重编程干细胞衍生前体细胞的化学遗传学调控治疗神经退行性疾病

摘要

在这里，我们描述了一种方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，将它们移植到帕金森病的小鼠模型中，并评估行为和电生理结果以确认移植细胞的成功整合和功能有效性，从而改造化学重编程干细胞以实现精确的神经元调节。

摘要

由设计药物 （DREADD） 独家激活的设计受体与基于干细胞的疗法相结合，为精确神经元调节提供了一种先进的策略。在这里，我们利用 CRISPR 工程的表达兴奋性 （hM3Dq） 或抑制性 （hM4Di） DREADD 受体的人类重编程干细胞来评估移植多巴胺能前体在帕金森病 （PD） 小鼠模型中的功能整合和调节。关键步骤包括生成非融合表达 DREADD 的干细胞系，将它们分化为中脑多巴胺能前体，并将这些细胞移植到 6-羟基多巴胺 （6-OHDA） 损伤小鼠的纹状体中。我们进行了行为评估和电生理记录，以分析移植细胞的效果。行为测试，例如气瓶测试，表明氯氮平-N-氧化物 （CNO） 给药后运动功能受到显着调节。具体来说，hM4Di 的激活减少了对侧前肢运动，而 hM3Dq 的激活与增强的运动行为有关。电生理记录显示明显的突触反应。hM4Di 激活增加了自发性兴奋性突触后电流 （sEPSC） 的事件间期和峰值振幅，而 hM3Dq 激活减少了事件间期并增加了峰值振幅，反映了兴奋性信号的增强。总之，行为和电生理学评估的整合验证了工程化化学重编程干细胞精确功能整合到宿主神经回路中。

引言

设计药物专门激活的设计受体 （DREADD） 是工程化的 G 蛋白偶联受体，可被其他惰性合成配体选择性激活¹。化学遗传学方法已成为神经科学中的重要工具，它使研究人员能够高精度地研究神经回路连接，并通过选择性激活或抑制特定大脑区域或细胞类型来增强我们对体内和体外细胞功能的理解 ^2,3。

基于干细胞的疗法为治疗神经退行性疾病提供了一种很有前途的策略。移植细胞的功效取决于对宿主组织的适当整合、存活和功能贡献。不受控制的细胞活动会导致负面后果，包括 肿瘤发生⁴;需要在移植后精确控制这些细胞。在人类重编程干细胞和衍生神经元中利用 DREADD 技术提供了一种通过施用设计药物 CNO ^2,5 精确控制神经元活动的方法。在以多巴胺能神经元丢失为特征的帕金森病 （PD） 的背景下，纵干细胞衍生的多巴胺能神经元的活动对于研究它们在啮齿动物模型中的突触输入和投射模式至关重要 ^6,7,8,9,10。将兴奋性 hM3Dq 和抑制性 hM4Di 受体纳入这些模型可实现神经元活动的精确调节^11,12。

动物行为评估和电生理记录的结合允许全面评估化学遗传学调节对体内移植细胞的影响 ¹³。行为评估，包括阿扑吗啡诱导的旋转、圆柱体测试和旋转测试，评估运动协调并提供有关与 PD¹⁴ 实验模型相关的运动功能变化的见解。膜片钳记录等电生理技术能够实时监测突触反应和动作电位，从而全面了解移植细胞如何整合到现有神经网络^{中 15}。通过将行为评估与电生理学评估相结合，我们可以研究化学遗传学调节如何影响宿主神经回路内这些细胞的整合和功能¹⁶。初步结果表明，CNO 给药可有效调节移植细胞中的神经元活动，从而改善动物模型的功能结果。

在该方案中，通过使用成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 技术，将人类重编程干细胞设计为表达 hM3Dq 或 hM4Di 受体。在将修饰的重编程干细胞分化为中脑多巴胺能前体细胞后，将这些细胞移植到 PD 小鼠模型中，以使用行为评估和电生理记录评估它们在宿主神经回路内的整合和功能调节。

研究方案

所有动物实验均按照北京实验动物科学协会和美国国立卫生研究院制定的实验动物护理和使用指南进行。人外周血单核细胞 （PBMC） 是从健康捐献者那里获得的，并获得了先前研究中描述的书面知情同意书¹⁷。

1. 非融合 DREADD 基于干细胞系的构建

1. 构建 DREADD 供体质粒。
   注意：消化位点应根据载体序列设计。应使用与片段臂匹配的 20-30 bp 重叠合成和扩增片段，以提高组装效率。
   1. 设计并合成 T2A-ZsGreen 片段 （片段 I）。
   2. 使用 PCR（片段 II）从原始质粒中扩增 hM3Dq/hM4Di-T2A 片段。设置 PCR 反应物（总体积 50 μL），以包含 1x PCR 缓冲液、200 μM 每种 dNTP 混合物、0.5 μM 正向和反向引物、10-50 ng 质粒 DNA 模板和 1.25 U 高保真 DNA 聚合酶。在以下条件下进行热循环：在 98 °C 下初始变性 2.75 分钟以使模板完全变性;32 个扩增循环，包括 98 °C 15 秒（变性）、60 °C 30 秒（引物退火）和 72 °C 60 秒（延伸）;在 72 °C 下最终延伸 7 分钟。
   3. 用适当的酶消化载体质粒以获得线性化载体。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所有片段，并使用分光光度计对其进行定量。
      注：在这里，原始质粒用 MluI 和 SalI 消化。
2. 以 1：3：3 的摩尔比例轻轻混合 50-100 ng 线性化载体、片段 I 和片段 II，以及 2x 克隆混合物。将混合物在 55 °C 下孵育 1 小时，以促进通过 Gibson 组装进行同源重组。
3. 将靶向 AAVS1 位点的向导 RNA 插入 pX458 载体的 BbsI 位点。
   注：使用 Sanger 测序对所有构建的质粒进行序列验证。
4. 将重编程的干细胞维持在培养基中，目标是 2-5 × 10⁶ 个细胞/mL 的细胞密度。
   注：此处使用的重编程干细胞是从人 PBMC 诱导的，如先前的研究¹⁷ 中所述。监测细胞健康状况至关重要，因为细胞状态会显著影响电穿孔效率。有关介质的比较，请参阅 材料表 。
5. 将 2-5 × 10^{个 6} 个细胞、2 μg 每种供体质粒（hM4Di-T2A-ZsGreen 或 hM3Dq-T2A-ZsGreen）和 2 μg gRNA 质粒在 100 μL 电穿孔缓冲液中混合，然后转移到比色皿中进行电穿孔。
   注：在进行电穿孔之前，请确保混合物混合充分且无气泡。根据细胞类型优化电穿孔参数，以最大限度地提高转染效率，因为不同的设备可能需要特定的调整。
6. 将 Nucleofector 设置为 B16 程序并启动电穿孔，以促进目标 iNSC 的高效转染。
7. 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 50 μg/mL 聚-D-赖氨酸 （PDL），并在室温下孵育至少 2 小时。从孔中取出所有 PDL，向每个孔中加入 1.5 mL 的 5 μg/mL 层粘连蛋白，并在 37 °C 下孵育 2-4 小时。立即使用包被板或在 2-8 °C 下储存 1 周。
8. 将电穿孔细胞转移到涂有 PDL 和层粘连蛋白的六孔板中。将大约 500,000 个细胞分布在每孔 2 mL 的培养基中。
9. 电穿孔 72 小时后，使用流式细胞仪对荧光阳性细胞进行分选。
   1. 在 DPBS 中重悬解离的细胞，并通过 70 μm 细胞过滤器过滤。
   2. 使用 FITC 通道配置分拣机以进行 ZsGreen 检测。包括未处理的 iNSC 作为阴性对照，以定义基线荧光。
   3. 使用 100 μm 喷嘴在 20 psi 鞘套压力下校准仪器。实施具有单细胞确认的四向纯度分选模式。
10. 将单个 ZsGreen⁺ 细胞接种在预包被有 PDL 和层粘连蛋白的 96 孔板中，每孔添加 200 μL 培养基以支持初始生长。在培养基中保持 7-14 天
    注意：每天监测孔中是否有生长和荧光迹象表明成功整合并标记阳性孔。
11. 使用配备 GFP 滤光片组的倒置荧光显微镜分离显示荧光的单个克隆。以 10 倍放大倍率筛选克隆。标记含有单克隆菌落的孔，具有持续、一致的 ZsGreen 信号。捕获明场和荧光图像以记录形态和荧光强度。
    注：成像前，更换新鲜培养基以减少背景荧光。排除形态不规则或自发荧光的集落。
12. 在包被的 48 孔板上扩增阳性细胞。然后分成两部分，一部分用于培养，另一部分用于基因分型。
13. 从候选克隆中提取基因组 DNA。用两个引物对制备 PCR 反应：一对用于确认目标基因的插入，另一个引物用于区分纯合子和杂合子克隆。在以下条件下进行热循环：在 95 °C 下初始变性 5 分钟;95 °C 30 s、60 °C 30 s 和 72 °C 45 s 的 38 个循环;在 72 °C 下最终延伸 7 分钟。在 2% 琼脂糖凝胶上分离 PCR 产物。
    注：有关引物，请参见 材料表 。通过单个 650 bp 条带（引物 1）确认目标基因的插入。通过存在单个 630 bp 条带来鉴定杂合子克隆，通过不存在该条带来鉴定纯合子克隆（引物 2）。
14. 在包被的六孔板上扩增阳性细胞。
15. 消化细胞，并在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中以 250 × g 离心 3 分钟洗涤它们。将细胞冷冻在含有 10% DMSO 的冻存培养基中，密度为 2.5 × 10⁶ 个细胞/小瓶。

2. 将 DREADD 干细胞来源的前体细胞移植到 PD 模型小鼠中

1. 手术前 30 分钟，对免疫缺陷小鼠腹膜内注射浓度为 5 mg/mL （10 mg/kg） 的地昔帕明。用 2% 异氟醚麻醉小鼠。
2. 进行 3 μL 6-羟基多巴胺 （6-OHDA， 5 μg/μL） 的单侧立体定位注射。使用以下坐标瞄准右纹体：前后 = 0.5 毫米，横向 = 2.1 毫米，垂直 = -3.2 毫米。
   注意：6-OHDA 应溶于含有 0.2% 抗坏血酸的盐水中。确保精确定位，以最大限度地减少病变严重程度的可变性。
   注意：6-OHDA 具有细胞毒性，可产生诱导细胞应激的活性氧。小心处理。
3. 腹膜内注射阿扑吗啡 （1 mg/kg，0.5 mg/mL 溶于盐水） 以验证术后 4 周的病变。选择在 30 分钟观察期内表现出超过 100 次对侧旋转的病变小鼠用于后续实验。
   注意：阿扑吗啡是一种多巴胺受体激动剂，可直接激活去神经支配纹状体中的超敏感突触后受体，从而破坏双侧黑质纹状体回路活性。阿扑吗啡诱导的旋转用于通过 6-OHDA 评估单侧多巴胺能病变的严重程度。
4. 在包被的六孔板中接种和培养细胞（每孔 150,000 个细胞）。在 1 期分化培养基中孵育 10 天，每 2 天刷新一次培养基。第 11 天，切换到 2 期分化培养基并继续孵育直至第 13 天，每天更换培养基。
   注：有关分化培养基的比较，请参见 材料表 。
5. 在分化的第 10 天和第 13 天收获细胞，然后以 1：7 的比例混合。将混合物悬浮在浓度为 100,000 个细胞/μL 的移植缓冲液中。
   注：有关移植缓冲液的比较，请参见 材料表 。
6. 将总体积为 4 μL 的制备细胞悬液立体定向注射到 PD 小鼠中。
7. 在细胞移植后的不同时间点进行圆柱体测试。将玻璃烧杯（直径：20 厘米，高度：30 厘米）放在平坦、不反光的表面上。将俯视相机放置在圆柱体上方以捕获整个直径。
   注意：用黑色窗帘封闭圆柱体以消除外部视觉刺激。
8. 将每个鼠标放在圆柱体的中心并开始同步视频录制（3 分钟/会话）。会话结束后，将鼠标放回其固定架。
   注意：在光照条件下将小鼠适应测试室 30 分钟。在两次试验之间用 70% 乙醇清洁圆筒，以消除嗅觉线索。
9. 评估小鼠的上肢运动能力 3 分钟。计算受损前肢相对于两个前肢接触总数的墙壁接触次数。
10. 通过腹膜内注射以 1.2 mg/kg 的剂量施用生理盐水或 CNO。进行圆柱体测试以评估 CNO 给药后 PD 小鼠模型中的行为调节
    注意：在继续评估之前，请等待大约 40 分钟的恢复期。

3. 化学原调控细胞的体内 电生理分析

1. 通过腹膜内注射 250 mg/kg 戊巴比妥麻醉小鼠。提取大脑并立即将其置于冰冷的基于蔗糖的人工脑脊液 （s-ACSF） 中，以保持细胞完整性。使用振动切片机，将大脑切成 300-400 μm 厚的切片。
   注意：快速工作以保持大脑处于低温以保持细胞功能。有关用于新鲜脑切片制备的 s-ACSF 的材料 表 。
2. 将样品转移到装有 ACSF 的腔室中，在 34 °C 下用 95% O₂ 和 5% CO₂ 平衡，确保在整个实验过程中保持该温度。
   注意：请参阅 ACSF 材料表 。
3. 用冰镇细胞内溶液加载玻璃移液器，电极电阻范围为 7 至 10 MΩ。
   注：有关细胞内溶液 ，请参阅材料表 。玻璃移液器由微量移液器拉拔器¹⁸ 由玻璃毛细管制成。在开始实验之前，检查玻璃移液器中是否有任何泄漏，确保吸头足够锋利以穿透细胞膜。快速准备移液器以尽量减少细胞内溶液中的温度波动。
4. 将切片安装在 34 °C 的含氧 ACSF 超熔 （2 mL/min） 的浸没记录室中。 在红外微分干涉对比显微镜下使用电动显微作器定位移液器。通过对移植区域内的修补神经元施加温和的抽吸（电阻> 1 GΩ）来建立全细胞配置。使用膜片钳放大器以 -70 mV 钳位钳制电池;以 10 kHz 采样率（以 2 kHz 过滤）采集基线 sEPSC 8 分钟，并持续监测访问电阻（目标：<20 MΩ;如果 >25 MΩ 或波动 >10%）则丢弃。
   注意：吸力时应施加适当的压力，以避免不良的细胞移位或破裂，并小心调整移液器位置以实现良好的密封。如果密封质量差，请丢弃移液器并重试。
5. 完成基线测量后立即向记录室中加入 50 μM CNO，并继续记录数据 16 分钟，同时观察 sEPSC 频率或振幅的变化。
6. 通过用新的 ACSF 替换 CNO 溶液来执行冲洗程序，以有效地从记录室中去除 CNO。继续记录实验其余部分的数据，以评估突触活动的任何恢复。

结果

图 1 显示了表达兴奋性 （hM3Dq） 或抑制性 （hM4Di） DREADD 受体的工程化人重编程干细胞的这种方法的关键步骤，以评估帕金森病 （PD） 小鼠模型中衍生的多巴胺能前体的功能整合和调节。 图 2 概述了 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入策略，用于将 hM4Di-T2A-ZsGreen 和 hM3Dq-T2A-ZsGreen 的非融合构建体引入重编程干细胞中，并通过基因分型进?...

讨论

该方案利用 CRISPR 技术来设计人类重编程干细胞以表达兴奋性 hM3Dq 和抑制性 hM4Di 受体。通过将细胞移植到帕金森病的小鼠模型中，并伴有行为评估和电生理记录，评估 CNO 对神经元活动的调节。

在化学遗传学重编程的干细胞中生成稳定表达的非融合 DREADD 构建体的第一个关键步骤涉及 T2A-ZsGreen 双顺反子盒。然而，融合蛋白表达质粒，如 hM3Dq-mCherry 和 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	used for genotyping analysis
2×Seamless Cloning Mix	Biomed Gene Tech.	CL117-01	used for plasmid construction
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	used for establishing PD mice model
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	used as control
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	original plasmid for construction of hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	original plasmid for construction of hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Used for digesting cells
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	N/A	N/A	125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, and  26 mM NaHCO3
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Supplement	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapine-N-oxide	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramine	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175095
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Iced intracellular fluid	N/A	N/A	130 mM K-gluconate, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% of neurobiotin
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
Laminin	Roche	11243217001
Micropipette Puller	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 software suite	Molecular Devices	N/A	Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software
Phase 1 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, and 100 ng/mL FGF8
Phase 2 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, and 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM ascorbic acid, and 0.5 mM cAMP.
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primers for genotyping	N/A	N/A	Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
sucrose-based artificial cerebrospinal fluid (s-ACSF)			234 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0.5 mM CaCl2, and 10 mM MgSO4
Stem cell culture media	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) and 48% Neurobasal, with the addition of 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, and 3 µM CHIR99021
TGF-βIII	Peprotech	100-36E
Transplantation buffer	N/A	N/A	HBSS buffer with 5 g/L D-glucose, 100 ng/mL BDNF, 100 ng/mL GDNF, and 0.2 mM ascorbic Acid
Vibratome	Leica	VT1000 S
Whole-cell patch-clamp	Molecular Devices	MultiClamp700B