל dispase II לתוך תמיסת מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco עם סידן ומגנזיום. מסננים את התמיסה דרך מסנן ממברנה סטרילי של 0.2 מיקרומטר.
    הערה: עבור כליה אנושית בוגרת שלמה, נדרשים כ-14 צינורות חרוטיים של 50 מ"ל, שכל אחד מהם מכיל ~35 מ"ל של תמיסת עיכול (סה"כ 500 מ"ל).
  2. הכן את מדיית PTEC על ידי הוספת 4.425 גרם של אבקת Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 של Dulbecco ללא גלוקוז, 0.5 גרם אבקת D-גלוקוז, 0.6 גרם אבקת נתרן ביקרבונט, 5 מ"ל של תוסף אינסולין-טרנספרין-סלניום 100x (מכיל 1000 מ"ג/ליטר אינסולין, 550 מ"ג/ליטר טרנספרין ו-0.67 מ"ג/ליטר נתרן סלניט), 0.5 מ"ל של 50 מיקרומטר הידרוקורטיזון, ו-5 מ"ל של תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייקוטית 100x (המכילה 10000 יחידות/מ"ל של פניצילין G נתרן, 10000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין סולפט, ו-25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B במי מלח 0.85%) לתוך 500 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים (סוג 1). סנן את המדיה דרך מסנן ממברנה סטרילי של 0.2 מיקרומטר. הפשירו סרום בקר עוברי (FBS) והכינו 10 מ"ל ב-14 צינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
  3. אסוף ותייג סט נוסף של צינורות חרוטיים של 50 מ"ל. בשלב זה, ודא שיש 3 סטים של 14 צינורות של 50 מ"ל.
  4. יש לחמם מראש את שייקר המסלול ל-37 מעלות צלזיוס.

3. בידוד PTECs מכל הכליה

  1. בטכניקה סטרילית, הנח את מיכל המשלוח עם דגימת הרקמה לתוך מכסה המנוע. הוציאו את השקית מהקופסה ורססו את החלק החיצוני באתנול 70% לפני הכנסתה למכסה המנוע.
  2. מניחים את הכליה על צלחת תרבות עגולה בגודל 15 ס"מ. שאפו/השליכו את חומרי ההדפסה שנותרו.
  3. הסר את השומן שמסביב ואת קפסולת הכליה באמצעות סכיני גילוח סטריליים. יש לקלוע בעדינות את קפסולת הכליה כדי ליצור חריץ במרכז.
  4. בעזרת פינצטה, משוך את הקפסולה והשתמש בסכיני גילוח כדי לפרוס את כל השומן המחובר לכליה. השליכו גם את הקפסולה וגם את השומן לכלי תרבות נוסף של 15 ס"מ.
  5. הפרד את קליפת המוח (בעובי ~1 ס"מ) מהמדולה. השליכו את המדולה.
    הערה: לקליפת המוח צבע חום-צהוב בהיר יותר בהשוואה למדולה.
  6. בעזרת סכין גילוח, טוחנים את הרקמה ל-<1 ס"מ3 חלקים עד למראה דמוי slurry.
  7. הוסף כמות קטנה של מאגר עיכול כליות לתבשיל והעביר את התרחיץ לסט הראשון של צינורות 50 מ"ל המכילים 35 מ"ל של תמיסת עיכול הכליות. מחלקים באופן שווה ואל תחרוג מנפח כולל של 45 מ"ל לכל צינור.
  8. העבירו את כל הצינורות לשייקר המסלול של 37 מעלות צלזיוס ודגרו למשך 30 דקות במהירות הגבוהה ביותר שאינה גורמת לצינורות לנשור. העבירו את הצינורות בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית לאחר ריסוסם ב-70% אתנול.
  9. הפוך את הצינורות כדי להתערבב ואפשר לחתיכות הרקמה הגדולות יותר להתיישב לתחתית. העבירו כמה שיותר מהתמיסה לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל המכילים 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) מבלי להעביר רקמה שלמה. מחלקים באופן שווה ואל תחרוג מנפח כולל של 45 מ"ל לכל צינור.
  10. צנטריפוגה את הצינורות ב -200 גרם למשך 7 דקות. החזר את הצינורות לארון הבטיחות הביולוגית לאחר ריסוסם באתנול 70%.
  11. שאפו בזהירות את הסופרנטנט. הוסף 10 מ"ל של מדיה PTEC לכל צינור והשהה מחדש את הכדורים.
  12. מסננים את מתלי התאים המתקבלים דרך מסנני תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינורות חרוטיים חדשים של 50 מ"ל.
  13. צנטריפוגה התא המתקבל מסנן ב -400 גרם למשך 5 דקות. החזר את הצינורות לארון הבטיחות הביולוגית לאחר ריסוסם באתנול 70%.
  14. שוטפים את הכדורים עם 5 מ"ל DPBS. השעו מחדש את הכדורים באמצעות קצה p1000.
  15. צנטריפוגה את הצינורות ב -400 גרם למשך 5 דקות. העבר את הצינורות בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית לאחר ריסוסם באתנול 70%, ולאחר מכן שאב את הסופרנטנטים.
  16. חזור על שלב 3.15 פעמיים נוספות בסך הכל שלוש כביסות. לאחר מכן, השעו מחדש כדורי תאים עם 15 מ"ל של מדיה PTEC וצלחו את התאים על צלוחיות T-75 סטריליות של תרבית תאים.
  17. סמן את הצלוחיות כראוי ואפשר לתאים לגדול באינקובטור סטרילי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. אפשר ל-PTECs לצמוח ללא הפרעה בחממה במשך 48 שעות לפני החלפת המדיה הראשונה.

4. שינויים במדיה

  1. שאפו מדיה מהצלוחיות.
  2. שטפו תאים עם 5 מ"ל DPBS מחומם מראש.
  3. הוסף 5 מ"ל של מדיית PTEC מחוממת מראש לצלוחיות T-25.
  4. החזירו את הבקבוק לחממה.
  5. החלף את המדיה כל 48 שעות עד שהבקבוק מגיע לפחות ל-70% מפגש למעבר או לשימוש בניסויים.

5. מעבר PTECs

  1. שאפו מדיה מהבקבוקון. הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA שחומם מראש לכל בקבוק T-25 ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1 עד 2 דקות כדי לאפשר עיכול טריפסין.
  2. לאחר ניתוק התאים, נטרל טריפסין עם 5 מ"ל של תמיסת מעכב טריפסין מוגדרת שחוממה מראש.
  3. השעיה מחדש 5 פעמים כדי לעקור את כל התאים שעדיין מחוברים לבקבוק. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 גרם למשך 5 דקות.
  4. שאפו החוצה את הסופרנטנט.
    הערה: עצור כאן כדי לשמר בהקפאה PTECs ולעבור לפרוטוקול זה.
  5. השעו מחדש כדורי תאים עם 14 מ"ל של מדיה PTEC לכל צינור. העבר את מתלי התאים לצלוחיות T-75 (צינור אחד לכל בקבוק).
  6. בצע ניעור T כדי לפזר תאים על פני הבקבוק באופן שווה. עקוב אחר תאים והחלף את המדיה כל 48 שעות.

6. שימור PTECs בהקפאה

  1. לאחר שלב 5.6., השעו מחדש את כדורי התא ב-2 מ"ל של 10% DMSO ו-90% גלוקוז נמוך PTEC מדיה עבור כל צינור חרוטי של 15 מ"ל, והעבירו 1 מ"ל לקריוביאל אחד.
  2. העבירו את הקריוביאלים למיכל הקפאת תאים המאפשר הקפאה מבוקרת טמפרטורה והניחו את המיכל במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, העבירו קריובילים למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

7. הפשרת PTECs

  1. הפשירו את הבקבוקון מ-80 מעלות צלזיוס באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס. אין להפשיר בטמפרטורת החדר (RT). לאחר שהבקבוקון הופשר חלקית (צריכה להיות חתיכת קרח קטנה גלויה), הוסף 1 מ"ל של תרחיף תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיה PTEC מחוממת מראש.
  2. סובב את מתלה התאים ב -400 גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-5 מ"ל של מדיה PTEC נמוכה עם גלוקוז נמוך שחוממה מראש.
  3. העבירו את תרחיף התאים של 5 מ"ל לבקבוק T-25 ובצעו טלטול T כדי לפזר תאים על פני הבקבוק באופן שווה. מכאן, עקוב אחר סעיף 4 לשינויים במדיה.

8. ציפוי מכשיר MPS במטריצת קולגן מסוג I

  1. שאב את ה-PBS מהתקן MPS והסר את ההתקן מהחבילה. נגב את המכשיר יבש במגבונים רפואיים ותייג אותו כרצונך.
  2. הנח את מכשיר ה-MPS בכלי תרבית עגול בגודל 15 ס"מ והנח אותו ב-4 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש. שמור מגבונים רפואיים בתחתית הכלי כדי למנוע לחות במכשיר MPS.
  3. שמור מזרקים של 1 מ"ל עם 22 גרם קהות מחט Luer-Lok מחוברים ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש להזרקת קולגן I.
  4. על כל ארבעה התקני MPS שצריך למלא, שמור צינור חרוטי אחד של 15 מ"ל על קרח. השתמש במזרק אחד של 1 מ"ל כשהמחט קהה מחוברת לכל צינור חרוטי של 15 מ"ל.
  5. באמצעות טכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית, פתח את כל היציאות במכשיר ה-MPS. ודא שהחריצים בחלק העליון של כל שסתום בורג מיושרים אנכית עם היציאה.
  6. בעזרת מכלול קהה מזרק/מחט של 1 מ"ל, שטוף את תא ה-ECM עם 1 מ"ל אתנול ליציאות #1, #3 ו-#6. שאפו החוצה את האתנול ואפשרו לו להתאדות לחלוטין (לפחות 30 שניות) כך שהוא לא יחדור למכשיר ה-MPS מיציאות #2, #4 ו-#5.
  7. החזר את התקן ה-MPS ל-4 מעלות צלזיוס, ושמור את מדיית PTEC, M199 ו-1 N NaOH על קרח.
  8. חשב את הרכב המטריצה עבור 1 מ"ל של תערובת הקולגן מסוג I עבור כארבעה התקני MPS לפי טבלה 1 (קנה מידה לפי הצורך). בארון הבטיחות הביולוגית, ערבבו את מדיית PTEC, M199 ו-1 N NaOH בסדר זה, לפי החישובים לעיל, ושמרו את כל הצינורות על קרח.
  9. הוסף בזהירות את ציר הקולגן מסוג I עם מזרק של 1 מ"ל לתערובת המוכנה מראש. ערבבו את תערובת הקולגן על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, עד לקבלת צבע כתום-ורוד סלמון יציב.
  10. צנטריפוגה קצרה של הצינור כדי לאסוף את התמיסה בתחתית. ודא שאין בועות בתמיסה.
  11. הנח את המזרקים המצוננים מראש של 1 מ"ל עם קהות מחט 22 G Luer-Lok ואת מכשיר ה-MPS לתוך ארון הבטיחות הביולוגית ועל הקרח. מלאו את המזרק המקורר מראש בנפח 1 מ"ל בתערובת הקולגן והימנעו לחלוטין מבועות.
  12. יש להזריק לאט ובעדינות את תמיסת הקולגן ליציאות #1, #3 ו-#6 של תאי ההתקן המצוננים. החזק את המכשיר אנכית כשהיציאות פונות כלפי מטה כדי לאפשר לבועות אוויר לזרום למעלה והחוצה מיציאות #2, #4 ו-#5.
    הערה: צריכה להיות טיפה של תערובת הקולגן ביציאות #2, #4 ו-#5, מה שמצביע על כך שהתאים מצופים במלואם.
  13. הסר את המזרק והנח אותו בחזרה בצינור 15 מ"ל על קרח. סובב את שסתום הבורג עבור יציאות #2, #4 ו-#5 כדי לאטום את השבב המלא ולהניח את השבב על צלחת התרבות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  14. לאחר 30 דקות, העבירו את הצ'יפס עם המנה לארון הבטיחות הביולוגית בצורה סטרילית ופזרו את הצ'יפס באופן שווה ונפרד כך שהם יתחממו בצורה אחידה.
  15. הכניסו מגבון רפואי לח לכל צלחת (כדי למנוע ממטריצת הקולגן I להתייבש ולהתקלף מדפנות מכשיר ה-MPS) ואטמו את הכלים עם סרט איטום גמיש שקוף למחצה. אפשר לקולגן להתפלמר למשך הלילה ב-RT.

9. יצירת לומן צינורי עם קולגן מסוג IV כ-ECM במכשיר MPS

  1. עקר צינורות C-flex על ידי שטיפת הצינורות במים טהורים במיוחד (סוג 1) ואתנול טהור, ולאחר מכן חיטוי כל קו הצינורות.
  2. בארון הבטיחות הביולוגית, פתח את כל היציאות של מכשיר MPS מלא קולגן מסוג I (שסתום הבורג יהיה אנכי עם היציאות) והסר את החוט הבולט מיציאות #1, #3 ו-#6 כדי ליצור את הלומן הצינורי.
  3. הכנס את מצמדי המתכת ליציאות #1, #3 ו-#6.
  4. הכן תמיסה של 10 מ"ל של 5 מיקרוגרם/מ"ל קולגן מסוג IV במדיית PTEC.
  5. הכנס 24 אינץ' של צינורות C-flex סטריליים על קהות המתכת הבולטות מיציאות #1, #3 ו-#6.
  6. מלא מזרקים של 1 מ"ל המצוידים במחט קהה 22-G Luer-Lok עם 0.5 מ"ל של תמיסת קולגן מסוג IV.
  7. הנח את המזרק המלא על משאבת עירוי מזרק וחבר את הצינור מיציאה #1 למזרק. חזור על שלב זה עבור יציאות #3 ו- #6.
  8. באמצעות משאבת המזרק, העבירו את תמיסת הקולגן מסוג IV ליציאות MPS בקצב של 10 מיקרוליטר לדקה למשך 30 דקות. לאחר החדרת היציאות, הניחו לקולגן להתמצק באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני השימוש בהם למחרת.
    הערה: ניתן לאחסן התקני MPS מצופים קולגן מסוג IV עד שבוע אחד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

10. זריעת PTECs ראשוניים בהתקן MPS

  1. בדוק את התקן ה-MPS מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהלומן נוצר כהלכה.
  2. הנח מזרק מעוקר מראש של 5 מ"ל עם מחט 22 גרם לתוך צינור של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל אתנול.
  3. השג גלולת תא PTEC בצינור חרוטי של 15 מ"ל מבקבוק T-25 על ידי ביצוע שלבים 5.1. עד 5.3. הוסף 80 מיקרוליטר של מדיית PTEC לגלולת התא והשהה מחדש בעדינות.
  4. העבירו את מתלה התא למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל.
  5. הוציאו את הצלחת המכילה את מכשיר ה-MPS מהחממה והניחו אותה בארון הבטיחות הביולוגית. סגור את יציאות #2, #4 ו-#5, וסובב את שסתום הבורג אופקית ליציאות.
  6. החליקו בעדינות את הצינור המכיל PTEC כדי להשעות מחדש את התאים. מלאו את המזרק בתאים והכנסו את המחט ליציאת ההזרקה הרחוקה ביותר מיציאות שסתומי הבורג.
  7. דחף בזהירות את הבוכנה של המזרק כדי להזריק את התאים. דמיין את התאים לאחר ההזרקה תחת מיקרוסקופ.
    הערה: תאים צריכים לנוע דרך הלומן. אם לא נצפו תאים בלומן, בדוק אם המחט הוכנסה היטב לפתח ההזרקה והכנס מחדש את המחט במידת הצורך. מזרק מלא של תאים יכול למלא את כל שלושת הלומנים במכשיר.
  8. המשך בהזרקות תאים עם שתי היציאות האחרות. לאחר ההזרקות, סגור את יציאות #2, #4 ו-#5 והכנס את מכשיר ה-MPS בחזרה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. שמור על הצלחת מפולסת כדי שהתאים לא יזוזו מהלומן על ידי כוח הכבידה.
  9. עבור התקני MPS נוספים, שטפו את המזרק באתנול לאחר ריקונו ושטפו עם DPBS לפני שאיבת תאים.
  10. אפשר להתקני MPS לשבת למשך הלילה ללא הפרעה.
  11. למחרת, חבר את מכשירי ה-MPS למשאבות המזרק.
  12. בארון הבטיחות הביולוגית, מלאו מזרקים של 5 מ"ל במדיית PTEC. לאחר מכן, התקן 22 G Luer-Lok tip עם קטע 24 אינץ' של צינורות C-flex המחובר למזרקים.
  13. הנח את המזרקים הטעונים במדיה של PTEC לתוך משאבת המזרק. יש להניח את הקווים כדי להסיר בועות אוויר.
  14. חבר את קווי הצינורות המוכנים ליציאות #1, #3 ו-#6 וסובב את שסתומי הברגים למצב אנכי כדי להכניס זרימת מדיה.
  15. הגדר את קצב זרימת משאבת המזרק ל-0.5 מיקרוליטר לדקה. הנח את המנה עם מכשיר ה-MPS בחזרה לתוך החממה של 37 מעלות צלזיוס ואפשר לתאים ליצור צינוריות (תוך 5 עד 7 ימים) תחת זלוף מדיה רציף לפני תחילת הניסוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מורפולוגיה ומפגש של PTECs ראשוניים מבודדים לאורך זמן בתרבית דו-ממדית
לאחר הבידוד מקליפת הכליה, PTECs הורשו לגדול ללא הפרעה לפחות 48 שעות לפני החלפת המדיה הראשונה. כשבוע לאחר תרבית התאים, קבוצות קטנות של PTECs אמורות להופיע ברחבי בקבוק התרבית עם מורפולוגיה אפיתל אחידה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

MPS, או טכנולוגיות איבר על שבב, מציעות פלטפורמה חוץ גופית רלוונטית ביותר לסיכום היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה האנושית, ובכך להפחית את ההסתמכות על מודלים של בעלי חיים בפיתוח תרופות והערכות טוקסיקולוגיות. לאחרונה, חוק המודרניזציה של ה-FDA 2.0 (2022) איפשר הכללה של MPS, בין שאר ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים או גילויים פיננסיים הרלוונטיים למחקר זה.

Acknowledgements

חלקים מעבודה זו נתמכו על ידי החוזה של נאס"א 80ARC023CA001, המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), במשותף על ידי NCATS והמרכז לקידום המדע בחלל (CASIS) (UG3TR002178), המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) (P30ES00703), המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (T32GM007750), תרומה בלתי מוגבלת ממרכזי הכליות הצפון-מערביים לחקר הכליות ובית הספר לרוקחות באוניברסיטת וושינגטון (פרס ג'י-פינג וואנג ומלגת בראדלי).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific14-959-53A
3D microphysiological DeviceNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagenase, Type IV, powderThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Defined Trypsin InhibitorThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, powderThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o GlucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidneyNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Incubating Orbital ShakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Internal Thread Cryogenic VialsCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inchesInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Small Benchtop CentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metal Coupler (blunt)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Freezing ContainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Original model discontinued 
Nunc Non-treated Flasks, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, SterileGreiner Bio-One607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")Cole-Parmer06422-00
Single edge razor blade (sterile)BiosealKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Sodium HydroxideMilliporeSigmaS8045
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermoFisher Scientific567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm VentedGenesee Scientific25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Type I collagen, rat tailCorning354236
Type IV Collagen, MouseCorning354233

References

  1. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  2. Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational study. BMC Nephrol. 21, 108(2020).
  3. Wang, K., Kestenbaum, B. Proximal tubular secretory clearance. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (8), 1291-1296 (2018).
  4. Yin, J., Wang, J. Renal drug transporters and their significance in drug-drug interactions. Acta Pharm Sin B. 6 (5), 363-373 (2016).
  5. Connor, S., Roberts, R. A., Tong, W. Drug-induced kidney injury: challenges and opportunities. Toxicol Res (Camb). 13 (4), tfae119(2024).
  6. Meijer, T., et al. Characterization of organic anion and cation transport in three human renal proximal tubular epithelial models. Cells. 13 (12), 1008(2024).
  7. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 97, 4-27 (2016).
  8. Miceli, C., et al. Fluid flow-induced shear stress controls the metabolism of proximal tubule kidney epithelial cells through primary cilium-dependent lipophagy and mitochondria biogenesis. Autophagy. 16 (12), 2287-2288 (2020).
  9. Tsang, Y. P., Hao, T., Mao, Q., Kelly, E. J., Unadkat, J. D. Dysregulation of the mRNA expression of human renal drug transporters by proinflammatory cytokines in primary human proximal tubular epithelial cells. Pharmaceutics. 16 (2), 285(2024).
  10. Bajaj, P., et al. Freshly isolated primary human proximal tubule cells as an in vitro model for the detection of renal tubular toxicity. Toxicology. 442, 152535(2020).
  11. Brown, C. D. A., et al. Characterisation of human tubular cell monolayers as a model of proximal tubular xenobiotic handling. Toxicol Appl Pharmacol. 233 (3), 428-438 (2008).
  12. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28 (10), 2432-2438 (2013).
  13. Morse, B. L., et al. Pharmacokinetics of organic cation transporter 1 (OCT1) substrates in Oct1/2 knockout mice and species difference in hepatic OCT1-mediated uptake. Drug Metab Dispos. 48 (2), 93-105 (2020).
  14. Samodelov, S. L., Kullak-Ublick, G. A., Gai, Z., Visentin, M. Organic cation transporters in human physiology, pharmacology, and toxicology. Int J Mol Sci. 21 (21), 7890(2020).
  15. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  16. Weber, E. J., et al. Development of a microphysiological model of human kidney proximal tubule function. Kidney Int. 90 (3), 627-637 (2016).
  17. Chapron, A., et al. An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion. ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).
  18. Adler, M., et al. A quantitative approach to screen for nephrotoxic compounds in vitro. J Am Soc Nephrol. 27 (4), 1015-1028 (2016).
  19. Chang, S., et al. Human liver-kidney model elucidates the mechanisms of aristolochic acid nephrotoxicity. JCI Insight. 2 (22), e95978(2017).
  20. Weber, E. J., et al. Human kidney on a chip assessment of polymyxin antibiotic nephrotoxicity. JCI Insight. 3 (24), e123673(2018).
  21. Imaoka, T., et al. Bridging the gap between in silico and in vivo by modeling opioid disposition in a kidney proximal tubule microphysiological system. Sci Rep. 11 (1), 21356(2021).
  22. Van Ness, K. P., Chang, S., Weber, E. J., Zumpano, D., Eaton, D. L., Kelly, E. J. Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity. Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).
  23. Lidberg, K. A., et al. Serum protein exposure activates a core regulatory program driving human proximal tubule injury. J Am Soc Nephrol. 33 (5), 949-965 (2022).
  24. Sakolish, C., et al. Technology transfer of the microphysiological systems: a case study of the human proximal tubule tissue chip. Sci Rep. 8 (1), 14882(2018).
  25. Hart, A., et al. Identification of prognostic biomarkers for antibiotic associated nephrotoxicity in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 23 (2), 293-299 (2024).
  26. Lidberg, K. A., et al. Antisense oligonucleotide development for the selective modulation of CYP3A5 in renal disease. Sci Rep. 11 (1), 4722(2021).
  27. Imaoka, T., et al. Microphysiological system modeling of ochratoxin A-associated nephrotoxicity. Toxicology. 444, 152582(2020).
  28. Chapron, B. D., et al. Reevaluating the role of megalin in renal vitamin D homeostasis using a human cellderived microphysiological system. ALTEX. 35 (4), 504-515 (2018).
  29. Adashi, E. Y., O'Mahony, D. P., Cohen, I. G. The FDA modernization act 2.0: drug testing in animals is rendered optional. Am J Med. 136 (9), 853-854 (2023).
  30. Qi, W., Johnson, D. W., Vesey, D. A., Pollock, C. A., Chen, X. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (methods in renal research). Nephrology. 12 (2), 155-159 (2007).
  31. Mihevc, M., Petreski, T., Maver, U., Bevc, S. Renal proximal tubular epithelial cells: review of isolation, characterization, and culturing techniques. Mol Biol Rep. 47 (12), 9865-9882 (2020).
  32. Shaver, C. M., et al. Cellfree hemoglobin augments acute kidney injury during experimental sepsis. Am J Physiol Renal Physiol. 317 (4), F922-F929 (2019).
  33. Sbarbati, R. Separation of human endothelial cells from fibroblasts by centrifugation in Percoll gradients. Biosci Rep. 5 (6), 469-472 (1985).
  34. Horn, P., et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 10 (7), 676-685 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved