Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para diseñar células madre químicamente reprogramadas para lograr una modulación neuronal precisa mediante la diferenciación de estas células en células precursoras dopaminérgicas, trasplantándolas a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson y evaluando los resultados conductuales y electrofisiológicos para confirmar la integración exitosa y la efectividad funcional de las células trasplantadas.

Resumen

La integración de receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) con terapias basadas en células madre presenta una estrategia avanzada para la modulación neuronal precisa. Aquí, utilizamos células madre humanas reprogramadas diseñadas con CRISPR que expresan receptores DREADD excitatorios (hM3Dq) o inhibidores (hM4Di) para evaluar la integración funcional y la modulación de los precursores dopaminérgicos trasplantados en un modelo murino de enfermedad de Parkinson (EP). Los pasos clave incluyeron la generación de líneas de células madre que expresan DREADD sin fusión, la diferenciación en precursores dopaminérgicos del mesencéfalo y el trasplante de estas células al cuerpo estriado de ratones lesionados por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Realizamos evaluaciones conductuales y registros electrofisiológicos para analizar los efectos de las células trasplantadas. Las pruebas de comportamiento, como la prueba del cilindro, demostraron una modulación significativa de la función motora después de la administración de clozapina-N-óxido (CNO). Específicamente, la activación de hM4Di redujo el movimiento contralateral de las extremidades anteriores, mientras que la activación de hM3Dq se asoció con un mejor comportamiento motor. Los registros electrofisiológicos revelaron distintas respuestas sinápticas. La activación de hM4Di aumentó los intervalos entre eventos y disminuyó las amplitudes máximas de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSC), mientras que la activación de hM3Dq disminuyó los intervalos entre eventos y aumentó las amplitudes máximas, lo que refleja una mayor señalización excitatoria. En resumen, la integración de evaluaciones conductuales y electrofisiológicas valida la incorporación funcional precisa de células madre reprogramadas químicamente en los circuitos neuronales del huésped.

Introducción

Los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) son receptores acoplados a proteínas G modificados genéticamente que pueden ser^activados selectivamente por ligandos sintéticos que de otro modo serían inertes. El enfoque quimiogenético se ha convertido en una herramienta esencial en neurociencia al permitir a los investigadores investigar la conectividad de los circuitos neuronales con alta precisión y mejorar nuestra comprensión de las funciones celulares tanto in vivo como in vitro a través de la activación selectiva o inhibición de regiones cerebrales específicas o tipos de células ^2,3.

La terapia basada en células madre presenta una estrategia prometedora para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. La eficacia de las células de injerto depende de la integración adecuada, la supervivencia y la contribución funcional a los tejidos del huésped. La actividad celular descontrolada puede tener consecuencias negativas, incluyendo la tumorigénesis⁴; lo que requiere un control preciso de estas células después del trasplante. El aprovechamiento de la tecnología DREADD en células madre humanas reprogramadas y neuronas derivadas proporciona un medio para controlar con precisión la actividad neuronal a través de la administración del fármaco de diseño CNO ^2,5. En el contexto de la enfermedad de Parkinson (EP), que se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas, la manipulación de la actividad de las neuronas dopaminérgicas derivadas de células madre es crucial para investigar sus entradas sinápticas y patrones de proyección en modelos de roedores 6,7,8,9,10. La incorporación de receptores excitatorios hM3Dq e inhibidores hM4Di en estos modelos permite una modulación precisa de la actividad neuronal^11,12.

La combinación de evaluaciones del comportamiento animal y registros electrofisiológicos permite una evaluación exhaustiva de los efectos de la modulación quimiogenética en las células trasplantadas in vivo¹³. Las evaluaciones conductuales, incluida la rotación inducida por apomorfina, la prueba del cilindro y la prueba del rotarod, evalúan la coordinación motora y proporcionan información sobre los cambios en la función motora asociados con los modelos experimentales de EP¹⁴. Las técnicas electrofisiológicas, como los registros de patch-clamp, permiten el seguimiento en tiempo real de las respuestas sinápticas y los potenciales de acción, proporcionando una visión completa de cómo las células trasplantadas se integran en las redes neuronales existentes¹⁵. Al combinar las evaluaciones conductuales con las evaluaciones electrofisiológicas, podemos investigar cómo la modulación quimiogenética afecta la integración y funcionalidad de estas células dentro de los circuitos neuronales del huésped¹⁶. Los hallazgos preliminares sugieren que la administración de CNO modula eficazmente la actividad neuronal en las células trasplantadas, lo que resulta en mejores resultados funcionales en modelos animales.

En este protocolo, las células madre humanas reprogramadas se diseñaron para expresar receptores hM3Dq o hM4Di mediante el uso de la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR). Después de diferenciar células madre reprogramadas modificadas en células precursoras dopaminérgicas del mesencéfalo, estas células se trasplantaron a modelos de ratón de EP para evaluar su integración y regulación funcional dentro de los circuitos neuronales del huésped mediante evaluaciones de comportamiento y registros electrofisiológicos.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por la Asociación de Beijing para la Ciencia de los Animales de Laboratorio y los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se obtuvieron de un donante sano con el consentimiento informado por escrito, como se describe en un estudio previo¹⁷.

1. Construcción de líneas celulares basadas en células madre DREADD no fusionadas

1. Construye el plásmido donante DREADD.
   NOTA: Los sitios de digestión deben diseñarse de acuerdo con la secuencia vectorial. Los fragmentos deben sintetizarse y amplificarse con superposiciones de 20-30 pb que coincidan con los brazos de los fragmentos para mejorar la eficiencia del ensamblaje.
   1. Diseñar y sintetizar el fragmento T2A-ZsGreen (Fragmento I).
   2. Amplifique el fragmento hM3Dq/hM4Di-T2A a partir del plásmido original mediante PCR (Fragmento II). Configure la reacción de PCR (50 μL de volumen total) para que contenga 1x tampón de PCR, 200 μM de cada mezcla dNTP, 0,5 μM de cebadores directos e inversos, 10-50 ng de molde de ADN plasmídico y 1,25 U de ADN polimerasa de alta fidelidad. Realice el termociclado en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 98 °C durante 2,75 min para desnaturalizar completamente la plantilla; 32 ciclos de amplificación de 98 °C durante 15 s (desnaturalización), 60 °C durante 30 s (recocido de imprimación) y 72 °C durante 60 s (extensión); extensión final a 72 °C durante 7 min.
   3. Digiera el plásmido vectorial con la enzima adecuada para obtener el vector linealizado. Purificar todos los fragmentos mediante electroforesis en gel de agarosa y cuantificarlos mediante un espectrofotómetro.
      NOTA: Aquí, el plásmido original se digirió con MluI y SalI.
2. Mezcle suavemente 50-100 ng del vector linealizado, el Fragmento I y el Fragmento II en una proporción molar de 1:3:3, junto con 2x Cloning Mix. Incubar la mezcla a 55 °C durante 1 h para facilitar la recombinación homóloga a través del ensamblaje de Gibson.
3. Inserte el ARN guía dirigido al sitio AAVS1 en el sitio BbsI del vector pX458.
   NOTA: Realice la verificación de la secuencia en todos los plásmidos construidos mediante la secuenciación de Sanger.
4. Mantenga las células madre reprogramadas en el medio, con el objetivo de una densidad celular de 2-5 × 10⁶ células/mL.
   NOTA: Las células madre reprogramadas utilizadas aquí fueron inducidas a partir de PBMC humanas como se describe en un estudio anterior¹⁷. El monitoreo de la salud de la célula es esencial, ya que el estado de la célula afecta significativamente la eficiencia de la electroporación. Consulte la Tabla de Materiales para una comparación de los medios.
5. Mezcle 2-5 × 10⁶ células, 2 μg de cada plásmido donante (hM4Di-T2A-ZsGreen o hM3Dq-T2A-ZsGreen) y 2 μg de plásmido de ARNg en 100 μL de tampón de electroporación y transfiéralo a una cubeta para la electroporación.
   NOTA: Asegúrese de que la mezcla esté bien mezclada y libre de burbujas antes de proceder a la electroporación. Optimice los parámetros de electroporación en función del tipo de celda para maximizar la eficiencia de la transfección, ya que los diferentes dispositivos pueden requerir ajustes específicos.
6. Configure el Nucleofector en el programa B16 e inicie la electroporación para facilitar la transfección eficiente de las iNSC objetivo.
7. Agregue 1 mL de 50 μg/mL de poli-D-lisina (PDL) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incube a temperatura ambiente durante al menos 2 h. Retire todo el PDL de los pocillos y añada 1,5 mL de una laminina de 5 μg/mL a cada pocillo e incube a 37 °C durante 2-4 h. Utilice la placa recubierta inmediatamente o guárdela a 2-8 °C durante 1 semana.
8. Transfiera las celdas electroporadas a placas de seis pocillos que hayan sido recubiertas con PDL y laminina. Distribuya aproximadamente 500.000 células por pocillo en un volumen de 2 mL de medio de cultivo por pocillo.
9. Después de 72 h de electroporación, utilice un citómetro de flujo para clasificar las células fluorescentes positivas.
   1. Vuelva a suspender las células disociadas en DPBS y filtre a través de un filtro de células de 70 μm.
   2. Configure el clasificador con el canal FITC para la detección de ZsGreen. Incluya las iNSC no tratadas como controles negativos para definir la fluorescencia de referencia.
   3. Calibre el instrumento utilizando boquillas de 100 μm a una presión de vaina de 20 psi. Implemente un modo de clasificación de pureza de cuatro vías con confirmación de una sola celda.
10. Coloque células individuales de ZsGreen⁺ en placas de 96 pocillos prerrecubiertas con PDL y laminina, y agregue 200 μL de medio de cultivo por pocillo para respaldar el crecimiento inicial. Mantener en medio de cultivo durante 7-14 días
    NOTA: Monitoree los pocillos diariamente para detectar signos de crecimiento y fluorescencia que indiquen una integración exitosa y marque el pocillo positivo.
11. Aísle clones individuales que exhiban fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un juego de filtros GFP. Clones de pantalla con un aumento de 10x. Marque los pocillos que contienen colonias monoclonales con una señal ZsGreen sostenida y uniforme. Capture imágenes de campo claro y fluorescencia para documentar la morfología y la intensidad de la fluorescencia.
    NOTA: Antes de tomar imágenes, reemplace el medio nuevo para reducir la fluorescencia de fondo. Excluir colonias con morfología irregular o autofluorescencia.
12. Expanda las celdas positivas en placas recubiertas de 48 pocillos. Luego se divide en dos partes, una para el cultivo y otra para el genotipado.
13. Extraer ADN genómico de clones candidatos. Preparar reacciones de PCR con dos pares de cebadores: un par para confirmar la inserción del gen de interés, el otro cebador para distinguir clones homocigotos y heterocigotos. Realice el termociclado en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min; 38 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s; extensión final a 72 °C durante 7 min. Resuelva los productos de PCR en un gel de agarosa al 2%.
    NOTA: Ver Tabla de Materiales para las imprimaciones. Confirmar la inserción del gen de interés por una sola banda de 650 pb (cebador 1). Identificar los clones heterocigotos por la presencia de una sola banda de 630 pb y los clones homocigotos por la ausencia de esta banda (cebador 2).
14. Expanda las células positivas en placas recubiertas de seis pocillos.
15. Digiera las células y lávelas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por centrifugación a 250 × g durante 3 min. Congele las células en medio de criopreservación con DMSO al 10% a una densidad de 2,5 × 10⁶ células por vial.

2. Trasplante de células precursoras derivadas de células madre DREADD en ratones modelo de EP

1. Administrar una inyección intraperitoneal de desipramina a una concentración de 5 mg/mL (10 mg/kg) a ratones inmunodeficientes 30 min antes de la cirugía. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 2%.
2. Realizar inyecciones estereotáxicas unilaterales de 3 μL de 6-hidroxidopamina (6-OHDA, 5 μg/μL). Diríjase al cuerpo estriado derecho utilizando las siguientes coordenadas: anteroposterior = 0,5 mm, lateral = 2,1 mm y vertical = -3,2 mm.
   NOTA: El 6-OHDA debe disolverse en solución salina que contenga un 0,2% de ácido ascórbico. Garantice una focalización precisa para minimizar la variabilidad en la gravedad de las lesiones.
   PRECAUCIÓN: El 6-OHDA es citotóxico y produce especies reactivas de oxígeno que inducen estrés celular. Manéjelo con cuidado.
3. Administrar una inyección intraperitoneal de apomorfina (1 mg/kg, 0,5 mg/mL disuelto en solución salina) para validar las lesiones 4 semanas después de la cirugía. Seleccione ratones lesionados que exhiban más de 100 rotaciones contralaterales dentro de un período de observación de 30 minutos para experimentos posteriores.
   NOTA: La apomorfina es un agonista del receptor de dopamina, que activa directamente los receptores postsinápticos supersensibles en el cuerpo estriado denervado, desequilibrando la actividad del circuito nigroestriado bilateral. La rotación inducida por apomorfina sirve para evaluar la gravedad de las lesiones dopaminérgicas unilaterales por 6-OHDA.
4. Siembra y cultivo de células en placas recubiertas de seis pocillos (150.000 células por pocillo). Incubar en medio de diferenciación de Fase 1 durante 10 días, refrescando el medio cada 2 días. El día 11, cambie al medio de diferenciación de la Fase 2 y continúe la incubación hasta el día 13, cambiando el medio cada día.
   NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una comparación del medio de diferenciación.
5. Coseche las células en los días 10 y 13 de diferenciación, luego mézclelas en una proporción de 1:7. Suspender la mezcla en tampón de trasplante a una concentración de 100.000 células/μL.
   NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una comparación del tampón de trasplante.
6. Administrar una inyección estereotáxica de un volumen total de 4 μL de la suspensión celular preparada en un ratón con EP.
7. Realice la prueba del cilindro en varios puntos de tiempo después del trasplante de células. Coloque un vaso de vidrio (diámetro: 20 cm, altura: 30 cm) sobre una superficie plana y no reflectante. Coloque una cámara de vista superior sobre el cilindro para capturar el diámetro completo.
   NOTA: Cierre el cilindro con cortinas negras para eliminar los estímulos visuales externos.
8. Coloque cada ratón en el centro del cilindro e inicie la grabación de vídeo simultánea (3 min/sesión). Después de la sesión, devuelva el mouse a su jaula de inicio.
   NOTA: Aclimate a los ratones a la sala de pruebas durante 30 minutos en condiciones de luz. Limpie el cilindro con etanol al 70% entre ensayos para eliminar las señales olfativas.
9. Evalúe la capacidad de movimiento de las extremidades superiores de los ratones durante 3 minutos. Calcule el número de contactos de la pared realizados por la extremidad anterior deteriorada en relación con el número total de contactos realizados por ambas extremidades anteriores.
10. Administrar solución salina o CNO a una dosis de 1,2 mg/kg mediante inyección intraperitoneal. Realizar la prueba del cilindro para evaluar la modulación del comportamiento en el modelo de ratón DP después de la administración de CNO
    NOTA: Espere un período de recuperación de aproximadamente 40 minutos antes de continuar con la evaluación.

3. Perfil electrofisiológico in vivo de células moduladas quimiogenéticamente

1. Anestesiar ratones mediante una inyección intraperitoneal de 250 mg/kg de pentobarbital. Extraiga el cerebro y colóquelo inmediatamente en líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa helada (s-ACSF) para mantener la integridad celular. Con un vibrátomo, corte el cerebro en secciones de 300-400 μm de grosor.
   NOTA: Trabaje rápidamente para mantener el cerebro a bajas temperaturas para preservar la función celular. Consulte la Tabla de materiales para el s-ACSF utilizado en la preparación de secciones de cerebro fresco.
2. Transfiera las muestras a una cámara llena de ACSF equilibrado con 95% de_O2 y 5% de CO₂ a 34 °C, asegurándose de que esta temperatura se mantenga durante todo el experimento.
   NOTA: Ver Tabla de Materiales para ACSF.
3. Cargue pipetas de vidrio con solución intracelular helada, con una resistencia del electrodo que oscile entre 7 y 10 MΩ.
   NOTA: Ver Tabla de Materiales para solución intracelular. Las pipetas de vidrio se fabrican a partir de capilares de vidrio mediante un extractor de micropipetas¹⁸. Compruebe si hay fugas en las pipetas de vidrio antes de comenzar los experimentos, asegurándose de que las puntas estén lo suficientemente afiladas como para penetrar en la membrana celular. Prepare las pipetas rápidamente para minimizar las fluctuaciones de temperatura en la solución intracelular.
4. Monte los cortes en una cámara de registro sumergida superfundida (2 mL/min) con ACSF oxigenado a 34 °C. Coloque las pipetas utilizando micromanipuladores motorizados bajo microscopía de contraste de interferencia diferencial infrarroja. Establezca la configuración de la célula completa aplicando una succión suave (resistencia > 1 GΩ) a las neuronas parcheadas dentro de las regiones de injerto. Celdas de sujeción a -70 mV utilizando un amplificador de pinza de parche; adquiera sEPSC de referencia durante 8 minutos a una frecuencia de muestreo de 10 kHz (filtradas a 2 kHz) y supervise continuamente la resistencia de acceso (objetivo: <20 MΩ; descarte si >25 MΩ o si fluctúa >10%).
   NOTA: Utilice la presión adecuada al aplicar la succión para evitar desplazamientos o rupturas celulares no deseados, y ajuste cuidadosamente la posición de la pipeta para lograr un buen sellado. Si la calidad del sellado es mala, deseche la pipeta y vuelva a intentarlo.
5. Agregue 50 μM de CNO a la cámara de registro inmediatamente después de completar la medición de referencia y continúe registrando datos durante 16 minutos adicionales mientras observa cambios en la frecuencia o amplitud de sEPSC.
6. Realice un procedimiento de lavado reemplazando la solución de CNO con ACSF fresco para eliminar eficazmente el CNO de la cámara de grabación. Continúe registrando datos durante el resto del experimento para evaluar cualquier recuperación en la actividad sináptica.

Resultados

La Figura 1 muestra los pasos clave de este enfoque metodológico para células madre humanas reprogramadas modificadas que expresan receptores DREADD excitatorios (hM3Dq) o inhibidores (hM4Di) para evaluar la integración funcional y la modulación de los precursores dopaminérgicos derivados en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson (EP). La Figura 2 describe la estrategia de knock-in de genes mediada por CRISPR/Cas...

Discusión

Este protocolo utilizó la tecnología CRISPR para diseñar células madre humanas reprogramadas para expresar receptores excitatorios hM3Dq e inhibidores hM4Di. La modulación de la actividad neuronal por CNO se evaluó mediante trasplante celular en modelos murinos de enfermedad de Parkinson, acompañado de evaluaciones conductuales y registros electrofisiológicos.

El primer paso crítico en la generación de construcciones DREADD expresadas de manera estab...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	used for genotyping analysis
2×Seamless Cloning Mix	Biomed Gene Tech.	CL117-01	used for plasmid construction
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	used for establishing PD mice model
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	used as control
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	original plasmid for construction of hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	original plasmid for construction of hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Constructed donor plasmid based on #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Used for digesting cells
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Artificial cerebrospinal fluid (ACSF)	N/A	N/A	125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, and  26 mM NaHCO3
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Supplement	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapine-N-oxide	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramine	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175095
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Iced intracellular fluid	N/A	N/A	130 mM K-gluconate, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% of neurobiotin
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
Laminin	Roche	11243217001
Micropipette Puller	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 software suite	Molecular Devices	N/A	Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software
Phase 1 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, and 100 ng/mL FGF8
Phase 2 differentiation medium	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, and 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM ascorbic acid, and 0.5 mM cAMP.
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primers for genotyping	N/A	N/A	Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
sucrose-based artificial cerebrospinal fluid (s-ACSF)			234 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0.5 mM CaCl2, and 10 mM MgSO4
Stem cell culture media	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) and 48% Neurobasal, with the addition of 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, and 3 µM CHIR99021
TGF-βIII	Peprotech	100-36E
Transplantation buffer	N/A	N/A	HBSS buffer with 5 g/L D-glucose, 100 ng/mL BDNF, 100 ng/mL GDNF, and 0.2 mM ascorbic Acid
Vibratome	Leica	VT1000 S
Whole-cell patch-clamp	Molecular Devices	MultiClamp700B