JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем оптимизированный протокол обработки цельных почек человека для выделения и культивирования первичных эпителиальных клеток проксимальных канальцев почек и применения этих клеток в трехмерной, микрофлюидной, микрофизиологической платформе для повторения проксимальных канальцев почек.

Аннотация

Заболевание почек затрагивает более 850 миллионов человек во всем мире, в том числе 37 миллионов американцев. Факторы риска развития хронической болезни почек включают влияние окружающей среды, генетическую предрасположенность, сопутствующие заболевания и острое повреждение почек в анамнезе. Для развития этих факторов часто требуются месяцы или годы, что осложняет лонгитюдные исследования этиологии и патофизиологии заболеваний. Передовые модели почек необходимы для улучшения нашего понимания механизмов заболевания и улучшения прогнозирования нефротоксичности при разработке лекарств. Эпителиальные клетки проксимальных канальцев (ПТЭЦ) в почках играют важнейшую роль в клиренсе ксенобиотиков и токсинов, а также в реабсорбции необходимых питательных веществ. Ранее мы продемонстрировали, что трехмерные (3D) платформы микрофизиологических систем (МПС), заполненные изолированными первичными ПТЭК, могут быть использованы для исследования почечных лекарственных взаимодействий, оценки нефротоксичности соединений и прогнозирования клиренса лекарственного средства. В данной работе мы представляем протоколы выделения и культивирования первичных ПТЭК из цельных почек человека и их засеивания в 3D-платформу МПС, которая имитирует физиологию почек in vivo . Этот протокол позволяет проводить долгосрочные исследования, подтверждающие жизнеспособность ПТЭО, физиологическую морфологию и функциональную поляризацию ключевых белков-транспортеров в устройствах МПС на срок до 6 месяцев.

Введение

Почки играют важнейшую роль в выведении и выведении из организма широкого спектра ксенобиотиков, токсинов и эндогенных соединений. Это достигается за счет фильтрации крови для удаления продуктов жизнедеятельности и регулирования электролитного баланса, уровня жидкости и pH. Каждая человеческая почка содержит около миллиона нефронов, структурных и функциональных единиц почки. В этих нефронах специализированные эпителиальные клетки в проксимальных канальцах, известные как эпителиальные клетки проксимальных канальцев (PTECs), отвечают за реабсорбцию незаменимых молекул, таких как глюкоза, аминокислоты и ионы, а также за секрецию фармацевтических субстратов и потенциально токсичных веществ в мочу. В некоторых случаях ПТЭК могут также реабсорбировать соединения из мочи обратно в кровоток4. В связи с их важной ролью во взаимодействии лекарственных препаратов и токсинов, первичные ПТЭЦ, выделенные из почек человека, представляют собой ценный инструмент для изучения почечных лекарственных взаимодействий (ДДП) и оценки нефротоксичности соединений.

Лекарственная нефротоксичность представляет собой значительную клиническую проблему, поскольку она может привести к острому повреждению почек и хроническому заболеванию почек5. Таким образом, более глубокое понимание физиологии проксимальных канальцев почек имеет важное значение для точного прогнозирования и характеристики нефротоксического потенциала лекарственных препаратов и токсинов. Традиционные модели in vitro, включая иммортализированные почечные клеточные линии (например, RPTEC-TERT1, HK-2), имеют ограничения в имитации сложной структуры и функции проксимальныхканальцев человека6, которые функционируют в условиях динамического ламинарного потока (с низким числом Рейнольдса) и однородного внеклеточного матрикса (ВКМ) in vivo 7,8. Кроме того, традиционные двумерные (2D) модели часто не могут функционально экспрессировать основные почечные транспортеры (например, органические анионные транспортеры 1 и 3 (OAT1 и OAT3), органические катионные транспортеры 2 (OCT2)) из-за быстрой деградации и интернализации этих белков 6,9,10,11 . Животные модели, хотя и информативны, могут не полностью воспроизводить физиологию почек человека и часто не поддаются переводу из-за видовых различий в экспрессиии активности транспортеров. Например, mOct1 базолатерально экспрессируется в мышиных PTECs, в то время как у человека экспрессия мембранного белка OCT1 в почках неопределяема13,14.

Достижения в области микрофизиологических систем (МПС) и технологий «органы на чипе» позволили исследователям разработать модели in vitro, которые в точности имитируют трехмерную (3D) архитектуру и динамические условия потока жидкости в органах человека15. Наша группа ранее охарактеризовала две модели МПС с PTECs16,17 и использовала эти модели для проведения исследований токсичности 18,19,20 и точного прогнозирования диспозиции препарата 21. Использование первичных ПТЭК в этих моделях дает значительные преимущества благодаря их способности сохранять функциональные характеристики, наблюдаемые in vivo.

В данной статье мы представляем протоколы выделения человеческих ПТЭК из интактной человеческой почки, полученной от умершего донора, с помощью организации по закупке органов, одобренной Объединенной сетью по обмену органами (UNOS), и применения этих культивированных человеческих ПТЭК в рамках платформы МПС.

протокол

Все работы проводились в соответствии с рекомендациями Вашингтонского университета по обращению с человеческими тканями. Подходящие доноры отвечают следующим требованиям: менее 36 часов холодового ишемического времени (ЧИТ), отсутствие в анамнезе заболеваний почек, диализа или любых других медицинских состояний (например, сахарный диабет 1 или 2 типа, гепатит В, гепатит С, вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусный/бактериальный менингит, метициллин-резистентная инфекция Staphylococcus aureus , сифилис, сепсис или Covid-19). Цельные человеческие почки, использованные в этом исследовании, были получены через одобренную UNOS OPO.

1. Подготовка шкафа биобезопасности

  1. Распылите на капот 70% этанола. Обеззараживайте все поверхности и предметы внутри шкафа, чтобы создать стерильную среду.
  2. Положите синие впитывающие прокладки. Выполняйте всю тканевую работу над этими подушечками.
  3. Убедитесь, что в шкафу биобезопасности имеется и надлежащим образом стерилизовано необходимое оборудование (бритвенные лезвия, серологические наконечники для пипеток, серологический пистолет для пипеток, клеточные фильтры 100 мкм, наконечники p1000, микропипетки объемом 1000 мкл, круглые чашки для культивирования 15 см и конические пробирки).

2. Подготовка к предварительной обработке почек

  1. Приготовьте раствор для переваривания почек, добавив 0,75 мг/мл коллагеназы IV + 0,75 мг/мл раствора II в фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) с кальцием и магнием. Отфильтруйте раствор через стерильный мембранный фильтр размером 0,2 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для целой почки взрослого человека требуется примерно 14 конических пробирок объемом 50 мл, каждая из которых содержит ~35 мл раствора для сбраживания (всего 500 мл).
  2. Приготовьте среду PTEC, добавив 4,425 г модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM)/F12 порошка без глюкозы, 0,5 г порошка D-глюкозы, 0,6 г порошка бикарбоната натрия, 5 мл 100-кратной добавки инсулин-трансферрин-селен (содержащей 1000 мг/л инсулина, 550 мг/л трансферрина и 0,67 мг/л селенита натрия), 0,5 мл 50 мкМ гидрокортизона и 5 мл 100-кратного раствора антибиотика-антимикотика (содержащего 10000 ЕД/мл пенициллина G натрия), 10000 мкг/мл стрептомицина сульфата и 25 мкг/мл амфотерицина B в 0,85% физиологическом растворе) в 500 мл стерильной автоклавированной сверхчистой воды (тип 1). Фильтруйте фильтрующий материал через стерильный мембранный фильтр размером 0,2 мкм. Разморозьте фетальную бычью сыворотку (FBS) и внесите по 10 мл аликвот в 14 конических пробирках по 50 мл.
  3. Соберите и промаркируйте дополнительный набор конических пробирок объемом 50 мл. На этом этапе убедитесь, что имеется 3 комплекта по 14 трубок объемом 50 мл.
  4. Предварительно прогрейте орбитальный шейкер до 37 °C.

3. Выделение ПТЭК из целой почки

  1. Используя стерильную технику, поместите транспортный контейнер с образцом ткани в колпак биобезопасности. Извлеките пакет из коробки и распылите снаружи 70% этанола, прежде чем положить его в капот.
  2. Поместите почку на круглую 15-сантиметровую посуду для культуры. Отбирайте/выбрасывайте оставшуюся среду.
  3. Удалите окружающий жир и почечную капсулу с помощью стерильных бритвенных лезвий. Аккуратно надрежьте почечную капсулу, чтобы в центре получилась щель.
  4. С помощью пинцета снимите капсулу и с помощью бритвенных лезвий срезайте жир, прикрепленный к почке. Выбросьте капсулу и жир в другую чашку для культуры толщиной 15 см.
  5. Отделите кору головного мозга (толщиной ~1 см) от мозгового вещества. Выбросьте мозговое вещество.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кора головного мозга имеет более светлый коричневато-желтый цвет по сравнению с мозговым веществом.
  6. С помощью лезвия бритвы измельчите салфетку на <1 см3 штуки до кашицевидного вида.
  7. Добавьте в чашку небольшое количество буфера для переваривания почек и перелейте суспензию в первый набор пробирок объемом 50 мл, содержащих 35 мл раствора для переваривания почек. Распределите равномерно и не превышайте общий объем 45 мл на каждую пробирку.
  8. Перенесите все пробирки в орбитальный шейкер при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 30 минут с максимальной скоростью, которая не приведет к выпадению трубок. Перенесите пробирки обратно в шкаф биобезопасности после распыления на них 70% этанола.
  9. Переверните трубки, чтобы перемешать, и дайте более крупным кусочкам ткани осесть на дно. Перенесите как можно больше раствора в конические пробирки объемом 50 мл, содержащие 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), не перенося неповрежденные ткани. Распределите равномерно и не превышайте общий объем 45 мл на каждую пробирку.
  10. Центрифугируйте пробирки при 200 г в течение 7 минут. Переместите пробирки обратно в шкаф биобезопасности после распыления на них 70% этанола.
  11. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Добавьте по 10 мл фильтрующего материала PTEC в каждую пробирку и повторно суспендируйте гранулы.
  12. Процедите полученные клеточные суспензии через клеточные сетчатые фильтры 100 мкм в новые конические пробирки объемом 50 мл.
  13. Центрифугируйте полученную ячейку фильтратами при 400 г в течение 5 мин. Переместите пробирки обратно в шкаф биобезопасности после распыления на них 70% этанола.
  14. Промойте гранулы 5 мл DPBS. Суспендируйте гранулы с помощью наконечника p1000.
  15. Центрифугируйте пробирки при 400 г в течение 5 минут. Переместите пробирки обратно в шкаф биобезопасности после распыления на них 70% этанола, затем отсасывайте надосадочную жидкость.
  16. Повторите шаг 3.15 еще два раза, всего три стирки. Затем ресуспендируют клеточные гранулы 15 мл среды PTEC и поместили клетки в стерильные колбы для клеточных культур Т-75.
  17. Надлежащим образом промаркируйте колбы и дайте клеткам расти в стерильном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2. Дайте PTEC спокойно расти в инкубаторе в течение 48 часов до первой смены среды.

4. Изменения в СМИ

  1. Отсадите среду из колб.
  2. Промойте ячейки 5 мл предварительно подогретого DPBS.
  3. Добавьте в колбы Т-25 5 мл предварительно подогретого фильтрующего материала PTEC.
  4. Верните колбу в инкубатор.
  5. Меняйте среду каждые 48 часов, пока колба не достигнет не менее 70% конфлюенции для пропускания или использования в экспериментах.

5. Прохождение PTEC

  1. Асасируйте среду из колбы. Добавьте 5 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина-ЭДТА в каждую колбу Т-25 и инкубируйте при 37 °C в течение 1–2 минут, чтобы дать возможность перевариванию трипсина.
  2. После отделения клеток нейтрализуйте трипсин 5 мл предварительно подогретого раствора определенного ингибитора трипсина.
  3. Повторите суспендию 5 раз, чтобы сместить все ячейки, все еще прикрепленные к колбе. Затем перенесите суспензию клеток в конические пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 400 g в течение 5 минут.
  4. Выведите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановитесь здесь, чтобы криоконсервировать PTEC и перейти к этому протоколу.
  5. Суспендируйте гранулы клеток с помощью 14 мл фильтрующего материала PTEC на пробирку. Переложите клеточные суспензии в колбы Т-75 (по 1 пробирке на колбу).
  6. Выполните Т-образное встряхивание, чтобы равномерно распределить ячейки по колбе. Контролируйте ячейки и меняйте носители каждые 48 часов.

6. Криоконсервация ПТЭК

  1. После шага 5.6 повторно суспендируйте клеточные гранулы в 2 мл 10% ДМСО и 90% среды PTEC с низким содержанием глюкозы для каждой конической пробирки объемом 15 мл и перенесите 1 мл в одну криовиальную пробирку.
  2. Переложите криовиалы в контейнер для заморозки клеток, который позволяет замораживать с контролируемой температурой, и поместите контейнер в морозильную камеру при температуре -80 °C на 24 часа. Через 24 ч при температуре -80 °C перенесите криовиалы в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.

7. Размораживание PTEC

  1. Разморозьте флакон с -80 °C на водяной бане 37 °C. Не размораживайте при комнатной температуре (RT). После того, как флакон будет частично разморожен (должен быть виден небольшой кусочек льда), добавьте 1 мл клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл с 10 мл предварительно подогретой среды PTEC.
  2. Уменьшите клеточную суспензию при 400 г в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 5 мл предварительно подогретой среды PTEC с низким содержанием глюкозы.
  3. Перелейте 5 мл клеточной суспензии в колбу Т-25 и выполните Т-образное встряхивание, чтобы равномерно распределить клетки по колбе. Здесь перейдите в раздел 4 для ознакомления с изменениями в медиа.

8. Покрытие аппарата МПС коллагеновой матрицей I типа

  1. Отберите PBS из устройства MPS и извлеките устройство из упаковки. Вытрите устройство насухо медицинскими салфетками и пометьте его по желанию.
  2. Поместите устройство MPS в круглую чашку для культуры диаметром 15 см и поместите ее при температуре 4 °C до готовности к использованию. Держите медицинские салфетки на дне посуды, чтобы предотвратить попадание влаги на устройство MPS.
  3. Держите шприцы объемом 1 мл с прикрепленными тупыми иглами Люэра-Лока 22 г при температуре -20 °C до использования для инъекций коллагена I.
  4. На каждые четыре устройства MPS, которые необходимо заполнить, держите одну коническую трубку объемом 15 мл на льду. Используйте один шприц объемом 1 мл с прикрепленной тупой иглой для каждой конической трубки объемом 15 мл.
  5. Используя стерильную технику в шкафу биобезопасности, откройте все порты на устройстве MPS. Убедитесь, что щели в верхней части каждого винтового клапана совпадают вертикально с портом.
  6. С помощью тупого узла шприца/иглы объемом 1 мл промойте камеру ECM 1 мл этанола в порты #1, #3 и #6. Отсадите этанол и дайте ему полностью испариться (не менее 30 с), чтобы он не проник в устройство MPS из портов #2, #4 и #5.
  7. Установите на устройство MPS температуру 4 °C и держите на льду фильтрующий материал PTEC, M199 и 1 N NaOH.
  8. Рассчитайте состав матрицы для 1 мл коллагеновой смеси типа I примерно для четырех аппаратов МПС согласно таблице 1 (масштабируйте по мере необходимости). В шкафу биобезопасности смешайте среды PTEC, M199 и 1 N NaOH в указанном порядке, согласно приведенным выше расчетам, и держите все пробирки на льду.
  9. Осторожно добавьте бульон коллагена I типа с помощью шприца объемом 1 мл в готовую смесь. Перемешайте коллагеновую смесь пипеткой вверх и вниз, пока смесь не приобретет устойчивый лососевый оранжево-розовый цвет.
  10. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы собрать раствор на дне. Убедитесь, что в растворе нет пузырьков.
  11. Поместите предварительно охлажденные шприцы объемом 1 мл с тупыми иглами Luer-Lok 22 г и устройством MPS в шкаф биобезопасности и на лед. Наполните предварительно охлажденный шприц объемом 1 мл коллагеновой смесью и полностью исключите образование пузырьков.
  12. Очень медленно и осторожно введите раствор коллагена в порты #1, #3 и #6 охлаждаемых камер аппарата. Держите устройство вертикально портами вниз, чтобы пузырьки воздуха могли подниматься вверх и выходить из портов #2, #4 и #5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В портах #2, #4 и #5 должна быть капля коллагеновой смеси, что указывает на то, что камеры полностью покрыты.
  13. Извлеките шприц и поместите его обратно в пробирку объемом 15 мл на льду. Поверните винтовой клапан для портов #2, #4 и #5, чтобы запечатать наполненную стружку, и поместите ее на чашку для культуры при температуре 4 °C на 30 минут.
  14. Через 30 минут переложите чипсы вместе с тарелкой в биозащитный шкаф стерильным способом и распределите чипсы равномерно и по отдельности, чтобы они равномерно прогрелись.
  15. В каждую посуду нанесите увлажненную медицинскую салфетку (чтобы матрица коллагена I не высыхала и не отслаивалась от стенок аппарата МПС) и запечатайте посуду полупрозрачной гибкой герметизирующей пленкой. Дайте коллагену полимеризоваться в течение ночи при лучевой терапии.

9. Создание трубчатого просвета с коллагеном IV типа в качестве ВКМ в аппарате МПС

  1. Простерилизуйте трубки C-flex путем промывки трубок сверхчистой водой (тип 1) и чистым этанолом, а затем автоклавируйте всю линейку трубок.
  2. В шкафу биобезопасности откройте все порты устройства MPS, заполненного коллагеном типа I (винтовой клапан будет вертикальным с портами) и удалите провод, выступающий из портов #1, #3 и #6, чтобы сформировать трубчатые просветы.
  3. Вставьте металлические муфты в порты #1, #3 и #6.
  4. Приготовьте 10 мл раствора коллагена IV типа 5 мкг/мл в среде PTEC.
  5. Вставьте 24 дюйма стерильной трубки C-flex на металлические тупицы, выступающие из портов #1, #3 и #6.
  6. Наполните шприцы объемом 1 мл с тупой иглой Luer-Lok 22-G 0,5 мл раствора коллагена IV типа.
  7. Поместите заполненный шприц на шприцевой инфузионный насос и подсоедините трубку от порта #1 к шприцу. Повторите этот шаг для портов #3 и #6.
  8. С помощью шприцевого насоса подавайте раствор коллагена IV типа в порты МПС со скоростью 10 мкл/мин в течение 30 мин. После того, как порты будут заполнены, дайте коллагену застыть в инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи, прежде чем использовать их на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аппараты МПС типа IV, покрытые коллагеном, могут храниться до 1 недели при температуре 4 °C.

10. Посев первичных ПТЭК в устройство МПС

  1. Осмотрите устройство MPS под микроскопом, чтобы убедиться, что просвет сформировался правильно.
  2. Поместите предварительно стерилизованный шприц объемом 5 мл с иглой 22 г в пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл этанола.
  3. Получите гранулу элемента PTEC в конической пробирке объемом 15 мл из колбы T-25, выполнив шаги 5.1. к 5.3. Добавьте 80 μл фильтрующего материала PTEC в гранулу ячейки и аккуратно повторите.
  4. Перенесите клеточную суспензию в микропробирку объемом 1,5 мл.
  5. Извлеките из инкубатора чашку, содержащую устройство MPS, и поместите ее в шкаф биобезопасности. Закройте порты #2, #4 и #5 и поверните винтовой клапан горизонтально к портам.
  6. Осторожно переверните трубку, содержащую PTEC, чтобы повторно суспендировать клетки. Наполните шприц ячейками и введите иглу в порт для инъекций, который находится дальше всего от портов винтовых клапанов.
  7. Осторожно надавите на поршень шприца, чтобы ввести клетки. Визуализируйте клетки после инъекции под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны перемещаться по просвету. Если в просвете не наблюдается никаких клеток, проверьте, была ли игла надежно введена в отверстие для инъекций, и при необходимости вставьте иглу обратно. Полный шприц ячеек может заполнить все три просвета на устройстве.
  8. Продолжайте инъекции клеток через два других порта. После инъекций закройте порты #2, #4 и #5 и поместите устройство MPS обратно в инкубатор с температурой 37 °C. Держите пластину ровно, чтобы клетки не выходили из просвета под действием силы тяжести.
  9. Для дополнительных устройств МПС следует промыть шприц этанолом после его опорожнения и промыть с помощью ДПБС перед вытягиванием ячеек.
  10. Оставьте устройства MPS на ночь без помех.
  11. На следующий день подключите устройства МПС к шприцевым насосам.
  12. В шкафу биобезопасности наполните 5 мл шприцев средой PTEC. Затем установите тупые наконечники Luer-Lok 22 G с 24-дюймовым участком трубки C-flex, прикрепленным к шприцам.
  13. Поместите шприцы, загруженные фильтрующим материалом, в шприцевой насос. Загрунтуйте линии, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  14. Подсоедините загрунтованные трубопроводы к портам #1, #3 и #6 и поверните винтовые клапаны в вертикальное положение, чтобы обеспечить поток среды.
  15. Установите расход шприцевого насоса на уровне 0,5 μл/мин. Перед началом эксперимента поместите чашку с устройством MPS обратно в инкубатор при температуре 37 °C и дайте клеткам сформировать канальцы (в течение 5–7 дней) при непрерывной перфузии среды.

Результаты

Морфология и слияние выделенных первичных ПТЭК с течением времени в 2D-культуре
После изоляции от коры головного мозга почек ПТЭК позволяли расти в спокойном состоянии в течение как минимум 48 ч до первой смены среды. Примерно через неделю после культивирова...

Обсуждение

МПС, или технологии «орган на чипе», предлагают очень актуальную платформу in vitro для резюмирования ключевых аспектов физиологии человека, тем самым снижая зависимость от животных моделей при разработке лекарств и токсикологических оценках. Недавно Закон о модер...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликтов интересов или раскрытия финансовой информации, относящейся к данному исследованию.

Благодарности

Часть этой работы была поддержана контрактом NASA 80ARC023CA001, Национальным центром развития трансляционных наук (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), совместно NCATS и Центром развития науки в космосе (CASIS) (UG3TR002178), Национальным институтом наук об окружающей среде (NIEHS) (P30ES00703), Национальным институтом общих медицинских наук (T32GM007750), неограниченным подарком от Северо-западных центров почек для исследований почек и Школа фармацевтики Вашингтонского университета (премия Цзи-Пин Ванга и стипендия Брэдли).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309628
1.5 mL microcentrifuge tubesCELLTREAT Scientific Products229442
15 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific14-959-53A
3D microphysiological DeviceNortisTCC-001
5 mL Luer-Lok Tip SyringesBecton, Dickinson309646
50 mL sterile conical polypropylene tubeFisher Scientific12-565-271
Antibiotic-Antimycotic (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Collagenase, Type IV, powderThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-GlucoseMilliporeSigmaG8270
Defined Trypsin InhibitorThermoFisher ScientificR007100
Dimethyl sulfoxide, Bioreagent, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, powderThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco’s MEM (DMEM)/F-12 w/o GlucoseUS Biological Life SciencesD9807-02
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), calcium, magnesiumThermoFisher Scientific14040117
Fetal Bovine Serum (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Finnpipette F2 Good Laboratory Pipetting (GLP) KitsThermoFisher Scientific05-719-511Micropipettes
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-FilteredFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Fresh whole human kidneyNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Human kidneys were obtained through Novabiosis, a UNOS-approved OPO
Humidified incubator (37 °C and 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrocortisoneMilliporeSigmaH0888
Incubating Orbital ShakerAvantor12620-946
Insulin-Transferrin-Selenium (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Internal Thread Cryogenic VialsCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Luer Stubs (Blunt needle), 22 G x 0.5 inchesInstech Laboratories, Inc.LS22
Medium 199, Earle's Salts (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Megafuge 8 Small Benchtop CentrifugeThermoFisher Scientific75007210
Metal Coupler (blunt)Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Freezing ContainerThermoFisher Scientific5100-0036
Nikon Eclipse Ti-S MicroscopeNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Original model discontinued 
Nunc Non-treated Flasks, T-25ThermoFisher Scientific169900
Nunc Non-treated Flasks, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipette, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, SterileGreiner Bio-One607180
Silicon tubing, C-flex tubing, (ID: 0.020", OD: 0.083")Cole-Parmer06422-00
Single edge razor blade (sterile)BiosealKI-205/50
Sodium BicarbonateMilliporeSigmaS6297
Sodium HydroxideMilliporeSigmaS8045
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermoFisher Scientific567-0020
Tissue Culture Treated Dishes, 150 mm  x 20 mm VentedGenesee Scientific25-203
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Type I collagen, rat tailCorning354236
Type IV Collagen, MouseCorning354233

Ссылки

  1. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  2. Zhang, X. et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational study. BMC Nephrol. 21, 108 (2020).
  3. Wang, K., Kestenbaum, B. Proximal tubular secretory clearance. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (8), 1291-1296 (2018).
  4. Yin, J., Wang, J. Renal drug transporters and their significance in drug-drug interactions. Acta Pharm Sin B. 6 (5), 363-373 (2016).
  5. Connor, S., Roberts, R. A., Tong, W. Drug-induced kidney injury: challenges and opportunities. Toxicol Res (Camb). 13 (4), tfae119 (2024).
  6. Meijer, T. et al. Characterization of organic anion and cation transport in three human renal proximal tubular epithelial models. Cells. 13 (12), 1008 (2024).
  7. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 97, 4-27 (2016).
  8. Miceli, C. et al. Fluid flow-induced shear stress controls the metabolism of proximal tubule kidney epithelial cells through primary cilium-dependent lipophagy and mitochondria biogenesis. Autophagy. 16 (12), 2287-2288 (2020).
  9. Tsang, Y. P., Hao, T., Mao, Q., Kelly, E. J., Unadkat, J. D. Dysregulation of the mRNA expression of human renal drug transporters by proinflammatory cytokines in primary human proximal tubular epithelial cells. Pharmaceutics. 16 (2), 285 (2024).
  10. Bajaj, P. et al. Freshly isolated primary human proximal tubule cells as an in vitro model for the detection of renal tubular toxicity. Toxicology. 442, 152535 (2020).
  11. Brown, C. D. A. et al. Characterisation of human tubular cell monolayers as a model of proximal tubular xenobiotic handling. Toxicol Appl Pharmacol. 233 (3), 428-438 (2008).
  12. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28 (10), 2432-2438 (2013).
  13. Morse, B. L. et al. Pharmacokinetics of organic cation transporter 1 (OCT1) substrates in Oct1/2 knockout mice and species difference in hepatic OCT1-mediated uptake. Drug Metab Dispos. 48 (2), 93-105 (2020).
  14. Samodelov, S. L., Kullak-Ublick, G. A., Gai, Z., Visentin, M. Organic cation transporters in human physiology, pharmacology, and toxicology. Int J Mol Sci. 21 (21), 7890 (2020).
  15. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  16. Weber, E. J. et al. Development of a microphysiological model of human kidney proximal tubule function. Kidney Int. 90 (3), 627-637 (2016).
  17. Chapron, A. et al. An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion. ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).
  18. Adler, M. et al. A quantitative approach to screen for nephrotoxic compounds in vitro. J Am Soc Nephrol. 27 (4), 1015-1028 (2016).
  19. Chang, S. et al. Human liver-kidney model elucidates the mechanisms of aristolochic acid nephrotoxicity. JCI Insight. 2 (22), e95978 (2017).
  20. Weber, E. J. et al. Human kidney on a chip assessment of polymyxin antibiotic nephrotoxicity. JCI Insight. 3 (24), e123673 (2018).
  21. Imaoka, T. et al. Bridging the gap between in silico and in vivo by modeling opioid disposition in a kidney proximal tubule microphysiological system. Sci Rep. 11 (1), 21356 (2021).
  22. Van Ness, K. P., Chang, S., Weber, E. J., Zumpano, D., Eaton, D. L., Kelly, E. J. Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity. Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).
  23. Lidberg, K. A. et al. Serum protein exposure activates a core regulatory program driving human proximal tubule injury. J Am Soc Nephrol. 33 (5), 949-965 (2022).
  24. Sakolish, C. et al. Technology transfer of the microphysiological systems: a case study of the human proximal tubule tissue chip. Sci Rep. 8 (1), 14882 (2018).
  25. Hart, A. et al. Identification of prognostic biomarkers for antibiotic associated nephrotoxicity in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 23 (2), 293-299 (2024).
  26. Lidberg, K. A. et al. Antisense oligonucleotide development for the selective modulation of CYP3A5 in renal disease. Sci Rep. 11 (1), 4722 (2021).
  27. Imaoka, T. et al. Microphysiological system modeling of ochratoxin A-associated nephrotoxicity. Toxicology. 444, 152582 (2020).
  28. Chapron, B. D. et al. Reevaluating the role of megalin in renal vitamin D homeostasis using a human cellderived microphysiological system. ALTEX. 35 (4), 504-515 (2018).
  29. Adashi, E. Y., O'Mahony, D. P., Cohen, I. G. The FDA modernization act 2.0: drug testing in animals is rendered optional. Am J Med. 136 (9), 853-854 (2023).
  30. Qi, W., Johnson, D. W., Vesey, D. A., Pollock, C. A., Chen, X. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (methods in renal research). Nephrology. 12 (2), 155-159 (2007).
  31. Mihevc, M., Petreski, T., Maver, U., Bevc, S. Renal proximal tubular epithelial cells: review of isolation, characterization, and culturing techniques. Mol Biol Rep. 47 (12), 9865-9882 (2020).
  32. Shaver, C. M. et al. Cellfree hemoglobin augments acute kidney injury during experimental sepsis. Am J Physiol Renal Physiol. 317 (4), F922-F929 (2019).
  33. Sbarbati, R. Separation of human endothelial cells from fibroblasts by centrifugation in Percoll gradients. Biosci Rep. 5 (6), 469-472 (1985).
  34. Horn, P. et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 10 (7), 676-685 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены