Régulation chimiogénétique dans les cellules précurseurs dérivées de cellules souches reprogrammées dans le traitement des maladies neurodégénératives

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour concevoir des cellules souches reprogrammées chimiquement afin d’obtenir une modulation neuronale précise en différenciant ces cellules en cellules précurseurs dopaminergiques, en les transplantant dans des modèles murins de la maladie de Parkinson et en évaluant les résultats comportementaux et électrophysiologiques pour confirmer l’intégration réussie et l’efficacité fonctionnelle des cellules transplantées.

Résumé

L’intégration de récepteurs de synthèse exclusivement activés par des médicaments de synthèse (DREADD) avec des thérapies à base de cellules souches présente une stratégie avancée de modulation neuronale précise. Ici, nous avons utilisé des cellules souches humaines reprogrammées conçues par CRISPR exprimant des récepteurs DREADD excitateurs (hM3Dq) ou inhibiteurs (hM4Di) pour évaluer l’intégration fonctionnelle et la modulation des précurseurs dopaminergiques transplantés dans un modèle murin de la maladie de Parkinson (MP). Les étapes clés comprenaient la génération de lignées de cellules souches exprimant DREAD sans fusion, leur différenciation en précurseurs dopaminergiques du mésencéphale et la transplantation de ces cellules dans le striatum de souris atteintes de 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Nous avons effectué des évaluations comportementales et des enregistrements électrophysiologiques pour analyser les effets des cellules transplantées. Des tests comportementaux, tels que le test du cylindre, ont démontré une modulation significative de la fonction motrice après l’administration de clozapine-N-oxyde (CNO). Plus précisément, l’activation de hM4Di réduisait le mouvement controlatéral des membres antérieurs, tandis que l’activation de hM3Dq était associée à une amélioration du comportement moteur. Les enregistrements électrophysiologiques ont révélé des réponses synaptiques distinctes. L’activation de hM4Di a augmenté les intervalles inter-événements et diminué les amplitudes de pic des courants postsynaptiques excitateurs spontanés (sEPSC), tandis que l’activation de hM3Dq a diminué les intervalles inter-événements et augmenté les amplitudes de crête, reflétant une signalisation excitatrice améliorée. En résumé, l’intégration des évaluations comportementales et électrophysiologiques valide l’incorporation fonctionnelle précise de cellules souches reprogrammées chimiquement dans les circuits neuronaux de l’hôte.

Introduction

Les récepteurs de synthèse exclusivement activés par des médicaments de synthèse (DREADD) sont des récepteurs couplés aux protéines G modifiés qui peuvent être activés de manière sélective par des ligands synthétiques autrement inertes¹. L’approche chimiogénétique est devenue un outil essentiel en neurosciences en permettant aux chercheurs d’étudier la connectivité des circuits neuronaux avec une grande précision et d’améliorer notre compréhension des fonctions cellulaires in vivo et in vitro grâce à l’activation ou à l’inhibition sélective de régions cérébrales spécifiques ou de types cellulaires ^2,3.

La thérapie à base de cellules souches présente une stratégie prometteuse pour le traitement des maladies neurodégénératives. L’efficacité des cellules greffées repose sur une bonne intégration, la survie et la contribution fonctionnelle aux tissus hôtes. Une activité cellulaire incontrôlée peut entraîner des conséquences négatives, notamment une tumorigenèse⁴ ; nécessitant un contrôle précis de ces cellules après la transplantation. L’exploitation de la technologie DREADD dans des cellules souches humaines reprogrammées et des neurones dérivés fournit un moyen de contrôler avec précision l’activité neuronale via l’administration du médicament de synthèse CNO ^2,5. Dans le contexte de la maladie de Parkinson (MP), qui se caractérise par la perte de neurones dopaminergiques, la manipulation de l’activité des neurones dopaminergiques dérivés de cellules souches est cruciale pour étudier leurs entrées synaptiques et leurs modèles de projection dans des modèles de rongeurs 6,7,8,9,10. L’incorporation des récepteurs excitateurs hM3Dq et inhibiteurs hM4Di dans ces modèles permet une modulation précise de l’activité neuronale^11,12.

La combinaison d’évaluations comportementales animales et d’enregistrements électrophysiologiques permet une évaluation complète des effets de la modulation chimiogénétique sur les cellules transplantées in vivo¹³. Les évaluations comportementales, y compris la rotation induite par l’apomorphine, le test du cylindre et le test du rotarode, évaluent la coordination motrice et fournissent des informations sur les changements de la fonction motrice associés aux modèles expérimentaux de¹⁴. Les techniques électrophysiologiques, telles que les enregistrements par patch-clamp, permettent de surveiller en temps réel les réponses synaptiques et les potentiels d’action, offrant une vue complète de la façon dont les cellules transplantées s’intègrent dans les réseaux neuronaux existants¹⁵. En combinant des évaluations comportementales et des évaluations électrophysiologiques, nous pouvons étudier comment la modulation chimiogénétique affecte l’intégration et la fonctionnalité de ces cellules dans les circuits neuronaux de l’hôte¹⁶. Les résultats préliminaires suggèrent que l’administration de CNO module efficacement l’activité neuronale dans les cellules transplantées, ce qui entraîne une amélioration des résultats fonctionnels dans les modèles animaux.

Dans ce protocole, des cellules souches humaines reprogrammées ont été modifiées pour exprimer les récepteurs hM3Dq ou hM4Di en utilisant la technologie CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Après avoir différencié des cellules souches reprogrammées modifiées en cellules précurseurs dopaminergiques du mésencéphale, ces cellules ont été transplantées dans des modèles murins de MP pour évaluer leur intégration et leur régulation fonctionnelle dans les circuits neuronaux de l’hôte à l’aide d’évaluations comportementales et d’enregistrements électrophysiologiques.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives établies par l’Association de Pékin pour la science des animaux de laboratoire et les National Institutes of Health for the Care and Use of Laboratory Animals. Les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) ont été obtenues d’un donneur sain avec un consentement éclairé écrit, comme décrit dans une étude précédente¹⁷.

1. Construction de lignées de cellules souches DREADD sans fusion

1. Construisez le plasmide donneur DREADD.
   REMARQUE : Les sites de digestion doivent être conçus en fonction de la séquence vectorielle. Les fragments doivent être synthétisés et amplifiés avec des chevauchements de 20 à 30 pb correspondant aux bras de fragments pour améliorer l’efficacité de l’assemblage.
   1. Concevoir et synthétiser le fragment T2A-ZsGreen (Fragment I).
   2. Amplifiez le fragment hM3Dq/hM4Di-T2A du plasmide d’origine à l’aide de la PCR (Fragment II). Configurez la réaction de PCR (volume total de 50 μL) pour qu’elle contienne 1 tampon PCR, 200 μM de chaque mélange dNTP, 0,5 μM d’amorces directes et inverses, 10 à 50 ng de matrice d’ADN plasmidique et 1,25 U d’ADN polymérase haute fidélité. Effectuer le thermocyclage dans les conditions suivantes : dénaturation initiale à 98 °C pendant 2,75 min pour dénaturer complètement le gabarit ; 32 cycles d’amplification composés de 98 °C pendant 15 s (dénaturation), 60 °C pendant 30 s (recuit d’amorce) et 72 °C pendant 60 s (extension) ; extension finale à 72 °C pendant 7 min.
   3. Digérez le plasmide du vecteur avec l’enzyme appropriée pour obtenir le vecteur linéarisé. Purifier tous les fragments par électrophorèse sur gel d’agarose et les quantifier à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Ici, le plasmide original a été digéré avec MluI et SalI.
2. Mélangez doucement 50 à 100 ng du vecteur linéarisé, du fragment I et du fragment II dans un rapport molaire de 1:3:3, avec un mélange de clonage 2x. Incuber le mélange à 55 °C pendant 1 h pour faciliter la recombinaison homologue grâce à l’assemblage Gibson.
3. Insérez l’ARN guide ciblant le site AAVS1 dans le site BbsI du vecteur pX458.
   REMARQUE : Effectuez une vérification de séquence sur tous les plasmides construits à l’aide du séquençage de Sanger.
4. Maintenir les cellules souches reprogrammées dans le milieu, en visant une densité cellulaire de 2-5 × 10^{à 6} cellules/ml.
   REMARQUE : Les cellules souches reprogrammées utilisées ici ont été induites à partir de PBMC humains, comme décrit dans une étude précédente¹⁷. La surveillance de la santé des cellules est essentielle, car l’état des cellules a un impact significatif sur l’efficacité de l’électroporation. Voir le tableau des matériaux pour une comparaison des supports.
5. Mélangez 2 à 5 × 10⁶ cellules, 2 μg de chaque plasmide donneur (hM4Di-T2A-ZsGreen ou hM3Dq-T2A-ZsGreen) et 2 μg de plasmide d’ARNg dans 100 μL de tampon d’électroporation et transférez-les dans une cuvette pour l’électroporation.
   REMARQUE : Assurez-vous que le mélange est bien mélangé et exempt de bulles avant de procéder à l’électroporation. Optimisez les paramètres d’électroporation en fonction du type de cellule pour maximiser l’efficacité de la transfection, car différents appareils peuvent nécessiter des ajustements spécifiques.
6. Réglez le Nucleofector sur le programme B16 et lancez l’électroporation pour faciliter la transfection efficace des iNSC cibles.
7. Ajouter 1 mL de poly-D-lysine (PDL) de 50 μg/mL dans chaque puits d’une plaque à 6 puits et incuber à température ambiante pendant au moins 2 h. Retirer toute la LDO des puits et ajouter 1,5 mL d’une laminine de 5 μg/mL dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 2 à 4 h. Utilisez immédiatement la plaque revêtue ou conservez-la entre 2 et 8 °C pendant 1 semaine.
8. Transférez les cellules électroporées dans des plaques à six puits qui ont été recouvertes de PDL et de laminine. Répartissez environ 500 000 cellules par puits dans un volume de 2 mL de milieu de culture par puits.
9. Après 72 h d’électroporation, utilisez un cytomètre en flux pour trier les cellules positives fluorescentes.
   1. Remettre en suspension les cellules dissociées dans le DPBS et filtrer à travers une crépine de cellules de 70 μm.
   2. Configurez le trieur avec le canal FITC pour la détection ZsGreen. Inclure les iNSC non traités comme témoins négatifs pour définir la fluorescence de base.
   3. Étalonnez l’instrument à l’aide de buses de 100 μm à une pression de gaine de 20 psi. Mettez en œuvre un mode de tri de pureté à quatre voies avec confirmation à cellule unique.
10. Plaquez des cellules ZsGreen⁺ individuelles dans des plaques de 96 puits pré-enduites de PDL et de laminine, et ajoutez 200 μL de milieu de culture par puits pour soutenir la croissance initiale. Conserver dans le milieu de culture pendant 7 à 14 jours
    REMARQUE : Surveillez quotidiennement les puits pour détecter les signes de croissance et de fluorescence indiquant une intégration réussie et étiquetez le puits positif.
11. Isolez des clones uniques présentant une fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un ensemble de filtres GFP. Clones d’écran à un grossissement de 10x. Marquez les puits contenant des colonies monoclonales avec un signal ZsGreen soutenu et uniforme. Capturez des images en fond clair et en fluorescence pour documenter la morphologie et l’intensité de la fluorescence.
    REMARQUE : Avant l’imagerie, remplacez le milieu frais pour réduire la fluorescence de fond. Exclure les colonies à morphologie irrégulière ou à autofluorescence.
12. Développez les cellules positives sur des plaques revêtues de 48 puits. Puis scindée en deux parties, l’une pour la culture et l’autre pour le génotypage.
13. Extraire l’ADN génomique de clones candidats. Préparez des réactions PCR avec deux paires d’amorces : une paire pour confirmer l’insertion du gène d’intérêt, l’autre amorce pour distinguer les clones homozygotes et hétérozygotes. Effectuer le thermocyclage dans les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min ; 38 cycles de 95 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 45 s ; extension finale à 72 °C pendant 7 min. Résoudre les produits PCR sur un gel d’agarose à 2 %.
    REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour les apprêts. Confirmer l’insertion du gène d’intérêt par une seule bande de 650 pb (amorce 1). Identifier les clones hétérozygotes par la présence d’une seule bande de 630 pb et les clones homozygotes par l’absence de cette bande (amorce 2).
14. Développez les cellules positives sur des plaques à six puits revêtues.
15. Digérer les cellules et les laver dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par centrifugation à 250 × g pendant 3 min. Congelez les cellules dans un milieu de cryoconservation avec 10 % de DMSO à une densité de 2,5 × 10⁶ cellules par flacon.

2. Greffe de cellules précurseurs dérivées de cellules souches DREADD dans des souris modèles

1. Administrer une injection intrapéritonéale de désipramine à une concentration de 5 mg/mL (10 mg/kg) à des souris immunodéficientes 30 minutes avant la chirurgie. Anesthésie les souris avec de l’isoflurane à 2 %.
2. Effectuer des injections stéréotaxiques unilatérales de 3 μL de 6-hydroxydopamine (6-OHDA, 5 μg/μL). Ciblez le corps droit du striatum à l’aide des coordonnées suivantes : antéropostérieur = 0,5 mm, latéral = 2,1 mm et vertical = -3,2 mm.
   REMARQUE : Le 6-OHDA doit être dissous dans une solution saline contenant 0,2 % d’acide ascorbique. Assurer un ciblage précis pour minimiser la variabilité de la gravité des lésions.
   ATTENTION : Le 6-OHDA est cytotoxique et produit des espèces réactives de l’oxygène qui induisent un stress cellulaire. Manipulez avec précaution.
3. Administrer une injection intrapéritonéale d’apomorphine (1 mg/kg, 0,5 mg/mL dissoute dans une solution saline) pour valider les lésions 4 semaines après l’intervention. Sélectionnez des souris lésées qui présentent plus de 100 rotations controlatérales au cours d’une période d’observation de 30 minutes pour des expériences ultérieures.
   REMARQUE : L’apomorphine est un agoniste des récepteurs de la dopamine, qui active directement les récepteurs postsynaptiques supersensibles dans le striatum dénervé, déséquilibrant l’activité bilatérale du circuit nigrostriatif. La rotation induite par l’apomorphine permet d’évaluer la sévérité des lésions dopaminergiques unilatérales par la 6-OHDA.
4. Cellules de semence et de culture dans des plaques revêtues à six puits (150 000 cellules par puits). Incuber dans le milieu de différenciation de phase 1 pendant 10 jours, en rafraîchissant le milieu tous les 2 jours. Le 11e jour, passer au milieu de différenciation de la phase 2 et poursuivre l’incubation jusqu’au 13e jour, en changeant de milieu chaque jour.
   REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour une comparaison du milieu de différenciation.
5. Récoltez les cellules aux jours 10 et 13 de la différenciation, puis mélangez-les dans un rapport de 1:7. Mettre le mélange en suspension dans le tampon de transplantation à une concentration de 100 000 cellules/μL.
   REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour une comparaison du tampon de transplantation.
6. Administrer une injection stéréotaxique d’un volume total de 4 μL de la suspension cellulaire préparée dans une souris.
7. Effectuez le test du cylindre à différents moments après la transplantation cellulaire. Placez un bécher en verre (diamètre : 20 cm, hauteur : 30 cm) sur une surface plane et non réfléchissante. Placez une caméra de vue de dessus au-dessus du cylindre pour capturer le diamètre complet.
   REMARQUE : Entourez le cylindre de rideaux noirs pour éliminer les stimuli visuels externes.
8. Placez chaque souris au centre du cylindre et lancez l’enregistrement vidéo simultané (3 min/session). Après la session, remettez la souris dans sa cage d’origine.
   REMARQUE : Acclimatez les souris à la salle d’essai pendant 30 min dans des conditions de lumière. Nettoyez le cylindre avec de l’éthanol à 70 % entre les essais pour éliminer les signaux olfactifs.
9. Évaluez la capacité de mouvement des membres supérieurs des souris pendant 3 min. Calculez le nombre de contacts de paroi effectués par le membre antérieur affaibli par rapport au nombre total de contacts effectués par les deux membres antérieurs.
10. Administrer une solution saline ou CNO à une dose de 1,2 mg/kg par injection intrapéritonéale. Effectuer le test du cylindre pour évaluer la modulation comportementale dans le modèle murin après l’administration de CNO
    REMARQUE : Prévoyez une période de récupération d’environ 40 minutes avant de procéder à l’évaluation.

3. Profilage électrophysiologique in vivo de cellules modulées par chimiogénétique

1. Anesthésier les souris par une injection intrapéritonéale de 250 mg/kg de pentobarbital. Extrayez le cerveau et placez-le immédiatement dans du liquide céphalo-rachidien artificiel à base de saccharose glacé (s-ACSF) pour maintenir l’intégrité cellulaire. À l’aide d’un vibratome, coupez le cerveau en sections de 300 à 400 μm d’épaisseur.
   REMARQUE : Travaillez rapidement pour maintenir le cerveau à basse température afin de préserver la fonction cellulaire. Voir le tableau des matériaux pour le s-ACSF utilisé dans la préparation de la section de cerveau frais.
2. Transférez les échantillons dans une chambre remplie d’ACSF équilibrée avec 95 % d’O₂ et 5 % de CO₂ à 34 °C, en veillant à ce que cette température soit maintenue tout au long de l’expérience.
   REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour ACSF.
3. Chargez les pipettes en verre d’une solution intracellulaire glacée, avec une résistance d’électrode allant de 7 à 10 MΩ.
   REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour la solution intracellulaire. Les pipettes en verre sont fabriquées à partir de capillaires en verre par un extracteur de micropipettes¹⁸. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuites dans les pipettes en verre avant de commencer les expériences, en vous assurant que les pointes sont suffisamment tranchantes pour pénétrer la membrane cellulaire. Préparez rapidement les pipettes pour minimiser les fluctuations de température dans la solution intracellulaire.
4. Monter les tranches dans une chambre d’enregistrement immergée superfusionnée (2 mL/min) avec de l’ACSF oxygéné à 34 °C. Positionner les pipettes à l’aide de micromanipulateurs motorisés sous microscopie à contraste interférentiel différentiel infrarouge. Établissez une configuration cellulaire entière en appliquant une aspiration douce (résistance > 1 GΩ) aux neurones patchés dans les régions de greffe. Clamp des cellules à -70 mV à l’aide d’un amplificateur patch-clamp ; acquérir des sEPSC de base pendant 8 min à une fréquence d’échantillonnage de 10 kHz (filtrée à 2 kHz) et surveiller en permanence la résistance d’accès (cible : <20 MΩ ; écarter si >25 MΩ ou fluctuante >10 %).
   REMARQUE : Utilisez une pression appropriée lors de l’application de l’aspiration pour éviter un déplacement ou une rupture indésirable des cellules, et ajustez soigneusement la position de la pipette pour obtenir une bonne étanchéité. Si la qualité du sceau est mauvaise, jetez la pipette et réessayez.
5. Ajoutez 50 μM CNO dans la chambre d’enregistrement immédiatement après avoir terminé la mesure de base et continuez à enregistrer les données pendant 16 minutes supplémentaires tout en observant les changements de fréquence ou d’amplitude du sEPSC.
6. Effectuez une procédure de lavage en remplaçant la solution de CNO par de l’ACSF frais pour éliminer efficacement le CNO de la chambre d’enregistrement. Continuez à enregistrer les données pour le reste de l’expérience afin d’évaluer toute récupération de l’activité synaptique.

Résultats

La figure 1 montre les étapes clés de cette approche méthodologique pour les cellules souches humaines reprogrammées exprimant des récepteurs DREADD excitateurs (hM3Dq) ou inhibiteurs (hM4Di) afin d’évaluer l’intégration fonctionnelle et la modulation des précurseurs dopaminergiques dérivés dans un modèle murin de la maladie de Parkinson (MP). La figure 2 décrit la stratégie d’inhibition génique médiée par ...

Discussion

Ce protocole a utilisé la technologie CRISPR pour concevoir des cellules souches humaines reprogrammées afin d’exprimer les récepteurs excitateurs hM3Dq et inhibiteurs hM4Di. La modulation de l’activité neuronale par la CNO a été évaluée par transplantation cellulaire dans des modèles murins de la maladie de Parkinson, accompagnée d’évaluations comportementales et d’enregistrements électrophysiologiques.

La première étape critique dans la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	used for genotyping analysis
2×Seamless Cloning Mix	Biomed Gene Tech.	CL117-01	used for plasmid construction
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	used for establishing PD mice model
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	used as control
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	original plasmid for construction of hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	original plasmid for construction of hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Used for digesting cells
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	N/A	N/A	125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, and  26 mM NaHCO3
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Supplement	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapine-N-oxide	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramine	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175095
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Iced intracellular fluid	N/A	N/A	130 mM K-gluconate, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% of neurobiotin
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
Laminin	Roche	11243217001
Micropipette Puller	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 software suite	Molecular Devices	N/A	Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software
Phase 1 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, and 100 ng/mL FGF8
Phase 2 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, and 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM ascorbic acid, and 0.5 mM cAMP.
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primers for genotyping	N/A	N/A	Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
sucrose-based artificial cerebrospinal fluid (s-ACSF)			234 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0.5 mM CaCl2, and 10 mM MgSO4
Stem cell culture media	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) and 48% Neurobasal, with the addition of 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, and 3 µM CHIR99021
TGF-βIII	Peprotech	100-36E
Transplantation buffer	N/A	N/A	HBSS buffer with 5 g/L D-glucose, 100 ng/mL BDNF, 100 ng/mL GDNF, and 0.2 mM ascorbic Acid
Vibratome	Leica	VT1000 S
Whole-cell patch-clamp	Molecular Devices	MultiClamp700B