فحص حقول العدس لوجود ذبول الفيوزاريوم وتعفن الجذور في تركيا في ظل المناخ الأرضي

Summary

وجدت دراسة أجريت في مقاطعة يوزغات أن العوامل الحيوية ، مثل الأمراض الفطرية مثل الذبول وتعفن الجذور ، تحد من إنتاج العدس. تم العثور على عزلات الفيوزاريوم في 95.4٪ من العينات ، مما يشير إلى مسوحات محلية دورية ومراقبة منتظمة لتطوير التكنولوجيا المستدامة واستراتيجيات المكافحة الفعالة.

Abstract

العدس هو نبات مهم من محاصيل البقوليات ذاتية التلقيح. إنتاجه محدود بعوامل حيوية مختلفة ، وخاصة العوامل الفطرية التي تسبب مركب الذبول وتعفن الجذور. هدفت الدراسة إلى فهم علم الأوبئة الإقليمية ومسببات العوامل الفطرية المسببة للأمراض النباتية لتطوير استراتيجيات مكافحة الفيوزاريوم المنقول بالتربة. بحثت هذه الدراسة في 83 موقعا لبذر العدس في مقاطعة يوزغات بحثا عن أمراض الذبول وتعفن الجذور والتاج التي تسببها أنواع الفيوزاريوم الشائعة خلال عامي 2022 و 2023. تم جمع نباتات العدس ذات الأعراض لعزل الفطريات وتحديدها. تم تجميع عزلات الفيوزاريوم وفقا لمورفولوجيا المستعمرة واستزراعها على وسط المساعد الشخصي الرقمي. علاوة على ذلك ، تم تحليل الحمض النووي الجيني الذي تم الحصول عليه من عزلات الفيوزاريوم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ومقارنتها مع عزلات الفيوزاريوم الأخرى المسجلة في NCBI GenBank. تم تحديد العلاقات الجينية بين عزلات الفيوزاريوم باستخدام طريقة الحد الأقصى للبخل (MP) في برنامج Mega 11. تم تحديد النتائج ومتوسط معدل الإصابة وشدة المرض لأمراض الذبول وتعفن الجذور في مقاطعة يوزغات بنسبة 16.9٪ و 38.6٪ على التوالي. تم العثور على عزلات الفيوزاريوم في 95.4٪ من العينات. كان هناك تجانس تسلسل النيوكليوتيدات بنسبة 99.5٪ إلى 100٪ بين F. oxysporum و F. culmorum و F. graminearum و F. acuminatum و F. solani عزلات ، والأنواع الأكثر عزلة كانت F. oxysporum. تم تقسيم مخطط الشجيرات MP لعزلات الفيوزاريوم إلى فرعين رئيسيين ، تضمن الفرع الأول جميع عزلات F. solani . وشمل الفرع الرئيسي الثاني أنواعا أخرى من الفيوزاريوم معزولة في هذه الدراسة وفي NCBI GenBank. تقترح الدراسة مسوحات محلية دورية لتحديد تواتر ذبول الفيوزاريوم لقمع العدس. يقترح بشدة قمع الأضرار القائمة على الفيوزاريوم في الوقت المناسب للسيطرة على المرض والحفاظ على نظام إنتاج العدس.

Introduction

العدس (Lens culinaris Medik.) ، وهو بقوليات صغيرة صالحة للأكل تنتمي إلى عائلة البقوليات ، هو محصول ذاتي التلقيح في الموسم البارد بأوراق تشبه الإبرة وأزهار بيضاء إلى أرجوانية شاحبة أو أرجوانية داكنة¹. تم تدجينها من قبل البشر منذ حوالي 10,000 عام في جزء بلاد ما بين النهرين من الهلال الخصيب وسرعان ما انتشرت إلى العالم الجديد ، بما في ذلك حوض البحر الأبيض المتوسط وآسيا الوسطى ، وبعد ذلك تم تجنيسها في الأمريكتين². تبلغ مساحة زراعة العدس العالمية حوالي 5.5 مليون هكتار بإنتاج 6.6 مليون طن³. تحتل تركيا المرتبة^{الرابعة} في إنتاج العدس بعد كندا والهند وأستراليا. تعتبر زراعة العدس في تركيا مهمة جدا وتمثل 6.7٪ من الإنتاج العالمي. يبلغ إجمالي إنتاج العدس في تركيا 474.000 طن ويتم إنتاجه في 40 مقاطعة على الأقل^. حوالي 89.5٪ من إنتاج العدس في تركيا يتكون من العدس الأحمر والأخضر ، والذي يشكل 10.5٪ من محصول الشتاء في منطقة جنوب شرق الأناضول. يزرع باقي المحصول كمحاصيل صيفية. تساهم محافظات يوزغات (39.5٪) وقونية (23.7٪) وقرشهير (16.3٪) وتشوروم (7.6٪) وأنقرة (2.9٪) بشكل كبير في إنتاج العدس الأخضر⁴. يمكن أن يكون إنتاج العدس محدودا بعوامل الإجهاد الحيوي وغير الأحيائي الصقيع والجفاف هما أكثر عوامل الإجهاد اللاأحيائي شيوعا في إنتاج العدس الأخضر^{الصيفي 5}. الأمراض الفطرية مثل الذبول وجذور وتعفن التاج التي تسببها أنواع Ascochyta lentis و Rhizoctonia solani و R. bataticola و Aphanomyces euteche و Pythium و Fusarium هي أهم الأمراض الفطرية التي تسبب مجموعة من الأمراض بما في ذلك التخميد ولفحة الشتلات والذبول وتعفن الجذور ، اعتمادا على توقيت الإصابة وقابلية المضيف وظروف الأرصاد^{الجوية 6،7 ، 8}.

الفيوزاريوم هو فطر خيطي غير كامل موجود في التربة والنباتات والركائز العضوية وهو جنس عالمي بين هذه مسببات^{الأمراض 9}. يسبب أمراضا مختلفة مثل ذبول الفيوزاريوم ، وتعفن الجذور ، وطوق الجذور ، وكذلك لفحة رأس الفيوزاريوم في القمح ، وذبول الفيوزاريوم في القرعيات ، وتعفن الجذور في معظم البقوليات ، بما في ذلك العدس^10،11،12. ذبول الأوعية الدموية وتعفن الجذور وطوق الجذور الناجم عن الفيوزاريوم spp. هو أهم أمراض العدس في العديد من مناطق زراعة العدس على مستوى^{العالم 10}. Fusarium oxysporum هو أكثر أنواع الفيوزاريوم شيوعا المرتبطة بالذبول وتعفن الجذور وطوق الجذور في العدس. على الصعيد العالمي ، تحدث أمراض الذبول والجذور وتعفن التاج بسبب F. graminearum و F. sporotrichioides و F. equity و F. acuminatum و F. redolent و F. avenaceum و F. culmorum و F. solani و F. verticillioides في مناطق زراعة العدس⁷. أمراض الذبول وتعفن الجذور والتاج التي تسببها الفيوزاريوم تحدث في كل من مراحل الشتلات والبالغين وتسبب الذبول المفاجئ والجفاف وموت الأوراق في نهاية المطاف. تشمل أعراض المرض تعفن البذور ، وتعفن الجذور ، وذبول المنشورات العلوية ، والتقزم ، والانكماش ، وتجعد الأوراق. في مراحل ملء القرون الوسطى والمتأخرة ، عادة ما تتقلص البذور ، وتشمل أعراض الجذر توقف النمو ، وتغير اللون البني ، وتالف أطراف الجذر الرئيسي ، وتكاثر الجذور الثانوية. قد لا يظهر تغير لون أنسجة الأوعية الدموية في جميع الحالات¹³.

في منطقة الأناضول الوسطى ، أجريت دراسات حول حالة أمراض الذبول وتعفن الجذور في العدس بأعداد محدودة. تتمتع Yozgat بمناخ معتدل ومعتدل مع هطول أمطار غزيرة في الشتاء عند مقارنتها بالصيف وتصنف على أنها Dsb (مناخ أرضي دافئ ورطب) بواسطة Köppen و Geiger¹⁴. يبلغ متوسط درجة الحرارة 9.6 درجة مئوية ويبلغ متوسط هطول الأمطار 512 ملم. يقع Yozgat في نصف الكرة الشمالي. يحدث الصيف في يونيو ويوليو وأغسطس وسبتمبر. من المهم جدا الحصول على معلومات حول علم الأوبئة الإقليمية ومسببات العوامل الفطرية المسببة للأمراض النباتية التي تسبب المرض لتطوير استراتيجيات تحكم مختلفة ضد الفيوزاريوم التي تنقلها التربة ، للسيطرة على المرض¹⁵. في هذا السياق ، تتمثل أهداف الدراسة الحالية في تحديد وتحديد - معايير المرض (انتشار المرض ، والإصابة ، وشدته) لأمراض الذبول والجذور وتعفن التاج في العدس من خلال إجراء مسح في مقاطعة يوزغات ، حيث يتم إجراء ما يقرب من 40٪ من إجمالي إنتاج العدس الأخضر منفردة ، الفيوزاريوم الممرض الأنواع التي تسبب الذبول وتعفن الجذور في العدس عن طريق التحليلات المورفولوجية والجزيئية ، ولتحديد مستويات الفوعة الفردية لأنواع الفيوزاريوم من خلال إجراء اختبارات الإمراضية.

Protocol

ملاحظة: تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. المسح الميداني وأخذ العينات والعزل الفطري

ملاحظة: تم تنفيذ أعمال المسح في عامي 2022 و 2023 ، وفقا ل Endes¹⁶. لوحظ ما مجموعه 83 منطقة لزراعة العدس تغطي تسع مناطق في مقاطعة يوزغات لمرض الذبول والجذور وتعفن طوق الجذور (الشكل 1).

1. حدد حقول العدس التي تزيد مساحتها عن 1000 م² كمنطقة أخذ العينات. اجمع كل عينة عن طريق المشي بشكل عشوائي من الحدود إلى وسط أو منتصف الحقل بواسطة التعرجات التي تمشي على طول الأقطار باستخدام إطار 1 م² ، ووضعها بشكل عشوائي عند ثلاث نقاط مختلفة على الأقل تم اختيارها عشوائيا. جمع نباتات العدس التي تظهر عليها أعراض المرض من كل نقطة ، ووضعها في أكياس ورقية ، ونقلها إلى المختبر لاستخدامها في دراسات عزل الفطريات وتحديد الهوية.
   ملاحظة: تم غسل جذور وأطواق جذور نباتات العدس المريضة المنقولة إلى المختبر أولا بماء الصنبور للتخلص من المخلفات الخشنة. في وقت لاحق ، تعرضوا للتطهير السطحي لعزل مسببات الأمراض الفطرية كما هو موضح في Endes¹⁶.
2. انقع الأنسجة النباتية المريضة في 70٪ من الإيثانول لمدة 10-15 ثانية ، ثم اشطفها 3 مرات لمدة 3 دقائق في ماء معقم. احتفظ بها جميعا في هيبوكلوريت الصوديوم 1٪ (NaOCl) لمدة 5 دقائق ، واشطفها 3 مرات لمدة 5 دقائق مرة أخرى بالماء المعقم.
3. جفف الأنسجة النباتية المبللة على أوراق الترشيح في خزانة معقمة لإنهاء عملية تطهير السطح. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة النباتية المطهرة إلى قطع بطول 5-10 مم وضع 4-5 قطع على وسط PDA يحتوي على 0.01٪ ستربتومايسين داخل أطباق بتري (قطر 90 مم). ضع أطباق بتري في حاضنة في الظلام عند 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 4-7 أيام ولاحظ نمو الفطريات.
   ملاحظة: تم تنقية العزلات الفطرية النامية من خلال طريقة عزل الأبواغ الفردية. لهذا الغرض ، تم تعديل الدراسة التي أجراها Choi et ^al.17 حول الحصول على مزارع بواغية مفردة من الفطريات التي تنتمي إلى الفطريات القاعدية والفطريات القاعدية والفطريات العضوية واستخدامها كما هو موضح أدناه.
4. لتنقية العزلات الفطرية ، احتفظ بالعزلات الفطرية التي تم الحصول عليها في نهاية دراسات العزل في حاضنة عند 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 12 ساعة من ضوء الفلورسنت / 12 ساعة من الظلام لمدة 15 يوما لتشجيع تكوين هياكل التكاثر المشوهة على المساعد الشخصي الرقمي.
5. قم بوزن حوالي 100 مجم من الفطريات الفطرية من الثقافات التي يبلغ عمرها 15 يوما باستخدام ملعقة ، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل ، ثم قم بطحنها جيدا باستخدام مدقات بلاستيكية معقمة للتجانس.
6. أضف 1 مل من الماء المعقم والدوامة لمدة 1 دقيقة لضمان نقل الجراثيم إلى الماء. لضبط عدد الجراثيم التي تنتقل إلى الماء ، ارسم 20 ميكرولتر من هذا الخليط باستخدام ماصة وتحقق من عدد الجراثيم تحت تكبير 10x للمجهر الضوئي.
7. عندما تكون كمية الجراثيم أكثر من الكمية المطلوبة ، قم بتخفيف خليط الماء البوغ بنسب مثل 1/10 و 1/100 و 1/1000. توفير خليط يحتوي على 4-6 جراثيم في مجال رؤية المجهر.
8. خذ 100 ميكرولتر من معلق البوغ المحضر وانقله إلى أطباق بتري بقطر 90 مم تحتوي على وسط المساعد الشخصي الرقمي المكمل بنسبة 0.1٪ ستربتومايسين. بعد ذلك ، انشر التعليق المنقول على المساعد الرقمي الشخصي باستخدام ملعقة Drigalski.
9. احتضان أطباق بتري المحضرة في الظلام عند 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة. في نهاية هذه الفترة ، قم بنقل قطع صغيرة من الخيوط المطورة من كونيديا واحدة مع حلقة تلقيح إلى طبق بتري جديد يحتوي على وسط القناة الشريانية. كل ثقافة يتم الحصول عليها من كل بوغ هي ثقافة بوغ واحدة. قم بتخزينها لاستخدامها في اختبارات الإمراض وتحديد المورفولوجية والجزيئية.
   ملاحظة: الغرض الرئيسي هو الحفاظ على العزلات الفطرية على قيد الحياة لفترة طويلة دون تغيير مورفولوجيتها وجيناتها وضراوتها. تم تنفيذ عملية التخزين باستخدام طريقتين مختلفتين^18،19. يتم شرح جميع طرق التخزين المستخدمة في هذه الدراسة بالتفصيل أدناه.
   1. الطريقة الأولى لتخزين العينات هي كما يلي. تنمو العزلات الفطرية على وسط المساعد الشخصي الرقمي عند 25 ± 1 درجة مئوية مع 12:12 ساعة مظلمة: ضوء لمدة 15 يوما للحصول على أقراص فطريات قطرها 4 مم يمكن تخزينها في ماء معقم.
   2. قطع أقراص الفطريات (قطرها 4 مم ، 10 أقراص) بحفار الفلين من الثقافات الفطرية التي نمت في ظل الظروف المذكورة أعلاه. انقل أقراص الفطريات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 1 مل من الماء المعقم. احتفظ بالعينات في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة في الثلاجة عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
   3. الطريقة الثانية لتخزين العينات هي كما يلي. أولا ، خذ قليلا من القرص الفطري النقي من مزارع الأبواغ المفردة التي تم الحصول عليها بحلقة تلقيح وانقله إلى أطباق بتري التي تحتوي على المساعد الشخصي الشخصي المكمل بالكلورامفينيكول وحمض اللاكتيك والأمبيسلين والريفامبيسين والتتراسيكلين والستربتومايسين ، إلخ.
   4. تنمو لمدة 5-10 أيام قبل عملية التخزين عند 25 ± 1 درجة مئوية مع 12 ساعة: 12 ساعة مظلمة: حالة خفيفة. قص وتعقيم أوراق الترشيح للأغراض العامة مقاس 1 سم × 1 سم في الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 60 دقيقة.
   5. ضع أوراق الترشيح في أطباق بتري جديدة بنفس الوسط أو الانتقائي. قطع المستعمرات / الجراثيم من الثقافة الفطرية النقية وضعها في الجزء العلوي من كل قطعة.
   6. أغلق أطباق بتري وضعها في حاضنة في ظروف نمو مناسبة (كما هو مذكور أعلاه). تنمو العزلات الفطرية ببطء على ورق الترشيح. احتضن لمدة 15 يوما تقريبا لضمان الاستعمار الكامل.
   7. بعد التبوغ أو تكوين المستعمرة الكاملة على أوراق الترشيح ، انقل قطع الورق الفردية إلى طبق بتري جديد بدون وسيط ثقافة. في وقت لاحق ، ضع أطباق بتري في الحاضنة حتى يجف ورق الترشيح والفطريات تماما (حوالي 20-30 يوما).
   8. بعد التجفيف ، ضع 10 قطع من ورق الترشيح في كل مغلف ورقي معقم ، وقم بتسمية كل مغلف ، وضع هذه الأظرف في أكياس بلاستيكية ، وقم بتخزين الأكياس البلاستيكية التي تحتوي على الأظرف في وعاء بلاستيكي وشفاف عند -20 درجة مئوية.
10. احسب معدل انتشار مرض ذبول العدس وجذوره وتعفن التاج في يوزغات وفقا للصيغة الواردة أدناه ، مع مراعاة انتشار المرض في كل حقل من حقل العدس ، متبوعا باسم قضاء المقاطعة.
    معدل انتشار المرض (٪) = (أ / ب) × 100
    حيث يشير a إلى عدد الحقول المريضة ؛ يشير b إلى العدد الإجمالي للحقول التي تم مسحها في منطقة معينة.
11. احسب معدل الإصابة بالمرض وفقا لطريقة المتوسط المرجح التي أبلغت عنها بورا وكاراجا²⁰. عد النباتات في كل مربع في الحقل. افصلها إلى نباتات مريضة وغير مريضة في كل مربع واحسب انتشار المرض وفقا للصيغة الواردة أدناه.
    معدل انتشار المرض (٪) = (x / y) × 100
    حيث يشير x إلى عدد النباتات المريضة ؛ يشير Y إلى العدد الإجمالي للنباتات التي تم مسحها.
12. احسب شدة المرض وفقا للمقياس 0-4 من Öğüt²¹ ، حيث لم تظهر الأعراض 0 = ، 1 = أعراض خفيفة في 25٪ من الأوراق ؛ 2 = أعراض متوسطة المستوى في 26٪ -50٪ من الأوراق ؛ 3 = داء الاخضرار الشديد والذبول في 51٪ -75٪ من الأوراق ؛ و 4 = أعراض الإصابة بالكلور والذبول الشديدة جدا أو الجفاف أو التساقط أو تأخر النمو أو الأوراق الميتة على أكثر من 75٪ من النباتات بنفس الترتيب (الشكل 2).
13. احسب شدة المرض باستخدام الصيغة التالية بقيم المقياس التي تم الحصول^{عليها 16}.
    شدة المرض (٪) = [∑ [i (ni x vi) / (V) x N)] × 100
    حيث عدد المصانع في قيمة المقياس ؛ قيمة مقياس VI V أعلى قيمة مقياس ؛ N العدد الإجمالي للنباتات التي لوحظت ؛ أنا يشير إلى عدد الفصول.

2. بيانات الأرصاد الجوية

1. إجراء دراسات مسحية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم إجراء المسوحات خلال فترتي مايو ويونيو 2022 و 2023. احصل على درجة الحرارة والرطوبة النسبية وإجمالي قيم هطول الأمطار للفترة من مارس إلى يوليو في 2022 و 2023 والسنوات الطويلة من مديرية الأرصاد الجوية الإقليمية في يوزغات (الجدول 1).

3. التحديد المورفولوجي

1. قارن الخصائص الثقافية (لون المستعمرة ، والفطريات الهوائية ، ومعدل نمو الفطريات) والكونيدالية (الأبعاد الكونيدية ، والشكل ، واللون ، وعدد الحاجز) لعزلات الفيوزاريوم بتلك الخاصة بالدراسات السابقة وحدد الأنواع الفطرية مبدئيا.
2. حدد عينات تمثيلية من المجموعات لاستخدامها في تحديد المورفولوجيا. قم بتنقية هذه العينات وفقا لطريقة عزل الأبواغ الفردية كما هو مذكور أعلاه. خلال هذه الفترة ، لاحظ خصائص تصبغ المستعمرة لعزلات الفيوزاريوم بالإضافة إلى هياكل الكلاميدوبور الدقيقة / الماكروكونيديا.
3. لتعزيز تكوين الهياكل المجهرية مثل الميكروكونيديا الدقيقة / الكبيرة والأبواغ الكلاميدوسبورية في المزارع الفطرية النقية التي تم الحصول عليها ، احتضن على المساعد الشخصي الرقمي في 25 ± 1 درجة مئوية و 12 ساعة: 12 ساعة مظلمة: ضوء لمدة 25-30 يوما في حاضنة. قم بقياس طول وعرض الكونيديا لكل عزل فيوزاريوم بواسطة الفحص المجهري الضوئي. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتوثيق الهيكل والشكل واللون والحاجز أو بدون حاجز للكونيديا باستخدام مجهر ضوئي مزود بكاميرا رقمية.
4. بناء على الملاحظات المذكورة أعلاه ، قم بتجميع عزلات Fusarium وفقا لمستوى الأنواع ، كما هو موضح في Leslie and Suerell²².

4. التحديد الجزيئي

ملاحظة: تم استخراج الحمض النووي الجيني الكلي لعزلات الفيوزاريوم باستخدام الطريقة التالية ، والتي تم تعديلها بشكل طفيف من بروتوكول Cenis²³. تم إجراء تحليلات تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي لعزلات الفيوزاريوم باستخدام البروتوكول الموصوف بواسطة Aras و Endes²⁴.

1. استخراج الحمض النووي الجيني الفطري
   1. من مزرعة جديدة (عمرها 10 أيام) من عزلات الفيوزاريوم المزروعة على المساعد الشخصي الرقمي ، اكشط 100 مجم من الفطريات بمشرط معقم ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل. احتضان الأنابيب عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
   2. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي (200 ملي مولار Tris-HCl pH: 8.5 ، 250 ملي كلوريد الصوديوم ، 25 ملي مولار EDTA ، 0.5٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم) في الأنابيب وسحقها بمدقة بلاستيكية معقمة.
   3. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3M (NaOAc) درجة الحموضة 5.2 إلى الأنابيب واحتضانها عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد هذه المرحلة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق.
   4. بعد الطرد المركزي ، انقل 400 ميكرولتر من المادة الطافية الموجودة في الجزء العلوي من الأنبوب إلى أنابيب جديدة (1.5 مل) وأضف حجما متساويا من الأيزوبروبانول (2-بروبانول). احتضان الأنابيب الجديدة عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، امزج الأنابيب برفق 5x أو 6x.
   5. جهاز طرد مركزي عند 4,000 × جم لمدة 10 دقائق لترسيب الحمض النووي الجيني والتخلص من كل السائل المتبقي في الأنابيب.
   6. أضف 1 مل من 70٪ إيثانول إلى حبيبات الحمض النووي الجينومية كرواسب بيضاء أو كريمية اللون في قاع الأنبوب. امزج الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل 4x-5x لمدة دقيقة واحدة تقريبا ، وتخلص من كل الإيثانول الموجود في الأنابيب. بعد ذلك ، افتح الأنابيب في تدفق الهواء الرقائقي لمدة 30 دقيقة لتبخر الإيثانول تماما على حبيبات الحمض النووي.
   7. لإذابة الحمض النووي الجيني وتخزينه لفترة طويلة ، أضف 50 ميكرولتر من محلول عازل TE (1M Tris-HCl pH: 8.0 ؛ 0.5M EDTA pH 8.0) إلى الأنابيب واحتضان الأنابيب في حمام مائي عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. خلال هذا الوقت ، امزج الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل 8x-10x. قم بتخزين الحمض النووي الجيني المذاب في محلول عازلة TE في فريزر عميق -20 درجة مئوية لاستخدامه في الدراسات الجزيئية.
2. لدراسات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم بادئات قليل النوكليوتيدات ITS5 F (5 GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3 ') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') لتضخيم منطقة ITS من rDNA²⁵. قم بإجراء كل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام 2.5 ميكرولتر من 10x PCR المؤقت ، و 2.5 ميكرولتر من MgCl₂ (25 ملي مولار) ، و 2.5 ميكرولتر من dNTP (2 ملي مولار) ، و 0.5 ميكرولتر من كل مادة أولية (10 ميكرومتر) ، و 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي Taq (1 U / μL ، Fermantas) و 14 ميكرولتر من sQH2O في حجم إجمالي قدره 25 ميكرولتر.
3. بالنسبة لتفاعل PCR 25 ميكرولتر ، قم بتشغيل برنامج PCR التالي 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين (التمسخ الأولي) ، متبوعا ب 40 دورة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (تمسخ) ، 55 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (التلدين) ، 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية (تمديد) و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (التمديد النهائي). منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكهربائي لمدة 1.5 ساعة عند 90 فولت في هلام الاغاروز 1.5٪ المحضر في محلول عازل 1x TAE (قاعدة تريس - حمض الخليك الجليدي - EDTA).
   1. لتحضير عازلة TAE للرحلان الكهربائي للهلام ، قم بإذابة 242 جم من قاعدة تريس في 700 مل من الماء المعقم ؛ أضف 57.1 مل من حمض الخليك الجليدي ؛ أضف 100 مل من محلول EDTA 0.5 M ، واضبط مستوى الصوت على 1 لتر عن طريق إضافة ماء معقم. اضبط الرقم الهيدروجيني النهائي للمخزن المؤقت 1 لتر 50x TAE إلى 8.5. لعمل 1x TAE يعمل ، أضف 49 جزءا من الماء المعقم إلى جزء واحد من المخزن المؤقت TAE 50x.
4. قم بتلطيخ المواد الهلامية ب 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم وفحصها بصريا عن طريق جعلها مرئية على مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
5. من أجل فحص العلاقة التطورية بين عزلات عامل تعفن الجذر والتاج ، احصل على تسلسلات قاعدة الجينات ITS بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتي تم تصنيعها ثنائي الاتجاه (5'-3' و 3'- 5') من خلال بائع. قارن التسلسلات الأساسية مع بيانات الجينات من موقع NCBI (المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية) والتسلسلات الأساسية لجين ITS لعزلات الفيوزاريوم الأخرى في العالم باستخدام برنامج الانفجار. استخدم هذا لتحديد العزلات على مستوى الأنواع كما هو موضح أدناه.
   1. انتقل إلى https://www.ncbi.nlm.nih.gov الموقع. انقر فوق علامة التبويب BLAST في قسم الموارد الشائعة.
   2. انقر فوق علامة التبويب Nucleotide BLAST في النافذة الجديدة. في المقطع إدخال تسلسل الاستعلام في النافذة الجديدة ، أدخل التسلسلات الأساسية بتنسيق Fasta ، واكتب اسم الدراسة في قسم المسمى الوظيفي.
   3. بعد ذلك ، تحقق من قواعد البيانات القياسية (nr وما إلى ذلك) في علامة التبويب قاعدة البيانات في قسم اختيار مجموعة البحث في الأسفل.
   4. تحقق من التسلسلات المتشابهة للغاية (megablast) في علامة التبويب Optimize for في قسم Program Selection وانقر على علامة التبويب BLAST في أسفل الصفحة.
6. استخدم برنامج تحليل النشوء والتطور MEGA 11 لتحديد العلاقة التطورية بين عزلات الفيوزاريوم . قم بمحاذاة التسلسلات الأساسية باستخدام برنامج ClustalW وقم بإنشاء أشجار العائلة الجينية للعزلات وفقا للحد الأقصى من البخل لجين ITS²⁶.
   1. لتنزيل برنامج Mega ، انتقل إلى موقع الويب https://www.megasoftware.net ، وقم بتثبيت برنامج Mega. يتم توفير برنامج MEGA مجانا للاستخدام في البحث والتعليم.
   2. أولا ، احفظ التسلسلات على سطح المكتب كملف Notepad (.txt) بتنسيق FASTA. قم بتشغيل برنامج Mega وانقر فوق علامة التبويب ALIGN . انقر فوق تحرير / بناء المحاذاة في النافذة. بعد ذلك ، حدد إنشاء محاذاة جديدة في النافذة الجديدة وانقر فوق موافق للتأكيد.
   3. انقر فوق علامة تبويب DNA . تحذف السمة 1. التسلسل الذي يظهر تلقائيا في النافذة ، وانتقل إلى تحرير الملف ، ثم انقر فوق علامة التبويب إدراج تسلسل من ملف . افتح ملف المفكرة (.txt) الذي يحتوي على التسلسلات والموجود على سطح المكتب.
   4. في هذه المرحلة ، تظهر جميع التسلسلات على الشاشة. أولا ، انقر فوق أي تسلسل يظهر على الشاشة ، ثم ضع علامة على جميع التسلسلات باستخدام CTRL + A. افتح ملف المحاذاة وانقر فوق محاذاة بواسطة Clustal W من هناك ، وانقر فوق موافق لتشغيل البرنامج في الإعدادات الافتراضية.
   5. بعد فحص الاختلافات في محاذاة التسلسلات ، انتقل إلى ملف البيانات ، وانقر فوق تحليل النشوء والتطور ثم انقر فوق لا في مربع الاختيار في النافذة لمعرفة ما إذا كانت التسلسلات تصنع البروتينات أم لا. لا تقوم تسلسلاتنا بتصنيع البروتينات لأنها تنتمي إلى منطقة أنظمة النقل الذكية.
   6. ارجع إلى النافذة الرئيسية لبرنامج Mega. انقر فوق Phylogeny وحدد Construct / Test Maximum Parsimony Tree(s). في النافذة الجديدة ، حدد طريقة التمهيد لاختبار Phylogeny وأدخل قيم التمهيد 1,000 لاختبار قوة الفرع. في علامة التبويب الفجوات/معالجة البيانات المفقودة، حدد الحذف الجزئي، وحدد الشجرة الفرعية-التقليم-إعادة التطعيم (SPR) كطريقة بحث MP، وانقر فوق موافق لتأكيد العمليات.
   7. انتظر نتيجة التحليل لإظهار شجرة النشوء والتطور.

5. اختبار الإمراضية

1. استخدم أربع عزلات لدراسات الإمراضية لكل نوع تمثيلي من أنواع الفيوزاريوم التي تم تحديدها بالطرق الجزيئية. إجراء دراسات الإمراضية عند 24 درجة مئوية ، 16 ساعة من ضوء الفلورسنت / 8 ساعات من الفترة الضوئية المظلمة ، مع رطوبة 65٪ في غرفة مكيفة.
2. زرع بذور العدس في قوارير بلاستيكية سوداء بقطر 45 حفرة بقطر 5 سم. احتفظ بكل قارورة في هيبوكلوريت الصوديوم 1٪ لمدة 3 دقائق ثم اشطفها بالماء المقطر المعقم 3 مرات. جفف البذور في خزانة معقمة لمدة 24 ساعة وزرع بذرة واحدة في كل حفرة.
   ملاحظة: تم استخدام بذور العدس من صنف Kayı 91 ، الحساسة للمرض ، في جميع اختبارات الإمراض⁶. تم استخدام تقنية غمر الشتلات كطريقة التلقيح²⁷.
3. احتضان المزارع النقية لكل عزلة في القناة الشريانية السالكة عند 24 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام. اكشط المستعمرات المزروعة من مزرعة المخزون من سطح الوسط بملعقة وقم بإعداد معلق البوغ / الفطريات باستخدام الماء المقطر المعقم.
4. قم بإزالة البقايا الكبيرة من المعلق عن طريق الترشيح من خلال قطعة قماش قطنية مكونة من 4 طبقات واضبط تركيز البوغ / الفطريات إلى 1 × 10⁶ جراثيم / مل بمساعدة مقياس كثافة الدم.
5. بعد هذه المرحلة ، اقتلع جذور الشتلات التي نمت سابقا في القوارير عندما يكون لديها 2-3 أوراق حقيقية. يغسل بماء الصنبور ويصيب الجذور قليلا بإبرة معقمة. اغمر هذه الشتلات في معلق البوغ / الفطريات المحضر لمدة 3 دقائق ثم قم بزرعها في قوارير بلاستيكية تحتوي على خليط تربة معقمة / خث (2: 1 ؛ v / v).
6. بالنسبة للشتلات المستخدمة كعناصر تحكم ، اقتلع جذورها ، وقم بإصابتها ، ثم زرعها عن طريق غمرها فقط في ماء معقم. قم بإجراء تقييمات اختبار الإمراضية بعد 3 أسابيع من عملية التلقيح وفقا لمقياس 0-4.
7. بعد إخضاع قيم شدة المرض المحسوبة لتحويل الزاوية ، يتم إخضاع القيم التي تم الحصول عليها لتحليل التباين وتقييم الفروق بين الوسائل وفقا لاختبار Tukey's HSD (p = 0.05). شدة المرض: تم تقييم العزلات التي تحتوي على 0٪ -15٪ على أنها ذات ضراوة منخفضة جدا (LV) ، وتم تقييم العزلات التي تحتوي على 16٪ -35٪ على أنها منخفضة الفوعة (LV) ، وتم تقييم العزلات بنسبة 36٪ -50٪ على أنها ضراوة معتدلة (O) ، وتم تقييم العزلات بنسبة 51٪ -70٪ على أنها عالية الفوعة (VV) ، وتم تقييم العزلات بنسبة 71٪ -100٪ على أنها ضراوة عالية جدا (VV) وتم تقييم العزلات التي لا تحتوي على أعراض المرض على أنها عزلات رمية أو نباتية.

النتائج

تحديد معلمات المرض
تم تقييم ما مجموعه 83 منطقة بذر العدس تغطي تسع مناطق مختلفة من يوزغات من حيث الذبول والجذر وأعراض مرض تعفن التاج ، والتي تمتد على مساحة 1.1984 × 10⁶ م² (الجدول 2). تمت مواجهتها أعراض مرض الذبول أو تعفن الجذور في...

Discussion

من المعروف أن ذبول الفيوزاريوم يسبب خسائر اقتصادية خطيرة في بعض أجزاء العالم³¹. تم الإبلاغ عن المرض لأول مرة في المجر³² وتم الإبلاغ عنه لاحقا في العديد من البلدان مثل مصر والهند وميانمار ونيبال وباكستان وتركيا وسوريا والولايات المتحدة

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-lactic acid	Merck	100366	Was used as an antibiotic in studies.
2-propanol	Merck	109634	Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)	Eppendorf Research	LB.EP.3123000012	Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)	Eppendorf Research	LB.EP.4924000916	Used to measure small volumes of liquids.
Agar	Merck	110453	For use in making fungal media.
Agarose	Sigma-Aldrich	18300012	For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room	?klimlab		Was used to grow plants under controlled conditions.
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9393	Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balance	Shimadzu ATX224		Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizer	Zealway	GF-120DR	It was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscope	Leica DM750		For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinet	HFsafe Class II A2		To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
Centrifugal	DLAB DM1424	LB.DL.903001124	Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	220551	Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer set	Sigma-Aldrich	Z165220	It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slide	ISOLAB	075.01.006 / 075.02.005	Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrate	Merck	108342	For use in making fungal media.
DFC450 with digital camera	Leica		Digital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope	Leica	MIC5246	Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresis	thermo fisher scientific	B2-UVT
Dna gel loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611	For use in molecular diagnostics.
dNTP mix	Thermo Scientific	R0192	Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)	Thermo Scientific	K1082	For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatule	ISOLAB	082.03.001	It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta	Thermo Scientific	17892	For use in molecular diagnostics.
Ethanol	Merck	100983	Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758	Used in molecular studies.
Filter paper	ISOLAB	107.58.158	Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinet	ZHICHENG ZXDS-A-1090		For use in incubation processes.
Fume hood	Elektromag EM1201	LB.EM.EM1201	It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging system	Syngene G:BOX Chemi XX6		For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladder	Thermo Scientific	SM0372	For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acid	Merck	1005706	Used in molecular studies.
Glycerol	Merck	104094	For use in stock culture of fungi.
Lancet	ISOLAB	048.50.002	Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	814733	Used in molecular studies.
Measuring tape	ISOLAB	016.07.500	Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubes	ISOLAB	0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003	Used to store different volumes of liquids.
PCR tube	ISOLAB	123.01.002	It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishes	ISOLAB	120.13.090	For use in growing fungus culture.
Pipette tips	ISOLAB	005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004	To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bag	ISOLAB	039.30.005	Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic pot	ToXA		Was used for growing plants.
Pliers, clamps	ISOLAB	048.08.130	It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortar	ISOLAB	038.02.150	Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agar	Condalab	1022	For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water system	human CORPORATION	LT.HC.NHP009	Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)	Vestel		For use in the storage of stock materials.
Rifampicin	Sigma-Aldrich	557303	Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetate	Merck	106268	Used in molecular studies.
Sodium chloride	Merck	1064041000	Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143	Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solution	Merck	105614	Used for surface disinfection.
Spatula	ISOLAB	047.33.210	It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomyc?n sulfate	BioShop Canada	STP101	To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pure	Tekkim	TK.200650	For use as a disinfectant in all stages of work.
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T3258	Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCR	Bio?Rad T100		For use in genomic analyses.
Thoma lam	ISOLAB	075.03.002	For use in spore counting.
Tris HCL	Roche	10812846001	Used in molecular studies.
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Used in molecular studies.
Tween 80	Merck	822187	For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteks	Velp WIZARD	LB.VLP.F202A0175	Used to mix substances in liquid volumes.
Water baths	Memmert WNB 22	1018-5702	It was used during incubation in dna extraction studies.