Хемогенетическая регуляция в перепрограммированных клетках-предшественниках, полученных из стволовых клеток, в лечении нейродегенеративных заболеваний

Резюме

В данной статье мы описываем протокол инженерии химически перепрограммированных стволовых клеток для достижения точной модуляции нейронов путем дифференцировки этих клеток в дофаминергические клетки-предшественники, их трансплантации мышиным моделям болезни Паркинсона и оценки поведенческих и электрофизиологических результатов для подтверждения успешной интеграции и функциональной эффективности трансплантированных клеток.

Аннотация

Интеграция дизайнерских рецепторов, активируемых исключительно дизайнерскими препаратами (DREADD), с терапией на основе стволовых клеток представляет собой передовую стратегию для точной модуляции нейронов. В данной работе мы использовали CRISPR-инженерные перепрограммированные стволовые клетки человека, экспрессирующие возбуждающие (hM3Dq) или тормозные (hM4Di) рецепторы DREADD для оценки функциональной интеграции и модуляции трансплантированных дофаминергических предшественников в мышиной модели болезни Паркинсона (БП). Ключевые этапы включали создание линий стволовых клеток, экспрессирующих DREADD, дифференцировку их в дофаминергические предшественники среднего мозга и трансплантацию этих клеток в стриатум мышей, пораженных 6-гидроксидофамином (6-OHDA). Мы провели поведенческие оценки и электрофизиологические записи для анализа эффектов трансплантированных клеток. Поведенческие тесты, такие как цилиндрический тест, продемонстрировали значительную модуляцию моторной функции после введения клозапина-N-оксида (CNO). В частности, активация hM4Di снижала контралатеральную подвижность передних конечностей, в то время как активация hM3Dq была связана с улучшением двигательного поведения. Электрофизиологические записи выявили отчетливые синаптические реакции. Активация hM4Di увеличивала интервалы между событиями и уменьшала пиковые амплитуды спонтанных возбуждающих постсинаптических токов (sEPSC), в то время как активация hM3Dq уменьшала интервалы между событиями и увеличивала пиковые амплитуды, отражая усиление возбуждающей сигнализации. Таким образом, интеграция поведенческих и электрофизиологических оценок подтверждает точное функциональное включение сконструированных химически перепрограммированных стволовых клеток в нейронные цепи хозяина.

Введение

Дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADD), представляют собой сконструированные рецепторы, сопряженные с G-белком, которые могут избирательно активироваться инертными^{синтетическими} лигандами. Хемогенетический подход стал важным инструментом в нейробиологии, позволив исследователям исследовать нейронные цепи с высокой точностью и улучшив наше понимание клеточных функций как in vivo, так и in vitro посредством селективной активации или ингибирования определенных областей мозга или типов клеток^.

Терапия на основе стволовых клеток представляет собой многообещающую стратегию лечения нейродегенеративных заболеваний. Эффективность клеток трансплантата зависит от правильной интеграции, выживаемости и функционального вклада в ткани хозяина. Неконтролируемая клеточная активность может привести к негативным последствиям, в том числе к онкогенезу⁴; Это обуславливает необходимость точного контроля над этими клетками после трансплантации. Использование технологии DREADD в перепрограммированных стволовых клетках человека и производных нейронах дает возможность точно контролировать активность нейронов с помощью введения дизайнерского препарата CNO ^2,5. В контексте болезни Паркинсона (БП), которая характеризуется потерей дофаминергических нейронов, манипулирование активностью дофаминергических нейронов, полученных из стволовых клеток, имеет решающее значение для исследования их синаптических входов и проекционных паттернов в моделях грызунов 6,7,8,9,10. Включение возбуждающих рецепторов hM3Dq и тормозных hM4Di в эти модели позволяет точно модулировать активность нейронов^11,12.

Комбинация поведенческих оценок животных и электрофизиологических записей позволяет всесторонне оценить эффекты хемогенетической модуляции на трансплантированные клетки in vivo¹³. Поведенческие оценки, включая вращение, вызванное апоморфином, цилиндрический тест и тест ротарода, оценивают моторную координацию и дают представление об изменениях в двигательной функции, связанных с экспериментальными моделями PD¹⁴. Электрофизиологические методы, такие как запись с помощью патч-клэмпа, позволяют в режиме реального времени отслеживать синаптические реакции и потенциалы действия, обеспечивая всестороннее представление о том, как трансплантированные клетки интегрируются в существующие нейронные сети¹⁵. Комбинируя поведенческие оценки с электрофизиологическими оценками, мы можем исследовать, как хемогенетическая модуляция влияет на интеграцию и функциональность этих клеток в^{нейронных} цепях хозяина. Предварительные результаты свидетельствуют о том, что введение CNO эффективно модулирует активность нейронов в трансплантированных клетках, что приводит к улучшению функциональных результатов на животных моделях.

В этом протоколе перепрограммированные стволовые клетки человека были сконструированы для экспрессии рецепторов hM3Dq или hM4Di с использованием технологии кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR). После дифференцировки модифицированных перепрограммированных стволовых клеток в дофаминергические клетки-предшественники среднего мозга эти клетки были трансплантированы мышиным моделям БП для оценки их интеграции и функциональной регуляции в нейронных цепях хозяина с использованием поведенческих оценок и электрофизиологических записей.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Пекинской ассоциацией науки о лабораторных животных и Национальными институтами здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) были получены от здорового донора с письменного информированного согласия, как описано в^{предыдущем исследовании.}

1. Построение не-слитых клеточных линий на основе DREADD

1. Сконструируйте донорскую плазмиду DREADD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сайты разложения должны быть спроектированы в соответствии с векторной последовательностью. Фрагменты должны быть синтезированы и амплифицированы с перекрытиями 20-30.о., соответствующими плечам фрагментов, для повышения эффективности сборки.
   1. Проектирование и синтез фрагмента T2A-ZsGreen (фрагмент I).
   2. Амплифицируйте фрагмент hM3Dq/hM4Di-T2A из исходной плазмиды с помощью ПЦР (фрагмент II). Настройте реакцию ПЦР (общий объем 50 мкл) так, чтобы она содержала 1x ПЦР-буфер, 200 мкМ каждой смеси dNTP, 0,5 мкМ прямых и обратных праймеров, 10-50 нг плазмидной ДНК-матрицы и 1,25 ЕД высокоточной ДНК-полимеразы. Термоциклирование проводят в следующих условиях: начальная денатурация при 98 °C в течение 2,75 мин для полной денатурации матрицы; 32 цикла амплификации, состоящих из 98 °C в течение 15 с (денатурация), 60 °C в течение 30 с (отжиг грунтовки) и 72 °C в течение 60 с (растяжение); окончательное выдержание при 72 °C в течение 7 мин.
   3. Расщепите векторную плазмиду с помощью соответствующего фермента для получения линеаризованного вектора. Очистите все фрагменты с помощью электрофореза в агарозном геле и количественно оцените их с помощью спектрофотометра.
      Примечание: Здесь исходная плазмида была расщеплена с помощью MluI и SalI.
2. Аккуратно смешайте 50-100 нг линеаризованного вектора, фрагмента I и фрагмента II в молярном соотношении 1:3:3, а также 2x Cloning Mix. Инкубируйте смесь при 55 °C в течение 1 ч, чтобы облегчить гомологичную рекомбинацию с помощью Gibson Assembly.
3. Вставьте направляющую РНК, нацеленную на сайт AAVS1, в сайт BbsI вектора pX458.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните верификацию последовательности всех сконструированных плазмид с помощью секвенирования по Сэнгеру.
4. Поддерживайте перепрограммированные стволовые клетки в среде, стремясь к плотности клеток 2-5 × 10-6 клеток/мл.
   Примечание: Перепрограммированные стволовые клетки, использованные здесь, были индуцированы из человеческих PBMC, как описано в предыдущем исследовании^. Мониторинг состояния клеток имеет важное значение, так как их статус значительно влияет на эффективность электропорации. Смотрите Таблицу материалов для сравнения носителей.
5. Смешайте 2-5 × 10⁶ клеток, по 2 мкг каждой донорской плазмиды (hM4Di-T2A-ZsGreen или hM3Dq-T2A-ZsGreen) и 2 мкг гРНК-плазмиды в 100 мкл буфера для электропорации и перенесите в кювету для электропорации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что смесь хорошо перемешана и не содержит пузырьков, прежде чем приступать к электропорации. Оптимизируйте параметры электропорации в зависимости от типа ячейки, чтобы максимизировать эффективность трансфекции, так как для разных устройств могут потребоваться определенные настройки.
6. Установите Nucleofector на программу B16 и инициируйте электропорацию для обеспечения эффективной трансфекции целевых iNSCs.
7. Добавьте 1 мл 50 мкг/мл поли-D-лизина (PDL) в каждую лунку 6-луночного планшета и инкубируйте при комнатной температуре не менее 2 ч. Удалите все PDL из лунок и добавьте 1,5 мл ламинина 5 мкг/мл в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 2-4 часов. Используйте пластину с покрытием сразу или храните при температуре 2-8 °C в течение 1 недели.
8. Перенесите электропорированные ячейки в шестилуночные планшеты, покрытые PDL и ламинином. Распределите приблизительно 500 000 клеток в лунке в объеме 2 мл питательной среды на лунку.
9. После 72 ч электропорации используйте проточный цитометр для сортировки флуоресцентных положительных клеток.
   1. Ресуспендируйте диссоциированные клетки в DPBS и отфильтруйте через клеточный фильтр 70 мкм.
   2. Сконфигурируйте сортировщик с каналом FITC для обнаружения ZsGreen. Включите необработанные иНСК в качестве отрицательного контроля для определения исходной флуоресценции.
   3. Откалибруйте прибор с помощью сопел 100 μм при давлении оболочки 20 фунтов на квадратный дюйм. Реализуйте четырехсторонний режим сортировки по чистоте с подтверждением по одной ячейке.
10. Поместите одиночные клетки ZsGreen⁺ в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые PDL и ламинином, и добавьте 200 мкл питательной среды на лунку для поддержки начального роста. Выдерживать в питательной среде в течение 7-14 дней
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно контролируйте лунки на наличие признаков роста и флуоресценции, указывающих на успешную интеграцию, и помечайте положительную лунку.
11. Выделите отдельные клоны, проявляющие флуоресценцию, с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного набором фильтров GFP. Клонирование экрана с 10-кратным увеличением. Пометьте лунки, содержащие моноклональные колонии, устойчивым, равномерным сигналом ZsGreen. Захватывайте светлопольные и флуоресцентные изображения для документирования морфологии и интенсивности флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед получением изображения замените свежую среду, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию. Исключите колонии с неправильной морфологией или аутофлуоресценцией.
12. Расширьте положительные ячейки на 48-луночных планшетах с покрытием. Затем разделите на две части, одну для культуры, а другую для генотипирования.
13. Извлечение геномной ДНК из клонов-кандидатов. Приготовьте ПЦР-реакции с двумя парами праймеров: одна пара для подтверждения вставки интересующего гена, другая праймер для различения гомозиготных и гетерозиготных клонов. Термоциклирование выполняют при следующих условиях: начальная денатурация при 95 °С в течение 5 мин; 38 циклов при температуре 95 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 45 с; окончательное выдержание при 72 °C в течение 7 мин. Рассосите продукты ПЦР на 2% агарозном геле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки см. в Таблице материалов . Подтвердите инсерцию интересующего гена с помощью одной полосы 650.о. (праймер 1). Идентификация гетерозиготных клонов по наличию одной полосы 630.о. и гомозиготных клонов по отсутствию этой полосы (праймер 2).
14. Расширьте положительные ячейки на покрытых шестилуночных планшетах.
15. Расщепите клетки и промойте их в фосфатно-солевом буфере (PBS) центрифугированием при 250 × г в течение 3 минут. Заморозьте клетки в криоконсервирующей среде с 10% ДМСО плотностью 2,5 ×^{10 6} клеток во флаконе.

2. Трансплантированные клетки-предшественники стволовых клеток DREADD мышам с моделью БП

1. Внутрибрюшинное введение дезипрамина в концентрации 5 мг/мл (10 мг/кг) мышам с иммунодефицитом за 30 минут до операции. Обезболите мышей 2% изофлураном.
2. Проводят односторонние стереотаксические инъекции 3 мкл 6-гидроксидофамина (6-OHDA, 5 мкг/мкл). Нацеливайтесь на правое полосатое тело, используя следующие координаты: переднезадний = 0,5 мм, латеральный = 2,1 мм и вертикальный = -3,2 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 6-OHDA следует растворять в физрастворе, содержащем 0,2% аскорбиновой кислоты. Обеспечьте точное нацеливание, чтобы свести к минимуму вариабельность тяжести поражения.
   ВНИМАНИЕ: 6-OHDA является цитотоксичным и продуцирует активные формы кислорода, которые вызывают клеточный стресс. Обращайтесь с осторожностью.
3. Введите внутрибрюшинную инъекцию апоморфина (1 мг/кг, 0,5 мг/мл растворенного в физрастворе) для подтверждения поражений через 4 недели после операции. Выберите пораженных мышей, которые демонстрируют более 100 контралатеральных вращений в течение 30-минутного периода наблюдения для последующих экспериментов.
   Апоморфин является агонистом дофаминовых рецепторов, который непосредственно активирует сверхчувствительные постсинаптические рецепторы в денервированном стриатуме, нарушая баланс двусторонней активности нигростриарного контура. Апоморфин-индуцированная ротация служит для оценки тяжести односторонних дофаминергических поражений 6-OHDA.
4. Затравочные и культуральные клетки в покрытых покрытием шестилуночных планшетах (150 000 клеток на лунку). Инкубировать в среде для дифференцировки фазы 1 в течение 10 дней, обновляя среду каждые 2 дня. На 11-й день переключитесь на среду для дифференцировки Фазы 2 и продолжайте инкубацию до 13-го дня, меняя среду каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для сравнения среды дифференцировки.
5. Соберите клетки на 10 и 13 день дифференцировки, затем смешайте их в соотношении 1:7. Суспендировать смесь в буфере для трансплантации в концентрации 100 000 клеток/мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для сравнения буфера для трансплантации.
6. Ввести стереотаксическую инъекцию общего объема 4 мкл приготовленной клеточной суспензии мыши PD.
7. Проведите тест с цилиндром в различные моменты времени после трансплантации клеток. Поместите стеклянный стакан (диаметр: 20 см, высота: 30 см) на плоскую неотражающую поверхность. Расположите камеру верхнего обзора над цилиндром, чтобы захватить весь диаметр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Закройте цилиндр черными шторами, чтобы устранить внешние визуальные раздражители.
8. Поместите каждую мышь в центр цилиндра и начните одновременную запись видео (3 мин/сеанс). После сеанса верните мышь в домашнюю клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Акклиматизируйте мышей в испытательной комнате в течение 30 минут при освещении. Очищайте цилиндр с помощью 70% этанола между испытаниями, чтобы устранить обонятельные сигналы.
9. Оцените способность мышей к передвижению верхних конечностей в течение 3 мин. Рассчитайте количество контактов со стенкой, сделанных поврежденной передней конечностью, по отношению к общему количеству контактов, сделанных обеими передними конечностями.
10. Вводите физиологический раствор или ХНО в дозировке 1,2 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции. Проведите цилиндрический тест для оценки поведенческой модуляции в модели мыши PD после введения CNO
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите период восстановления примерно 40 минут, прежде чем приступать к оценке.

3. Электрофизиологическое профилирование хемогенетически модулированных клеток in vivo

1. Обезболивайте мышей путем внутрибрюшинной инъекции 250 мг/кг пентобарбитала. Извлеките мозг и немедленно поместите его в ледяную искусственную спинномозговую жидкость на основе сахарозы (s-ACSF) для поддержания клеточной целостности. С помощью вибратома разрежьте мозг на участки толщиной 300-400 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы поддерживать мозг при низких температурах для сохранения клеточной функции. Смотрите таблицу материалов для s-ACSF, используемого для подготовки свежего среза мозга.
2. Перенесите образцы в камеру, заполненную ACSF, уравновешенным 95%_O2 и 5%_CO2 при 34 °C, обеспечивая поддержание этой температуры на протяжении всего эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для ACSF.
3. Загрузите стеклянные пипетки ледяным внутриклеточным раствором, с сопротивлением электродов в диапазоне от 7 до 10 МОм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутриклеточного раствора см. Таблицу материалов . Стеклянные пипетки изготавливаются из стеклянных капилляров с помощью микропипетки¹⁸. Перед началом экспериментов проверьте наличие утечек в стеклянных пипетках, убедившись, что наконечники достаточно острые, чтобы проникнуть в клеточную мембрану. Готовьте пипетки быстро, чтобы свести к минимуму колебания температуры внутриклеточного раствора.
4. Монтируйте слайсы в погружную записывающую камеру, переплавленную (2 мл/мин) кислородом ACSF при 34 °C. Позиционирование пипеток с помощью моторизованных микроманипуляторов в инфракрасной дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии. Установите конфигурацию всей клетки путем применения мягкого отсасывания (сопротивление > 1 ГОм) к запатченным нейронам в областях трансплантата. Зажимные ячейки на -70 мВ с помощью патч-клэмплового усилителя; Сбор исходных данных sEPSC в течение 8 мин при частоте дискретизации 10 кГц (фильтрация на частоте 2 кГц) и непрерывный мониторинг сопротивления доступа (целевое значение: <20 МОм; отбрасывание при >25 МОм или колебаниях >10%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующее давление при применении всасывания, чтобы избежать нежелательного смещения или разрыва ячейки, и тщательно отрегулируйте положение пипетки для обеспечения хорошей прилегаемости. Если качество уплотнения оставляет желать лучшего, выбросьте пипетку и повторите попытку.
5. Добавьте 50 мкМ CNO в регистрирующую камеру сразу после завершения базового измерения и продолжайте запись данных еще 16 минут, наблюдая за изменениями частоты или амплитуды sEPSC.
6. Выполните процедуру промывки, заменив раствор CNO свежим ACSF, чтобы эффективно удалить CNO из записывающей камеры. Продолжайте записывать данные до конца эксперимента, чтобы оценить любое восстановление синаптической активности.

Результаты

На рисунке 1 показаны ключевые этапы этого методологического подхода к модифицированным перепрограммированным стволовым клеткам человека, экспрессирующим возбуждающие (hM3Dq) или ингибирующие (hM4Di) рецепторы DREADD для оценки функциональной интеграции и ...

Обсуждение

В этом протоколе использовалась технология CRISPR для создания перепрограммированных стволовых клеток человека для экспрессии возбуждающих рецепторов hM3Dq и ингибирующих hM4Di. Модуляцию нейрональной активности с помощью CNO оценивали путем трансплантации клеток мышиным...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	used for genotyping analysis
2×Seamless Cloning Mix	Biomed Gene Tech.	CL117-01	used for plasmid construction
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	used for establishing PD mice model
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	used as control
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	original plasmid for construction of hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	original plasmid for construction of hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Used for digesting cells
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	N/A	N/A	125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, and  26 mM NaHCO3
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Supplement	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapine-N-oxide	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramine	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175095
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Iced intracellular fluid	N/A	N/A	130 mM K-gluconate, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% of neurobiotin
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
Laminin	Roche	11243217001
Micropipette Puller	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 software suite	Molecular Devices	N/A	Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software
Phase 1 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, and 100 ng/mL FGF8
Phase 2 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, and 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM ascorbic acid, and 0.5 mM cAMP.
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primers for genotyping	N/A	N/A	Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
sucrose-based artificial cerebrospinal fluid (s-ACSF)			234 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0.5 mM CaCl2, and 10 mM MgSO4
Stem cell culture media	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) and 48% Neurobasal, with the addition of 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, and 3 µM CHIR99021
TGF-βIII	Peprotech	100-36E
Transplantation buffer	N/A	N/A	HBSS buffer with 5 g/L D-glucose, 100 ng/mL BDNF, 100 ng/mL GDNF, and 0.2 mM ascorbic Acid
Vibratome	Leica	VT1000 S
Whole-cell patch-clamp	Molecular Devices	MultiClamp700B