A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.
השילוב של קולטנים מעוצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADD) עם טיפולים מבוססי תאי גזע מציג אסטרטגיה מתקדמת לאפנון עצבי מדויק. כאן, השתמשנו בתאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש על ידי CRISPR המבטאים קולטני DREADD מעוררים (hM3Dq) או מעכבים (hM4Di) כדי להעריך את האינטגרציה והאפנון התפקודי של קודמנים דופמינרגיים מושתלים במודל עכברי של מחלת פרקינסון (PD). השלבים העיקריים כללו יצירת קווי תאי גזע המבטאים DREADD שאינם היתוך, התמיינות שלהם לקודמנים דופמינרגיים במוח האמצעי, והשתלת תאים אלה בסטריאטום של עכברים נגועים 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA). ביצענו הערכות התנהגותיות והקלטות אלקטרופיזיולוגיות כדי לנתח את ההשפעות של התאים המושתלים. בדיקות התנהגותיות, כגון מבחן הצילינדר, הראו אפנון משמעותי של התפקוד המוטורי לאחר מתן קלוזפין-N-אוקסיד (CNO). באופן ספציפי, הפעלת hM4Di הפחיתה את תנועת הגפיים הקדמיות הנגדיות, בעוד שהפעלת hM3Dq הייתה קשורה להתנהגות מוטורית משופרת. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות חשפו תגובות סינפטיות מובהקות. הפעלת hM4Di הגדילה את המרווחים הבין-אירועים והפחיתה את אמפליטודות השיא של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים (sEPSCs), בעוד שהפעלת hM3Dq הפחיתה את המרווחים הבין-אירועים והגדילה את אמפליטודות השיא, מה שמשקף איתות מעורר משופר. לסיכום, השילוב של הערכות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות מאמת את השילוב התפקודי המדויק של תאי גזע מתוכנתים מחדש כימית במעגלים עצביים מארחים.
קולטנים מעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADD) הם קולטנים מצומדים לחלבון G מהונדסים הניתנים להפעלה סלקטיבית על ידי ליגנדים סינתטיים אינרטייםאחרת 1. הגישה הכימוגנטית הפכה לכלי חיוני במדעי המוח בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור קישוריות של מעגלים עצביים בדיוק גבוה ולשפר את ההבנה שלנו לגבי תפקודים תאיים הן in vivo והן in vitro באמצעות הפעלה או עיכוב סלקטיביים של אזורי מוח ספציפיים או סוגי תאים 2,3.
טיפול מבוסס תאי גזע מציג אסטרטגיה מבטיחה לטיפול במחלות ניווניות. יעילותם של תאי השתל מסתמכת על אינטגרציה נכונה, הישרדות ותרומה תפקודית לרקמות המארח. פעילות תאית בלתי מבוקרת עלולה להוביל לתוצאות שליליות, כולל גידול4; מה שמחייב בקרה מדויקת על תאים אלה לאחר ההשתלה. מינוף טכנולוגיית DREADD בתאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש ונוירונים נגזרים מספק אמצעי לשליטה מדויקת בפעילות העצבית באמצעות מתן תרופת המעצב CNO 2,5. בהקשר של מחלת פרקינסון (PD), המאופיינת באובדן נוירונים דופמינרגיים, מניפולציה של פעילותם של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע היא חיונית לחקירת התשומות הסינפטיות ודפוסי ההקרנה שלהם במודלים של מכרסמים 6,7,8,9,10. שילוב קולטני hM3Dq מעוררים ומעכבי hM4Di במודלים אלה מאפשר אפנון מדויק של הפעילות העצבית11,12.
השילוב של הערכות התנהגותיות של בעלי חיים ורישומים אלקטרופיזיולוגיים מאפשר הערכה מקיפה של ההשפעות של אפנון כימוגנטי על תאים מושתלים in vivo13. הערכות התנהגותיות, כולל סיבוב המושרה על ידי אפומורפין, מבחן הצילינדר ומבחן הרוטרוד, מעריכות את הקואורדינציה המוטורית ומספקות תובנות לגבי שינויים בתפקוד המוטורי הקשורים למודלים ניסיוניים של PD14. טכניקות אלקטרופיזיולוגיות, כגון הקלטות מהדק טלאי, מאפשרות ניטור בזמן אמת של תגובות סינפטיות ופוטנציאל פעולה, ומספקות מבט מקיף על האופן שבו תאים מושתלים משתלבים ברשתות עצביות קיימות15. על ידי שילוב הערכות התנהגותיות עם הערכות אלקטרופיזיולוגיות, אנו יכולים לחקור כיצד אפנון כימוגנטי משפיע על האינטגרציה והפונקציונליות של תאים אלה בתוך מעגלים עצביים מארחים16. ממצאים ראשוניים מצביעים על כך שמתן CNO מווסת ביעילות את הפעילות העצבית בתאים מושתלים, וכתוצאה מכך תוצאות תפקודיות משופרות במודלים של בעלי חיים.
בפרוטוקול זה, תאי גזע אנושיים שתוכנתו מחדש הונדסו לבטא קולטני hM3Dq או hM4Di על ידי שימוש בטכנולוגיית CRISPR. לאחר התמיינות תאי גזע שתוכנתו מחדש לתאי קודמן דופמינרגיים במוח האמצעי, תאים אלה הושתלו במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון כדי להעריך את האינטגרציה והוויסות התפקודי שלהם במעגלים העצביים של המארח באמצעות הערכות התנהגותיות ורישומים אלקטרופיזיולוגיים.
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אגודת בייג'ינג למדעי חיות מעבדה והמכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. תאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי (PBMCs) התקבלו מתורם בריא עם הסכמה מדעת בכתב כמתואר במחקר קודם17.
1. בניית קווי תאים מבוססי גזע DREADD ללא היתוך
2. השתלת תאי מבשר שמקורם בתאי גזע DREADD בעכברים מדגם PD
3. פרופיל אלקטרופיזיולוגי in vivo של תאים מווסתים כימוגנטית
איור 1 מציג את השלבים העיקריים של גישה מתודולוגית זו עבור תאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש המבטאים קולטני DREADD מעוררים (hM3Dq) או מעכבים (hM4Di) כדי להעריך את האינטגרציה התפקודית והאפנון של קודמנים דופמינרגיים נגזרים במודל עכבר של מחלת פרקינסון (PD). איו?...
פרוטוקול זה השתמש בטכנולוגיית CRISPR כדי להנדס תאי גזע אנושיים שתוכנתו מחדש כדי לבטא קולטני hM3Dq מעוררים ומעכבי hM4Di. אפנון הפעילות העצבית על ידי CNO הוערך באמצעות השתלת תאים במודלים עכבריים של מחלת פרקינסון, בליווי הערכות התנהגותיות ורישומים אלקטרופיזיולוגיים.
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (7242068), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82171250), קרן ועדת הבריאות העירונית של בייג'ינג (PXM2020_026283_000005) והפרויקט לפיתוח טכנולוגיה של מכוני מחקר רפואיים המסונפים לבייג'ינג (11000023T000002036310).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 x Rapid Taq Master Mix | Vazyme | P222-01 | used for genotyping analysis |
2×Seamless Cloning Mix | Biomed Gene Tech. | CL117-01 | used for plasmid construction |
6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | used for establishing PD mice model |
AAVS1-Pur-CAG-EGFP | Addgene | 80945 | used as control |
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry | Addgene | 80947 | original plasmid for construction of hM4Di-T2A-ZsGreen |
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry | Addgene | 80948 | original plasmid for construction of hM3Dq-T2A-ZsGreen |
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen | N/A | N/A | Constructed donor plasmid based on #80947 |
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen | N/A | N/A | Constructed donor plasmid based on #80948 |
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Used for digesting cells |
AMAXA Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
Artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | N/A | N/A | 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, and 26 mM NaHCO3 |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 1043003 | |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
CHIR99021 | Yeasen | 53003ES10 | |
Clozapine-N-oxide | Enzo | BML-NS105 | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Desipramine | Sigma-Aldrich | D3900 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
GlutaMax | Gibco | 35050-061 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF) | Millipore | LIF1010 | |
Iced intracellular fluid | N/A | N/A | 130 mM K-gluconate, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% of neurobiotin |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
Laminin | Roche | 11243217001 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
N-2 Supplement | Thermo Fisher | 17502048 | |
Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888-022 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
pCLAMP 11 software suite | Molecular Devices | N/A | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
Phase 1 differentiation medium | N/A | N/A | 96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, and 100 ng/mL FGF8 |
Phase 2 differentiation medium | N/A | N/A | 96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, and 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM ascorbic acid, and 0.5 mM cAMP. |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Primers for genotyping | N/A | N/A | Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG |
pX458 | Addgene | 152199 | |
SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
SB431542 | Yeasen | 53004ES50 | |
sucrose-based artificial cerebrospinal fluid (s-ACSF) | 234 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0.5 mM CaCl2, and 10 mM MgSO4 | ||
Stem cell culture media | N/A | N/A | 48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) and 48% Neurobasal, with the addition of 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, and 3 µM CHIR99021 |
TGF-βIII | Peprotech | 100-36E | |
Transplantation buffer | N/A | N/A | HBSS buffer with 5 g/L D-glucose, 100 ng/mL BDNF, 100 ng/mL GDNF, and 0.2 mM ascorbic Acid |
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Whole-cell patch-clamp | Molecular Devices | MultiClamp700B |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved