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Method Article
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung chemisch umprogrammierter Stammzellen, um eine präzise neuronale Modulation zu erreichen, indem diese Zellen in dopaminerge Vorläuferzellen differenziert, in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert und verhaltensbezogene und elektrophysiologische Ergebnisse ausgewertet werden, um die erfolgreiche Integration und funktionelle Wirksamkeit der transplantierten Zellen zu bestätigen.
Die Integration von Designer-Rezeptoren, die ausschließlich durch Designerdrogen aktiviert werden (DREADD), mit stammzellbasierten Therapien stellt eine fortschrittliche Strategie zur präzisen neuronalen Modulation dar. Hier verwendeten wir CRISPR-technisch veränderte humane Stammzellen, die exzitatorische (hM3Dq) oder inhibitorische (hM4Di) DREADD-Rezeptoren exprimieren, um die funktionelle Integration und Modulation von transplantierten dopaminergen Vorläufern in einem Mausmodell der Parkinson-Krankheit (PD) zu bewerten. Zu den wichtigsten Schritten gehörten die Generierung von nicht-fusionellen DREADD-exprimierenden Stammzelllinien, deren Differenzierung in dopaminerge Vorläufer des Mittelhirns und die Transplantation dieser Zellen in das Striatum von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)-läsionierten Mäusen. Wir führten Verhaltensbewertungen und elektrophysiologische Aufzeichnungen durch, um die Auswirkungen der transplantierten Zellen zu analysieren. Verhaltenstests, wie z. B. der Zylindertest, zeigten eine signifikante Modulation der motorischen Funktion nach Verabreichung von Clozapin-N-oxid (CNO). Insbesondere reduzierte die Aktivierung von hM4Di die kontralaterale Bewegung der Vordergliedmaßen, während die Aktivierung von hM3Dq mit einem verbesserten motorischen Verhalten verbunden war. Elektrophysiologische Ableitungen zeigten deutliche synaptische Reaktionen. Die hM4Di-Aktivierung erhöhte die Ereignisintervalle und verringerte die Spitzenamplituden spontaner exzitatorischer postsynaptischer Ströme (sEPSCs), während die hM3Dq-Aktivierung die Ereignisintervalle verringerte und die Spitzenamplituden erhöhte, was eine verstärkte exzitatorische Signalübertragung widerspiegelt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Integration von Verhaltens- und elektrophysiologischen Bewertungen den präzisen funktionellen Einbau von chemisch umprogrammierten Stammzellen in die neuronalen Schaltkreise des Wirts validiert.
Designer-Rezeptoren, die ausschließlich durch Designerdrogen (DREADD) aktiviert werden, sind technisch hergestellte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die selektiv durch ansonsten inerte synthetische Liganden aktiviert werden können1. Der chemogenetische Ansatz ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug in den Neurowissenschaften geworden, da er es Forschern ermöglicht, die Konnektivität neuronaler Schaltkreise mit hoher Präzision zu untersuchen und unser Verständnis der zellulären Funktionen sowohl in vivo als auch in vitro durch die selektive Aktivierung oder Hemmung bestimmter Gehirnregionen oder Zelltypen zu verbessern 2,3.
Die stammzellbasierte Therapie stellt eine vielversprechende Strategie zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen dar. Die Wirksamkeit von Transplantatzellen hängt von der richtigen Integration, dem Überleben und dem funktionellen Beitrag zum Wirtsgewebe ab. Unkontrollierte zelluläre Aktivität kann zu negativen Folgen führen, einschließlich Tumorgenese4; Dies erfordert eine präzise Kontrolle dieser Zellen nach der Transplantation. Die Nutzung der DREADD-Technologie in menschlichen reprogrammierten Stammzellen und abgeleiteten Neuronen bietet die Möglichkeit, die neuronale Aktivität durch die Verabreichung des Designermedikaments CNO 2,5 präzise zu steuern. Im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit (PD), die durch den Verlust dopaminerger Neuronen gekennzeichnet ist, ist die Manipulation der Aktivität von aus Stammzellen stammenden dopaminergen Neuronen entscheidend für die Untersuchung ihrer synaptischen Inputs und Projektionsmuster in Nagetiermodellen 6,7,8,9,10. Die Integration von exzitatorischen hM3Dq- und inhibitorischen hM4Di-Rezeptoren in diese Modelle ermöglicht eine präzise Modulation der neuronalen Aktivität11,12.
Die Kombination von tierischen Verhaltensuntersuchungen und elektrophysiologischen Aufzeichnungen ermöglicht eine umfassende Bewertung der Auswirkungen der chemogenetischen Modulation auf transplantierte Zellen in vivo13. Verhaltensbewertungen, einschließlich der Apomorphin-induzierten Rotation, des Zylindertests und des Rotarod-Tests, bewerten die motorische Koordination und geben Einblicke in Veränderungen der motorischen Funktion, die mit experimentellen Modellen von PD14 verbunden sind. Elektrophysiologische Techniken, wie z. B. Patch-Clamp-Aufzeichnungen, ermöglichen die Echtzeitüberwachung synaptischer Reaktionen und Aktionspotentiale und bieten einen umfassenden Überblick darüber, wie sich transplantierte Zellen in bestehende neuronale Netzwerke integrieren15. Durch die Kombination von Verhaltensbewertungen mit elektrophysiologischen Bewertungen können wir untersuchen, wie sich die chemogenetische Modulation auf die Integration und Funktionalität dieser Zellen in den neuronalen Schaltkreisen des Wirts auswirkt16. Vorläufige Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verabreichung von CNOs die neuronale Aktivität in transplantierten Zellen effektiv moduliert, was zu verbesserten funktionellen Ergebnissen in Tiermodellen führt.
In diesem Protokoll wurden humane reprogrammierte Stammzellen so verändert, dass sie hM3Dq- oder hM4Di-Rezeptoren exprimieren, indem die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) verwendet wurde. Nach der Differenzierung modifizierter reprogrammierter Stammzellen in dopaminerge Vorläuferzellen des Mittelhirns wurden diese Zellen in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert, um ihre Integration und funktionelle Regulation innerhalb der neuronalen Schaltkreise des Wirts mithilfe von Verhaltensbewertungen und elektrophysiologischen Aufzeichnungen zu bewerten.
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Beijing Association for Laboratory Animal Science und der National Institutes of Health for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden von einem gesunden Spender mit schriftlicher Einverständniserklärung gewonnen, wie in einer früheren Studiebeschrieben 17.
1. Konstruktion von nicht-fusionsbasierten DREADD-Stammzelllinien
2. Transplantierte aus DREADD-Stammzellen gewonnene Vorläuferzellen in Parkinson-Modellmäuse
3. In vivo elektrophysiologisches Profiling chemogenetisch modulierter Zellen
Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte dieses methodischen Ansatzes für gentechnisch veränderte humane Stammzellen, die exzitatorische (hM3Dq) oder inhibitorische (hM4Di) DREADD-Rezeptoren exprimieren, um die funktionelle Integration und Modulation abgeleiteter dopaminerger Vorläufer in einem Mausmodell der Parkinson-Krankheit (PD) zu bewerten. Abbildung 2 zeigt die CRISPR/Cas9-vermittelte Gen-Knock-in-Strategie zur Einf?...
Dieses Protokoll nutzte die CRISPR-Technologie, um menschliche reprogrammierte Stammzellen so zu entwickeln, dass sie exzitatorische hM3Dq- und inhibitorische hM4Di-Rezeptoren exprimieren. Die Modulation der neuronalen Aktivität durch CNO wurde durch Zelltransplantation in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit untersucht, begleitet von Verhaltensbewertungen und elektrophysiologischen Aufzeichnungen.
Der erste entscheidende Schritt bei der Erzeugung stabil expri...
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Beijing Natural Science Foundation (7242068), der National Natural Science Foundation of China (82171250), dem Beijing Municipal Health Commission Fund (PXM2020_026283_000005) und dem Projekt für Technologieentwicklung der mit Peking verbundenen medizinischen Forschungsinstitute (11000023T000002036310).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 x Rapid Taq Master Mix | Vazyme | P222-01 | used for genotyping analysis |
2×Seamless Cloning Mix | Biomed Gene Tech. | CL117-01 | used for plasmid construction |
6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | used for establishing PD mice model |
AAVS1-Pur-CAG-EGFP | Addgene | 80945 | used as control |
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry | Addgene | 80947 | original plasmid for construction of hM4Di-T2A-ZsGreen |
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry | Addgene | 80948 | original plasmid for construction of hM3Dq-T2A-ZsGreen |
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen | N/A | N/A | Constructed donor plasmid based on #80947 |
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen | N/A | N/A | Constructed donor plasmid based on #80948 |
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Used for digesting cells |
AMAXA Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
Artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | N/A | N/A | 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glucose, and 26 mM NaHCO3 |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 1043003 | |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | |
cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
CHIR99021 | Yeasen | 53003ES10 | |
Clozapine-N-oxide | Enzo | BML-NS105 | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Desipramine | Sigma-Aldrich | D3900 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
GlutaMax | Gibco | 35050-061 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
Human leukemia inhibitory factor (hrLIF) | Millipore | LIF1010 | |
Iced intracellular fluid | N/A | N/A | 130 mM K-gluconate, 16 mM KCl, 0.2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0.4 mM Na3-GTP, 0.3% of neurobiotin |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
Laminin | Roche | 11243217001 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
N-2 Supplement | Thermo Fisher | 17502048 | |
Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888-022 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
pCLAMP 11 software suite | Molecular Devices | N/A | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
Phase 1 differentiation medium | N/A | N/A | 96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 µM SAG1, and 100 ng/mL FGF8 |
Phase 2 differentiation medium | N/A | N/A | 96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% B-27 Supplement, 1% N-2 Supplement, 1% NEAA, and 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-βIII, 10 µM DAPT, 0.2 mM ascorbic acid, and 0.5 mM cAMP. |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Primers for genotyping | N/A | N/A | Insertion Foward: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Insertion Reverse: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Homozygosity Foward:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Homozygosity Reverse: GATCCTCTCTGGCTCCATCG |
pX458 | Addgene | 152199 | |
SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
SB431542 | Yeasen | 53004ES50 | |
sucrose-based artificial cerebrospinal fluid (s-ACSF) | 234 mM sucrose, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucose, 0.5 mM CaCl2, and 10 mM MgSO4 | ||
Stem cell culture media | N/A | N/A | 48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) and 48% Neurobasal, with the addition of 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µM SB431542, and 3 µM CHIR99021 |
TGF-βIII | Peprotech | 100-36E | |
Transplantation buffer | N/A | N/A | HBSS buffer with 5 g/L D-glucose, 100 ng/mL BDNF, 100 ng/mL GDNF, and 0.2 mM ascorbic Acid |
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Whole-cell patch-clamp | Molecular Devices | MultiClamp700B |
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