التنظيم الكيميائي الوراثي في الخلايا السليفة المشتقة من الخلايا الجذعية المعاد برمجتها في علاج الأمراض التنكسية العصبية

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لهندسة الخلايا الجذعية المعاد برمجتها كيميائيا لتحقيق تعديل دقيق للخلايا العصبية عن طريق تمييز هذه الخلايا إلى خلايا سلائف الدوبامين ، وزرعها في نماذج الفئران لمرض باركنسون ، وتقييم النتائج السلوكية والفيزيولوجية الكهربية لتأكيد التكامل الناجح والفعالية الوظيفية للخلايا المزروعة.

Abstract

يقدم دمج المستقبلات المصممة التي يتم تنشيطها حصريا بواسطة الأدوية المصممة (DREADD) مع العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية استراتيجية متقدمة لتعديل الخلايا العصبية بدقة. هنا ، استخدمنا الخلايا الجذعية البشرية المعاد برمجتها من قبل كريسبر والتي تعبر عن مستقبلات DREADD المثيرة (hM3Dq) أو المثبطة (hM4Di) لتقييم التكامل الوظيفي وتعديل سلائف الدوبامين المزروعة في نموذج الفئران لمرض باركنسون (PD). تضمنت الخطوات الرئيسية توليد خطوط الخلايا الجذعية التي تعبر عن DREADD غير الاندماجية ، وتمايزها إلى سلائف دوبامين في الدماغ المتوسط ، وزرع هذه الخلايا في مخطط الفئران المصابة بآفة 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA). أجرينا تقييمات سلوكية وتسجيلات فيزيولوجية كهربية لتحليل تأثيرات الخلايا المزروعة. أظهرت الاختبارات السلوكية ، مثل اختبار الأسطوانة ، تعديلا كبيرا للوظيفة الحركية بعد إعطاء أكسيد كلوزابين نيترونيتروجين (CNO). على وجه التحديد ، أدى تنشيط hM4Di إلى تقليل حركة الطرف الأمامي المقابل ، في حين ارتبط تنشيط hM3Dq بتعزيز السلوك الحركي. كشفت التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية عن استجابات متشابكة مميزة. أدى تنشيط hM4Di إلى زيادة فترات ما بين الأحداث وتقليل اتساع الذروة للتيارات المثيرة التلقائية بعد المشبكية (sEPSCs) ، في حين أن تنشيط hM3Dq قلل من فترات ما بين الأحداث وزيادة اتساع الذروة ، مما يعكس الإشارات المثيرة المحسنة. باختصار ، فإن تكامل التقييمات السلوكية والفيزيولوجية الكهربية يتحقق من صحة الدمج الوظيفي الدقيق للخلايا الجذعية المعاد برمجتها كيميائيا في الدوائر العصبية المضيفة.

Introduction

المستقبلات المصممة التي يتم تنشيطها حصريا بواسطة الأدوية المصممة (DREADD) هي مستقبلات مقترنة ببروتين G مصممة هندسيا يمكن تنشيطها بشكل انتقائي بواسطة روابط اصطناعية خاملة¹. أصبح النهج الكيميائي الوراثي أداة أساسية في علم الأعصاب من خلال تمكين الباحثين من التحقيق في اتصال الدوائر العصبية بدقة عالية وتعزيز فهمنا للوظائف الخلوية في كل من الجسم الحي وفي المختبر من خلال التنشيط الانتقائي أو التثبيط لمناطق معينة من الدماغ أو أنواع الخلايا^2،3.

يقدم العلاج القائم على الخلايا الجذعية استراتيجية واعدة لعلاج الأمراض التنكسية العصبية. تعتمد فعالية خلايا الكسب غير المشروع على التكامل المناسب والبقاء والمساهمة الوظيفية في الأنسجة المضيفة. يمكن أن يؤدي النشاط الخلوي غير المنضبط إلى عواقب سلبية ، بما في ذلك تكوين الأورام⁴. مما يستلزم التحكم الدقيق في هذه الخلايا بعد الزرع. توفر الاستفادة من تقنية DREADD في الخلايا الجذعية البشرية المعاد برمجتها والخلايا العصبية المشتقة وسيلة للتحكم بدقة في نشاط الخلايا العصبية من خلال إعطاء الدواء المصمم CNO^2،5. في سياق مرض باركنسون (PD) ، الذي يتميز بفقدان الخلايا العصبية الدوبامين ، يعد التلاعب بنشاط الخلايا العصبية الدوبامين المشتقة من الخلايا الجذعية أمرا بالغ الأهمية للتحقيق في مدخلاتها المشبكية وأنماط الإسقاط في نماذج القوارض^{6،7،8،9،10}. يتيح دمج مستقبلات hM3Dq المثبطة ومستقبلات hM4Di المثبطة في هذه النماذج التعديل الدقيق للنشاط العصبي^11،12.

يسمح الجمع بين التقييمات السلوكية الحيوانية والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية بإجراء تقييم شامل لتأثيرات التعديل الكيميائي الوراثي على الخلايا المزروعة في الجسم الحي¹³. تقوم التقييمات السلوكية ، بما في ذلك الدوران الناجم عن الأبومورفين ، واختبار الأسطوانة ، واختبار الروتارود ، بتقييم التنسيق الحركي وتقديم رؤى حول التغييرات في الوظيفة الحركية المرتبطة بالنماذج التجريبية ل PD¹⁴. تتيح تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية ، مثل تسجيلات المشبك الرقعة ، المراقبة في الوقت الفعلي للاستجابات المشبكية وإمكانات العمل ، مما يوفر رؤية شاملة لكيفية اندماج الخلايا المزروعة في الشبكات العصبية الحالية¹⁵. من خلال الجمع بين التقييمات السلوكية والتقييمات الفيزيولوجية الكهربية ، يمكننا التحقيق في كيفية تأثير التعديل الكيميائي الوراثي على تكامل ووظائف هذه الخلايا داخل الدوائر العصبية المضيفة¹⁶. تشير النتائج الأولية إلى أن إدارة CNO تعدل بشكل فعال النشاط العصبي في الخلايا المزروعة ، مما يؤدي إلى تحسين النتائج الوظيفية في النماذج الحيوانية.

في هذا البروتوكول ، تم تصميم الخلايا الجذعية البشرية المعاد برمجتها للتعبير عن مستقبلات hM3Dq أو hM4Di باستخدام تقنية التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR). بعد تمييز الخلايا الجذعية المعدلة المعاد برمجتها إلى خلايا سلائف الدوبامين في الدماغ الأوسط ، تم زرع هذه الخلايا في نماذج الفئران من مرض باركنسون لتقييم تكاملها وتنظيمها الوظيفي داخل الدوائر العصبية المضيفة باستخدام التقييمات السلوكية والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جمعية بيجين لعلوم المختبر والمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم الحصول على خلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة (PBMCs) من متبرع سليم بموافقة خطية مستنيرة كما هو موضح في دراسة^{سابقة 17}.

1. بناء خطوط الخلايا الجذعية غير الانصهارية DREADD

1. قم ببناء البلازميد المتبرع DREADD.
   ملاحظة: يجب تصميم مواقع الهضم وفقا لتسلسل المتجه. يجب تصنيع الأجزاء وتضخيمها بتداخلات 20-30 نقطة أساس مطابقة لأذرع الشظايا لتعزيز كفاءة التجميع.
   1. صمم وتوليف جزء T2A-ZsGreen (الجزء الأول).
   2. قم بتضخيم جزء hM3Dq / hM4Di-T2A من البلازميد الأصلي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (الجزء الثاني). قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (الحجم الكلي 50 ميكرولتر) لاحتواء 1x مخزن مؤقت PCR ، و 200 ميكرومتر من كل مزيج dNTP ، و 0.5 ميكرومتر من البادئات الأمامية والخلفية ، و 10-50 نانوغرام من قالب الحمض النووي البلازميد ، و 1.25 وحدة من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة. قم بإجراء التدوير الحراري في ظل الظروف التالية: التمسخ الأولي عند 98 درجة مئوية لمدة 2.75 دقيقة لتغيير طبيعة القالب بالكامل ؛ 32 دورة تضخيم تتكون من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية (تمسخ) ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (تلدين أولي) ، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية (تمديد) ؛ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
   3. هضم البلازميد الناقل بالإنزيم المناسب للحصول على الناقل الخطي. قم بتنقية جميع الأجزاء عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وتحديدها باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: هنا ، تم هضم البلازميد الأصلي باستخدام MluI و SalI.
2. امزج برفق 50-100 نانوغرام من المتجه الخطي ، الجزء الأول ، والجزء الثاني بنسبة مولية 1: 3: 3 ، جنبا إلى جنب مع 2x Cloning Mix. احتضان الخليط عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتسهيل إعادة التركيب المتماثل من خلال تجميع جيبسون.
3. أدخل دليل الحمض النووي الريبي الذي يستهدف موقع AAVS1 في موقع BbsI للمتجه pX458.
   ملاحظة: قم بإجراء التحقق من التسلسل على جميع البلازميدات التي تم إنشاؤها باستخدام تسلسل Sanger.
4. الحفاظ على الخلايا الجذعية المعاد برمجتها في الوسائط ، بهدف كثافة خلية تتراوح من 2-5 × 10⁶ خلايا / مل.
   ملاحظة: تم تحفيز الخلايا الجذعية المعاد برمجتها المستخدمة هنا من PBMCs البشرية كما هو موضح في دراسة^{سابقة 17}. تعد مراقبة صحة الخلية أمرا ضروريا ، حيث تؤثر حالة الخلية بشكل كبير على كفاءة التثقيب الكهربائي. انظر جدول المواد لمقارنة الوسائط.
5. امزج 2-5 × 10⁶ خلايا ، 2 ميكروغرام من كل بلازميد متبرع (hM4Di-T2A-ZsGreen أو hM3Dq-T2A-ZsGreen) ، و 2 ميكروغرام من بلازميد gRNA في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي ونقله إلى كوفيت للتثقيب الكهربائي.
   ملاحظة: تأكد من خلط الخليط جيدا وخالي من الفقاعات قبل الشروع في التثقيب الكهربائي. قم بتحسين معلمات التثقيب الكهربائي بناء على نوع الخلية لزيادة كفاءة التعداء إلى أقصى حد ، حيث قد تتطلب الأجهزة المختلفة تعديلات محددة.
6. اضبط Nucleofector على برنامج B16 وابدأ التثقيب الكهربائي لتسهيل التعداء الفعال ل iNSCs المستهدفة.
7. أضف 1 مل من 50 ميكروغرام / مل بولي د-ليسين (PDL) إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل. قم بإزالة كل PDL من الآبار وأضف 1.5 مل من 5 ميكروغرام / مل من اللامينين إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات. استخدم اللوحة المطلية على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
8. انقل الخلايا الكهربائية إلى ألواح من ستة آبار تم تغليفها ب PDL واللامينين. توزيع ما يقرب من 500,000 خلية لكل بئر بحجم 2 مل من وسط الاستزراع لكل بئر.
9. بعد 72 ساعة من التثقيب الكهربائي ، استخدم مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا الموجبة الفلورسنت.
   1. أعد تعليق الخلايا المنفصلة في DPBS ، وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
   2. قم بتكوين الفرز باستخدام قناة FITC لاكتشاف ZsGreen. قم بتضمين iNSCs غير المعالجة كعناصر تحكم سلبية لتحديد مضان خط الأساس.
   3. قم بمعايرة الجهاز باستخدام فوهات 100 ميكرومتر عند ضغط غمد 20 رطل لكل بوصة مربعة. قم بتنفيذ وضع فرز النقاء رباعي الاتجاهات مع تأكيد الخلية الواحدة.
10. قم بلوحة خلايا ZsGreen ⁺ المفردة في ألواح ذات 96 بئرا مطلية مسبقا ب PDL واللامينين ، وأضف 200 ميكرولتر من وسط الثقافة لكل بئر لدعم النمو الأولي. يحفظ في وسط الاستزراع لمدة 7-14 يوما
    ملاحظة: راقب الآبار يوميا بحثا عن علامات النمو والتألق التي تشير إلى التكامل الناجح وقم بتسمية البئر الإيجابي.
11. اعزل المستنسخة المفردة التي تظهر التألق باستخدام مجهر مضان مقلوب مزود بمجموعة مرشح GFP. استنساخ الشاشة بتكبير 10x. علامات على الآبار التي تحتوي على مستعمرات أحادية النسيلة مع إشارة ZsGreen مستدامة وموحدة. التقط صورا للحقل الساطع والفلورة لتوثيق التشكل وشدة التألق.
    ملاحظة: قبل التصوير ، استبدل الوسط الجديد لتقليل تألق الخلفية. استبعاد المستعمرات ذات التشكل غير المنتظم أو التألق الذاتي.
12. قم بتوسيع الخلايا الموجبة على ألواح مغلفة بسعة 48 بئرا. ثم تنقسم إلى قسمين ، أحدهما للثقافة والآخر للتنميط الجيني.
13. استخراج الحمض النووي الجيني من المستنسخة المرشحة. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع زوجين أوليين: زوج واحد لتأكيد إدخال الجين محل الاهتمام ، والآخر التمهيدي للتمييز بين المستنسخة متماثلة اللواقح وغير متجانسة الزيجوت. قم بإجراء التدوير الحراري في ظل الظروف التالية: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ؛ 38 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ؛ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. قم بحل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على جل الاغاروز بنسبة 2٪.
    ملاحظة: انظر جدول المواد الخاصة بالبادئات. تأكيد إدخال الجين محل الاهتمام بواسطة نطاق واحد 650 نقطة أساس (التمهيدي 1). حدد المستنسخة المتغايرة من خلال وجود نطاق واحد 630 نقطة أساس واستنساخ متماثل اللواقح من خلال غياب هذا النطاق (التمهيدي 2).
14. قم بتوسيع الخلايا الموجبة على ألواح مطلية بستة آبار.
15. هضم الخلايا واغسلها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 3 دقائق. قم بتجميد الخلايا في وسط الحفظ بالتبريد بنسبة 10٪ DMSO بكثافة 2.5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة.

2. زرع خلايا سلائف مشتقة من الخلايا الجذعية DREADD في الفئران النموذجية PD

1. يجب إعطاء حقنة ديسيبرامين داخل الصفاق بتركيز 5 ملغم/مل (10 ملغ/كجم) للفئران التي تعاني من نقص المناعة قبل 30 دقيقة من الجراحة. تخدير الفئران بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران.
2. إجراء الحقن التجسيمي أحادي الجانب من 3 ميكرولتر من 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA ، 5 ميكروغرام / ميكرولتر). استهدف الجسم المخطط الأيمن باستخدام الإحداثيات التالية: الأمامي الخلفي = 0.5 مم ، الجانبي = 2.1 مم ، والرأسي = -3.2 مم.
   ملاحظة: يجب إذابة 6-OHDA في محلول ملحي يحتوي على 0.2٪ حمض الأسكوربيك. تأكد من الاستهداف الدقيق لتقليل التباين في شدة الآفة.
   تنبيه: 6-OHDA سام للخلايا وينتج أنواع الأكسجين التفاعلية التي تحفز الإجهاد الخلوي. تعامل معها بعناية.
3. يجب إعطاء حقنة داخل الصفاق من أبومورفين (1 ملغم/كغ، 0.5 ملغ/مل مذاب في محلول ملحي) للتحقق من صحة الآفات بعد 4 أسابيع من الجراحة. اختر الفئران المصابة بالآفة التي تظهر أكثر من 100 دورة مقابلة خلال فترة مراقبة مدتها 30 دقيقة للتجارب اللاحقة.
   ملاحظة: أبومورفين هو ناهض لمستقبلات الدوبامين ، والذي ينشط بشكل مباشر مستقبلات ما بعد المشبكي فائقة الحساسية في المخطط منزوع العصب ، مما يؤدي إلى عدم توازن نشاط دائرة الأضراب الثنائية. يعمل الدوران الناجم عن أبومورفين على تقييم شدة الآفات الدوبامين أحادية الجانب بواسطة 6-OHDA.
4. خلايا البذور والثقافة في ألواح مغلفة من ستة آبار (150,000 خلية لكل بئر). احتضن في وسط التمايز في المرحلة 1 لمدة 10 أيام ، مع تحديث الوسط كل يومين. في اليوم 11 ، قم بالتبديل إلى وسيط التمايز في المرحلة 2 واستمر في الحضانة حتى اليوم 13 ، مع تغيير الوسيط كل يوم.
   ملاحظة: انظر جدول المواد لمقارنة وسط التمايز.
5. احصد الخلايا في اليومين 10 و 13 من التمايز ، ثم اخلطها بنسبة 1: 7. قم بتعليق الخليط في مخزن مؤقت للزرع بتركيز 100,000 خلية / ميكرولتر.
   ملاحظة: انظر جدول المواد لمقارنة المخزن المؤقت للزرع.
6. قم بإعطاء حقنة تجسيمية بحجم إجمالي قدره 4 ميكرولتر من تعليق الخلية المحضر في فأر PD.
7. قم بإجراء اختبار الأسطوانة في نقاط زمنية مختلفة بعد زرع الخلايا. ضع دورق زجاجي (قطر: 20 سم ، ارتفاع: 30 سم) على سطح مستو غير عاكس. ضع كاميرا الرؤية العلوية فوق الأسطوانة لالتقاط القطر الكامل.
   ملاحظة: قم بإحاطة الأسطوانة بستائر سوداء للتخلص من المحفزات البصرية الخارجية.
8. ضع كل ماوس في وسط الأسطوانة وابدأ تسجيل الفيديو المتزامن (3 دقائق / جلسة). بعد الجلسة ، أعد الماوس إلى قفص منزله.
   ملاحظة: تأقلم الفئران مع غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة في ظل ظروف الإضاءة. نظف الأسطوانة بنسبة 70٪ من الإيثانول بين التجارب للتخلص من الإشارات الشمية.
9. تقييم قدرة حركة الطرف العلوي للفئران لمدة 3 دقائق. احسب عدد ملامسات الجدار التي يجريها الطرف الأمامي الضعيف بالنسبة إلى العدد الإجمالي لجهات الاتصال التي يقوم بها كلا الطرفين الأماميين.
10. يجب تطبيق إما محلول ملحي أو CNO بجرعة 1.2 ملغ/كغ عن طريق الحقن داخل الصفاق. إجراء اختبار الأسطوانة لتقييم التعديل السلوكي في نموذج ماوس PD بعد إدارة CNO
    ملاحظة: اترك فترة استرداد تبلغ حوالي 40 دقيقة قبل متابعة التقييم.

3. في الجسم الحي التنميط الكهربي للخلايا المعدلة كيميائيا

1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 250 مجم / كجم بنتوباربيتال. استخرج الدماغ وضعه على الفور في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي القائم على السكروز المثلج (s-ACSF) للحفاظ على سلامة الخلايا. باستخدام الاهتزاز ، قم بتقطيع الدماغ إلى أقسام بسمك 300-400 ميكرومتر.
   ملاحظة: اعمل بسرعة للحفاظ على الدماغ في درجات حرارة منخفضة للحفاظ على الوظيفة الخلوية. انظر جدول المواد الخاصة ب s-ACSF المستخدمة في إعداد قسم الدماغ الجديد.
2. انقل العينات إلى غرفة مملوءة ب ACSF متوازنة بنسبة 95٪ O₂ و 5٪ CO₂ عند 34 درجة مئوية ، مما يضمن الحفاظ على درجة الحرارة هذه طوال التجربة.
   ملاحظة: انظر جدول المواد الخاصة ب ACSF.
3. قم بتحميل الماصات الزجاجية بمحلول مثلج داخل الخلايا، مع مقاومة للأقطاب الكهربائية تتراوح من 7 إلى 10 MΩ.
   ملاحظة: انظر جدول المواد للمحلول داخل الخلايا. الماصات الزجاجية مصنوعة من الشعيرات الدموية الزجاجية بواسطة مجتذب ماصة^{دقيقة 18}. تحقق من عدم وجود أي تسرب في الماصات الزجاجية قبل بدء التجارب، وتأكد من أن الأطراف حادة بما يكفي لاختراق غشاء الخلية. تحضير الماصات بسرعة لتقليل تقلبات درجات الحرارة في المحلول داخل الخلايا.
4. قم بتركيب الشرائح في غرفة تسجيل مغمورة فائقة الاندماج (2 مل / دقيقة) مع ACSF المؤكسج عند 34 درجة مئوية. ضع الماصات باستخدام أجهزة المعالجة الدقيقة الآلية تحت الفحص المجهري للتداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء. إنشاء تكوين الخلية بأكملها عن طريق تطبيق شفط لطيف (مقاومة > 1 GΩ) على الخلايا العصبية المرقعة داخل مناطق الكسب غير المشروع. خلايا المشبك عند -70 مللي فولت باستخدام مضخم مشبك التصحيح ؛ احصل على sEPSCs الأساسية لمدة 8 دقائق بمعدل أخذ عينات 10 كيلو هرتز (تمت تصفيته عند 2 كيلو هرتز) ، وراقب باستمرار مقاومة الوصول (الهدف: <20 MΩ ؛ تجاهل إذا كان >25 MΩ أو متذبذبا >10٪).
   ملاحظة: استخدم الضغط المناسب عند تطبيق الشفط لتجنب إزاحة الخلايا أو تمزقها غير المرغوب فيها، واضبط موضع الماصة بعناية لتحقيق إحكام جيد. إذا كانت جودة الختم رديئة، فتخلص من الماصة وحاول مرة أخرى.
5. أضف 50 ميكرومتر CNO إلى غرفة التسجيل مباشرة بعد الانتهاء من قياس خط الأساس واستمر في تسجيل البيانات لمدة 16 دقيقة إضافية مع مراقبة التغيرات في تردد أو سعة sEPSC.
6. قم بإجراء الغسيل عن طريق استبدال محلول CNO ب ACSF جديد لإزالة CNO بشكل فعال من غرفة التسجيل. استمر في تسجيل البيانات للفترة المتبقية من التجربة لتقييم أي استرداد في النشاط المشبكي.

النتائج

يوضح الشكل 1 الخطوات الرئيسية لهذا النهج المنهجي للخلايا الجذعية البشرية المعاد برمجتها المهندسة التي تعبر عن مستقبلات DREADD المثيرة (hM3Dq) أو المثبطة (hM4Di) لتقييم التكامل الوظيفي وتعديل سلائف الدوبامين المشتقة في نموذج الفأر لمرض باركنسون (PD). يوضح

Discussion

استخدم هذا البروتوكول تقنية كريسبر لهندسة الخلايا الجذعية البشرية المعاد برمجتها للتعبير عن مستقبلات hM3Dq المثيرة ومستقبلات hM4Di المثبطة. تم تقييم تعديل النشاط العصبي بواسطة CNO من خلال زرع الخلايا في نماذج الفئران لمرض باركنسون ، مصحوبة بتقييمات سلوكية وتسجيلات فيزيولوج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	used for genotyping analysis
2×Seamless Cloning Mix	Biomed Gene Tech.	CL117-01	used for plasmid construction
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	used for establishing PD mice model
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	used as control
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	original plasmid for construction of hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	original plasmid for construction of hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Used for digesting cells
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	N/A	N/A	125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, and  26 mM NaHCO3
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Supplement	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapine-N-oxide	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramine	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175095
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Iced intracellular fluid	N/A	N/A	130 mM K-gluconate, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% of neurobiotin
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
Laminin	Roche	11243217001
Micropipette Puller	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 software suite	Molecular Devices	N/A	Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software
Phase 1 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, and 100 ng/mL FGF8
Phase 2 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, and 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM ascorbic acid, and 0.5 mM cAMP.
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primers for genotyping	N/A	N/A	Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
sucrose-based artificial cerebrospinal fluid (s-ACSF)			234 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0.5 mM CaCl2, and 10 mM MgSO4
Stem cell culture media	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) and 48% Neurobasal, with the addition of 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, and 3 µM CHIR99021
TGF-βIII	Peprotech	100-36E
Transplantation buffer	N/A	N/A	HBSS buffer with 5 g/L D-glucose, 100 ng/mL BDNF, 100 ng/mL GDNF, and 0.2 mM ascorbic Acid
Vibratome	Leica	VT1000 S
Whole-cell patch-clamp	Molecular Devices	MultiClamp700B