Screening von Linsenfeldern auf das Vorhandensein von Fusarium-Welke und Wurzelfäule in Türkiye unter terrestrischem Klima

Zusammenfassung

Eine Studie in der Provinz Yozgat ergab, dass biotische Faktoren wie Pilzkrankheiten wie Welke und Wurzelfäule die Linsenproduktion einschränken. In 95,4 % der Proben wurden Fusarium-Isolate gefunden, was auf regelmäßige lokale Erhebungen und ein regelmäßiges Monitoring für eine nachhaltige Technologieentwicklung und wirksame Kontrollstrategien hindeutet.

Zusammenfassung

Die Linse ist eine wichtige selbstbestäubte Hülsenfrucht. Seine Produktion wird durch verschiedene biotische Faktoren eingeschränkt, insbesondere durch Pilze, die den Welke- und Wurzelfäule-Komplex verursachen. Ziel der Studie war es, die regionale Epidemiologie und Ätiologie phytopathogener Pilzerreger zu verstehen, um Bekämpfungsstrategien gegen bodenbürtige Fusarium spp. zu entwickeln. In dieser Studie wurden in den Jahren 2022 und 2023 83 Linsenaussaatorte in der Provinz Yozgat auf Welke-, Wurzel- und Kronenfäulekrankheiten untersucht, die durch häufige Fusarium-Arten verursacht wurden. Symptomatische Linsenpflanzen wurden zur Isolierung und Identifizierung von Pilzen gesammelt. Die Fusarium-Isolate wurden nach der Morphologie der Kolonie gruppiert und auf PDA-Medium kultiviert. Darüber hinaus wurden genomische DNAs, die aus Fusarium-Isolaten gewonnen wurden, mittels PCR analysiert und mit anderen Fusarium-Isolaten verglichen, die in der NCBI GenBank registriert sind. Die genetischen Verwandtschaftsverhältnisse zwischen den Fusarien-Isolaten wurden mit der Methode der Maximum Parsimony (MP) im Programm Mega 11 bestimmt. Die Ergebnisse, die mittlere Inzidenz und der Schweregrad der Erkrankung von Welke- und Wurzelfäulekrankheiten in der Provinz Yozgat wurden mit 16,9 % bzw. 38,6 % bestimmt. In 95,4 % der Proben wurden Fusarienisolate gefunden. Es gab eine Homogenität der Nukleotidsequenz von 99,5 % bis 100 % zwischen den Isolaten F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum und F. solani , und die am stärksten isolierte Spezies war F. oxysporum. Das MP-Dendrogramm von Fusarium-Isolaten wurde in zwei Hauptzweige unterteilt, wobei der erste Zweig alle F. solani-Isolate umfasste. Der zweite Hauptzweig umfasste andere Fusarium-Arten , die in der vorliegenden Studie und in der NCBI GenBank isoliert wurden. Die Studie schlägt regelmäßige lokale Erhebungen vor, um die Häufigkeit der Fusarium-Welke zur Unterdrückung bei Linsen zu bestimmen. Eine rechtzeitige Unterdrückung von Fusarium-basierten Schäden wird dringend empfohlen, um die Krankheit zu kontrollieren und das Linsenproduktionssystem zu erhalten.

Einleitung

Die Linse (Lens culinaris Medik.), eine kleine essbare Hülsenfrucht aus der Familie der Fabaceae, ist eine selbstbestäubende Pflanze aus der kühlen Jahreszeit mit nadelartigen Blättern und weißen bis blassvioletten oder dunkelvioletten Blüten¹. Sie wurde vor etwa 10.000 Jahren im mesopotamischen Teil des Fruchtbaren Halbmondes vom Menschen domestiziert und verbreitete sich schnell in die Neue Welt, einschließlich des Mittelmeerraums und Zentralasiens, und später wurde sie auf dem amerikanischen Kontinent eingebürgert². Die weltweite Linsenanbaufläche beträgt etwa 5,5 Millionen Hektar mit einer Produktion von 6,6 Millionen Tonnen³. Türkiye belegt nach Kanada, Indien und Australien den^{4. Platz} bei der Linsenproduktion. Der Linsenanbau in Türkiye ist sehr wichtig und macht 6,7 % der Weltproduktion aus. Die gesamte Linsenproduktion der Türkei beträgt 474.000 Tonnen und wird in mindestens 40 Provinzen produziert⁴. Etwa 89,5 % der Linsenproduktion in der Türkei bestehen aus roten und grünen Linsen, die 10,5 % der Winterernte in der Region Südostanatolien ausmachen. Der Rest der Ernte wird als Sommergetreide angebaut. Die Provinzen Yozgat (39,5 %), Konya (23,7 %), Kırşehir (16,3 %), Çorum (7,6 %) und Ankara (2,9 %) tragen weitgehend zur Produktion grüner Linsen^{bei 4}. Die Linsenproduktion kann durch biotische und abiotische Stressfaktoren eingeschränkt werden. Frost und Trockenheit sind die häufigsten abiotischen Stressfaktoren bei der sommerlichen Produktion von grünen Linsen⁵. Pilzkrankheiten wie Welke-, Wurzel- und Kronenfäule-Komplexe, die durch Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium und Fusarium-Arten verursacht werden, sind die wichtigsten Pilzkrankheiten, die je nach Zeitpunkt der Infektion, Anfälligkeit des Wirts und meteorologischen Bedingungen eine Kombination von Krankheiten wie Dämpfung, Sämlingsfäule, Welke und Wurzelfäule verursachen ^{6,7, 8}. Anmelden

Fusarium ist ein filamentöser, unvollkommener Pilz, der in Böden, Pflanzen und organischen Substraten vorkommt und eine kosmopolitische Gattung unter diesen Krankheitserregern ist⁹. Es verursacht verschiedene Krankheiten wie Fusarium-Welke, Wurzel- und Wurzelhalsfäule sowie Fusarium-Kopffäule bei Weizen, Fusarium-Welke bei Kürbisgewächsen und Wurzelfäule bei den meisten Hülsenfrüchten, einschließlich Linsen 10,11,12. Die durch Fusarium spp. verursachte Gefäßwelke, Wurzel- und Wurzelhalsfäule ist in vielen Linsenanbaugebieten weltweit die wichtigste Erkrankung von Linsen¹⁰. Fusarium oxysporum ist die häufigste Fusarium-Art, die bei Linsen mit Welke-, Wurzel- und Wurzelhalsfäule in Verbindung gebracht wird. Weltweit werden Welke-, Wurzel- und Kronenfäulekrankheiten durch F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani und F. verticillioides in Linsenanbauflächen verursacht⁷. Welke-, Wurzel- und Kronenfäulekrankheiten, die durch Fusarium spp. verursacht werden, treten sowohl im Sämlingsstadium als auch im Erwachsenenstadium auf und führen zu plötzlichem Welken, Austrocknen und schließlich zum Absterben der Blätter. Zu den Symptomen der Krankheit gehören Samenfäule, Wurzelfäule, welke obere Blättchen, Wachstumsverzögerung, Schrumpfung und Kräuseln der Blätter. In der mittleren und späten Phase der Schotenfüllung sind die Samen in der Regel geschrumpft, und zu den Wurzelsymptomen gehören verkümmertes Wachstum, braune Verfärbung, beschädigte Pfahlwurzelspitzen und die Vermehrung von Sekundärwurzeln. Eine Verfärbung des Gefäßgewebes ist nicht in allen Fällen zu sehen¹³.

In der Region Zentralanatolien wurden in begrenzter Zahl Studien zum Stand von Welke- und Wurzelfäulekrankheiten bei Linsen durchgeführt. Yozgat hat ein mildes und gemäßigtes Klima mit reichlichen Niederschlägen im Winter im Vergleich zum Sommer und wird von Köppen und Geiger¹⁴ als Dsb (Warmes, feuchtes Landklima) klassifiziert. Die Durchschnittstemperatur liegt bei 9.6 °C und die durchschnittliche Niederschlagsmenge beträgt 512 mm. Yozgat liegt auf der Nordhalbkugel. Der Sommer findet im Juni, Juli, August und September statt. Es ist sehr wichtig, Informationen über die regionale Epidemiologie und Ätiologie der phytopathogenen Pilzerreger, die die Krankheit verursachen, zu haben, um verschiedene Bekämpfungsstrategien gegen bodenbürtige Fusarium spp. zu entwickeln, um die Krankheit^{zu kontrollieren 15}. In diesem Zusammenhang besteht das Ziel der vorliegenden Studie darin, die Krankheitsparameter (Krankheitsprävalenz, Inzidenz und Schweregrad) von Welke-, Wurzel- und Kronenfäulekrankheiten bei Linsen zu bestimmen und zu identifizieren, indem eine Umfrage in der Provinz Yozgat durchgeführt wird, wo etwa 40% der gesamten Produktion von grünen Linsen allein, dem pathogenen Fusarium , durchgeführt wird Arten, die Welke und Wurzelfäule bei Linsen verursachen, durch morphologische und molekulare Analysen und zur Bestimmung der individuellen Virulenzwerte der Fusarium-Arten durch Durchführung von Pathogenitätstests.

Protokoll

HINWEIS: Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Felduntersuchung, Probenahme und Pilzisolierung

HINWEIS: Die Befragung wurde laut Endes¹⁶ in den Jahren 2022 und 2023 durchgeführt. Insgesamt wurden 83 Linsenanbauflächen in neun Distrikten der Provinz Yozgat auf Welke-, Wurzel- und Wurzelkragenfäule untersucht (Abbildung 1).

1. Wählen Sie Linsenfelder mit einer Fläche von mehr als 1000^m2 als Probenahmefläche aus. Sammeln Sie jede Probe, indem Sie zufällig von der Grenze zur Mitte oder Mitte des Feldes gehen, indem Sie im Zickzack entlang der Diagonalen mit einem 1 m² großen Rahmen gehen und sie zufällig an mindestens drei zufällig ausgewählten verschiedenen Punkten platzieren. Sammeln Sie Linsenpflanzen, die Krankheitssymptome zeigen, stecken Sie sie in Papiertüten und bringen Sie sie ins Labor, um sie für Pilzisolierungs- und Identifizierungsstudien zu verwenden.
   HINWEIS: Die Wurzeln und Wurzelkragen von kranken Linsenpflanzen, die ins Labor gebracht wurden, wurden zunächst mit Leitungswasser gewaschen, um grobe Rückstände zu entfernen; später wurden sie einer Flächendesinfektion zur Isolierung der pilzlichen Erreger unterzogen, wie sie in Endes¹⁶ beschrieben wird.
2. Weichen Sie erkranktes Pflanzengewebe 10-15 s lang in 70%igem Ethanol ein und spülen Sie es dann 3x für jeweils 3 min in sterilem Wasser ab. Halten Sie alle 5 min in 1% Natriumhypochlorit (NaOCl) und spülen Sie sie 3x für jeweils 5 min noch einmal mit sterilem Wasser aus.
3. Trocknen Sie das nasse Pflanzengewebe auf Filterpapier in einem sterilen Schrank, um den Oberflächendesinfektionsprozess abzuschließen. Schneiden Sie anschließend das desinfizierte Pflanzengewebe in 5-10 mm lange Stücke und legen Sie 4-5 Stücke auf ein PDA-Medium mit 0,01 % Streptomycin in Petrischalen (90 mm Durchmesser). Stellen Sie die Petrischalen für 4-7 Tage bei 25 ± 1 °C in einen Inkubator und beobachten Sie das Pilzwachstum.
   HINWEIS: Die sich entwickelnden Pilzisolate wurden durch die Einzelsporenisolationsmethode gereinigt. Zu diesem Zweck wurde die von Choi et ^al.17 durchgeführte Studie zur Gewinnung von Einzelsporenkulturen von Pilzen, die zu Ascomyceten, Basidiomyceten, Coelomyceten und Hyphomyceten gehören, modifiziert und wie unten beschrieben verwendet.
4. Zur Reinigung von Pilzisolaten sind die am Ende der Isolationsstudien gewonnenen Pilzisolate in einem Inkubator bei 25 ± 1 °C für 12 h Fluoreszenzlicht / 12 h Dunkelheit für 15 Tage aufzubewahren, um die Bildung anamorphotischer Reproduktionsstrukturen auf PDA zu fördern.
5. Wiegen Sie etwa 100 mg Pilzmyzel aus 15 Tage alten Kulturen mit einem Spatel, geben Sie es in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und mahlen Sie es dann gründlich mit sterilen Kunststoffstößeln zur Homogenisierung.
6. Fügen Sie 1 ml steriles Wasser hinzu und wirbeln Sie es 1 Minute lang ein, um die Übertragung der Sporen in das Wasser sicherzustellen. Um die Anzahl der Sporen, die in das Wasser übergehen, einzustellen, ziehen Sie 20 μl dieser Mischung mit einer Pipette und überprüfen Sie die Anzahl der Sporen unter 10-facher Vergrößerung des Lichtmikroskops.
7. Wenn die Menge der Sporen größer als die gewünschte Menge ist, verdünnen Sie das Sporen-Wasser-Gemisch in einem Verhältnis wie 1/10, 1/100 und 1/1000. Stellen Sie eine Mischung mit 4-6 Sporen im Sichtfeld des Mikroskops bereit.
8. Nehmen Sie 100 μl der vorbereiteten Sporensuspension und geben Sie sie in Petrischalen mit einem Durchmesser von 90 mm, die PDA-Medium enthalten, das mit 0,1 % Streptomycin versetzt ist. Verteilen Sie dann die übertragene Suspension mit einem Drigalski-Spatel auf dem PDA.
9. Die vorbereiteten Petrischalen im Dunkeln bei 25 ± 1 °C für 12-24 h inkubieren. Am Ende dieser Periode werden kleine Stücke von Hyphen, die sich aus einer einzelnen Konidie mit einer Impfschlaufe entwickelt haben, in eine neue Petrischale mit PDA-Medium übertragen. Jede Kultur, die aus jeder Spore gewonnen wird, ist eine einzelne Sporenkultur. Bewahren Sie diese auf, um sie für Pathogenitätstests und die morphologische und molekulare Identifizierung zu verwenden.
   HINWEIS: Der Hauptzweck besteht darin, Pilzisolate lange am Leben zu erhalten, ohne ihre Morphologie, Genetik und Virulenz zu verändern. Der Lagerungsprozess wurde mit zwei verschiedenen Methoden durchgeführt ^18,19. Alle in dieser Studie verwendeten Speichermethoden werden im Folgenden ausführlich erläutert.
   1. Die erste Methode zum Speichern von Proben ist wie folgt. Pilzisolate auf PDA-Medium bei 25 ± 1 °C und 12:12 h Dunkel: Licht für 15 Tage züchten, um Myzelscheiben mit einem Durchmesser von 4 mm zu erhalten, die in sterilem Wasser gelagert werden können.
   2. Schneiden Sie Myzelscheiben (4 mm Durchmesser, 10 Scheiben) mit einem Korkbohrer aus Pilzkulturen, die unter den oben genannten Bedingungen gewachsen sind. Übertragen Sie die Myzelscheiben in Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem Wasser. Bewahren Sie die Proben in Mikrozentrifugenröhrchen 6 Monate bei -20 °C im Kühlschrank auf.
   3. Die zweite Methode zum Speichern von Proben ist wie folgt. Zuerst wird eine Prise der reinen Pilzscheibe aus den Einzelsporenkulturen entnommen, die mit einer Impfschlaufe gewonnen wurden, und in Petrischalen überführt, die PDA enthalten, die mit Chloramphenicol, Milchsäure, Ampicillin, Rifampicin, Tetracyclin, Streptomycin usw. ergänzt sind.
   4. Anbau für 5-10 Tage vor dem Lagerprozess bei 25 ± 1 °C mit 12 h: 12 h dunkel: hell. Schneiden und sterilisieren Sie 1 cm x 1 cm Universalfilterpapiere im Autoklaven bei 121 °C, 15 psi für 60 Minuten.
   5. Legen Sie die Filterpapiere in neue Petrischalen mit dem gleichen oder einem selektiven Medium. Schneiden Sie Kolonien/Sporen aus reiner Pilzkultur ab und legen Sie sie auf jedes Stück.
   6. Verschließen Sie die Petrischalen und stellen Sie sie unter geeigneten Wachstumsbedingungen (wie oben erwähnt) in einen Inkubator. Die Pilzisolate wachsen langsam auf Filterpapier. Inkubieren Sie ca. 15 Tage, um eine vollständige Besiedlung zu gewährleisten.
   7. Nach der Sporulation oder vollständigen Koloniebildung auf Filterpapieren werden die einzelnen Papierstücke ohne Nährboden in eine neue Petrischale umgefüllt. Später stellen Sie die Petrischalen in den Inkubator, bis das Filterpapier und der Pilz vollständig getrocknet sind (ca. 20-30 Tage).
   8. Legen Sie nach dem Trocknen 10 Stücke Filterpapier in jeden sterilen Papierumschlag, beschriften Sie jeden Umschlag, stecken Sie diese Umschläge in Plastiktüten und lagern Sie die Plastiktüten mit den Umschlägen in einem durchsichtigen Plastikbehälter bei -20 °C.
10. Berechnen Sie die Prävalenzrate der Linsenwelke-, Wurzel- und Kronenfäulekrankheit in Yozgat nach der unten angegebenen Formel, unter Berücksichtigung der Prävalenz der Krankheit in jedem Linsenfeld, gefolgt vom Namen des Bezirks der Provinz.
    Prävalenzrate der Erkrankung (%) = (a / b) x 100
    wobei a die Anzahl der fehlerhaften Felder angibt; b gibt die Gesamtzahl der vermessenen Felder in einem Distrikt an.
11. Berechnen Sie die Inzidenz der Krankheit nach der von Bora und Karaca²⁰ berichteten Methode des gewichteten Durchschnitts. Zähle die Pflanzen in jedem Quadrat auf dem Feld. Trennen Sie sie in jedem Quadrat in kranke und nicht kranke Pflanzen und berechnen Sie die Krankheitsprävalenz nach der unten angegebenen Formel.
    Prävalenzrate der Erkrankung (%) = (x / y) x 100
    wobei x die Anzahl der erkrankten Pflanzen angibt; y gibt die Gesamtzahl der untersuchten Pflanzen an.
12. Berechnen Sie den Schweregrad der Erkrankung nach der Skala 0-4 von Öğüt²¹, wobei 0 = keine Symptome zeigte, 1 = leichte Symptome bei 25% der Blätter; 2 = mäßige Symptome bei 26%-50% der Blätter; 3= starke Chlorose und Welke bei 51%-75% der Blätter; und 4 = sehr schwere Chlorose- und Welkesymptome oder Austrocknung, Abwurf, Wachstumsverzögerung oder abgestorbene Blätter bei mehr als 75 % der Pflanzen in der gleichen Reihenfolge (Abbildung 2).
13. Berechnen Sie den Schweregrad der Erkrankung anhand der folgenden Formel mit den erhaltenen Skalenwerten¹⁶.
    Schweregrad der Erkrankung (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    wobei ni Anzahl der Pflanzen im Skalenwert; vi Skalenwert; V höchster Skalenwert; N Gesamtzahl der beobachteten Pflanzen; i gibt die Anzahl der Klassen an.

2. Meteorologische Daten

1. Durchführung von Umfragestudien. Für dieses Protokoll wurden in den Zeiträumen Mai und Juni 2022 sowie 2023 Befragungen durchgeführt. Beziehen Sie die Werte für Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit und Gesamtniederschlag für den Zeitraum März-Juli in den Jahren 2022, 2023 und langen Jahren von der Direktion für Provinzmeteorologie in Yozgat (Tabelle 1).

3. Morphologische Identifizierung

1. Vergleichen Sie die kulturellen (Koloniefarbe, oberirdisches Myzel, Myzelwachstumsrate) und konidialen (konidiale Abmessungen, Form, Farbe und Anzahl des Septums) der Fusarium-Isolate mit denen früherer Studien und identifizieren Sie vorläufig Pilzarten.
2. Auswahl repräsentativer Proben aus den Gruppen, die für die morphologische Identifizierung verwendet werden sollen. Reinigen Sie diese Proben gemäß der oben erwähnten Methode zur Isolierung einzelner Sporen. Während dieser Zeit sind die Pigmentierungseigenschaften der Kolonie von Fusarium-Isolaten sowie die Mikro-/Makrokonidien- und Chlamydosporenstrukturen zu beobachten.
3. Um die Bildung von mikromorphologischen Strukturen wie Mikro-/Makrokonidien und Chlamydosporen in den erhaltenen reinen Pilzkulturen zu fördern, inkubieren Sie auf PDA bei 25 ± 1 °C und 12 h: 12 h dunkel: hell für 25-30 Tage in einem Inkubator. Messen Sie die Länge und Breite der Konidien für jedes Fusarium-Isolat durch Lichtmikroskopie. Dokumentieren Sie außerdem die Struktur, Form, Farbe und Septen der Konidien mit oder ohne Septen mit einem Lichtmikroskop, das mit einer Digitalkamera geliefert wird.
4. Basierend auf den obigen Beobachtungen gruppieren Sie die Fusarium-Isolate nach Artniveau, wie in Leslie und Suerell²² beschrieben.

4. Molekulare Identifizierung

HINWEIS: Die gesamte genomische DNA der Fusarium-Isolate wurde mit der folgenden Methode extrahiert, die gegenüber dem Protokoll von Cenis²³ leicht modifiziert wurde. PCR-Analysen und Elektrophorese von Fusarium-Isolaten wurden unter Verwendung des von Aras und Endes²⁴ beschriebenen Protokolls durchgeführt.

1. Extraktion genomischer DNA von Pilzen
   1. Aus einer frischen Kultur (10 Tage alt) von Fusarien-Isolaten , die auf PDA gezüchtet wurden, kratzen Sie 100 mg Myzel mit einem sterilen Skalpell ab und geben Sie es dann in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei -20 °C über Nacht.
   2. Nach der Inkubation über Nacht 500 μl DNA-Extraktionspuffer (200 mM Tris-HCl pH: 8,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 % Natriumdodecylsulfat) in die Röhrchen geben und mit einem sterilen Kunststoffstößel zerkleinern.
   3. Anschließend 150 μl 3M Natriumacetat (NaOAc) pH 5,2 in die Röhrchen geben und 30 min bei -20 °C inkubieren. Nach diesem Schritt zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4.000 x g für 10 min.
   4. Nach der Zentrifugation werden 400 μl des Überstands am oberen Rand des Röhrchens in neue Röhrchen (1,5 ml) überführt und ein gleiches Volumen Isopropanol (2-Propanol) hinzugefügt. Inkubieren Sie die neuen Röhrchen bei -20 °C für 30 min. Mischen Sie in dieser Zeit die Röhrchen vorsichtig 5x oder 6x.
   5. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 4.000 x g , um die genomische DNA auszufällen, und entsorgen Sie die gesamte in den Röhrchen verbleibende Flüssigkeit.
   6. Geben Sie 1 ml 70%iges Ethanol in das genomische DNA-Pellet als weißes oder cremefarbenes Sediment am Boden des Röhrchens. Mischen Sie die Tube vorsichtig 4x-5x für ca. 1 Minute auf und ab und entsorgen Sie dabei das gesamte Ethanol in den Tubes. Öffnen Sie dann die Röhrchen 30 Minuten lang im laminaren Luftstrom, um das Ethanol auf dem DNA-Pellet vollständig zu verdampfen.
   7. Um die genomische DNA aufzulösen und lange zu lagern, geben Sie 50 μl TE (1 M Tris-HCl pH: 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0) Pufferlösung in die Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen in einem Wasserbad bei 65 °C für 1 h. Mischen Sie das Röhrchen während dieser Zeit vorsichtig 8x-10x auf und ab. Lagern Sie die in TE-Pufferlösung gelöste genomische DNA in einem Tiefkühlschrank bei -20 °C für die Verwendung in molekularen Studien.
2. Verwenden Sie für PCR-Studien die Oligonukleotid-Primer ITS5 F (5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'), um die ITS-Region von rDNA²⁵ zu amplifizieren. Jede PCR-Reaktion wird mit 2,5 μl 10x PCR-Puffer, 2,5 μl MgCl₂ (25 mM), 2,5 μl dNTP (2 mM), 0,5 μl jedes Primers (10 μM), 2 μl Template-DNA, 0,5 μl Taq-DNA-Polymerase (1 U/μL, Fermantas) und 14 μl sQH2O in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt.
3. Für die 25-μl-PCR-Reaktion führen Sie das folgende PCR-Programm bei 95 °C für 2 Minuten (Erstdenaturierung) durch, gefolgt von 40 Zyklen; 95 °C für 30 s (Denaturierung), 55 °C für 45 s (Glühen), 72 °C für 90 s (Verlängerung) und 72 °C für 5 min (endgültige Verlängerung). Elektrophorese-PCR-Produkte für 1,5 h bei 90 V in 1,5 % Agarosegel, hergestellt in 1x TAE (Tris Base - Glacial Acetic Acid - EDTA) Pufferlösung.
   1. Zur Herstellung von TAE-Puffer für die Gelelektrophorese lösen Sie 242 g Tris-Base in 700 ml sterilem Wasser; fügen Sie die 57,1 ml Eisessig hinzu; Fügen Sie die 100 ml 0,5 M EDTA-Lösung hinzu und stellen Sie das Volumen durch Zugabe von sterilem Wasser auf 1 l ein. Stellen Sie den endgültigen pH-Wert des 1 L 50x TAE-Puffers auf 8,5 ein. Um den 1x TAE-Arbeitspuffer herzustellen, fügen Sie 49 Teile steriles Wasser zu 1 Teil des 50x TAE-Puffers hinzu.
4. Färben Sie die Gele mit 0,5 μg/mL Ethidiumbromid und inspizieren Sie sie visuell, indem Sie sie auf einem UV-Transilluminator sichtbar machen.
5. Um die phylogenetische Beziehung zwischen Wurzel- und Kronenfäule-Wirkstoffisolaten zu untersuchen, beschaffen Sie sich die ITS-Genbasensequenzen mittels PCR, die bidirektional (5'-3' und 3'-5') über einen Anbieter synthetisiert wurden. Vergleichen Sie die Basensequenzen mit den Gendaten von der NCBI-Website (National Center of Biotechnology Information) und den Basensequenzen des ITS-Gens anderer Fusarium-Isolate auf der Welt mit dem Blast-Programm. Verwenden Sie diese Option, um die Isolate auf Speziesebene zu identifizieren, wie unten beschrieben.
   1. Gehen Sie zu https://www.ncbi.nlm.nih.gov Website. Klicken Sie auf die Registerkarte BLAST im Abschnitt Beliebte Ressourcen.
   2. Klicken Sie im neuen Fenster auf die Registerkarte Nucleotide BLAST . Geben Sie im neuen Fenster im Abschnitt Abfragesequenz eingeben die Basissequenzen im Fasta-Format ein und schreiben Sie den Namen der Studie in den Abschnitt Stellenbezeichnung.
   3. Aktivieren Sie anschließend Standarddatenbanken (nr usw.) auf der Registerkarte Datenbank im Abschnitt Suchsatz auswählen am unteren Rand.
   4. Aktivieren Sie Hochähnliche Sequenzen (Megablast) auf der Registerkarte Optimieren für im Abschnitt Programmauswahl und klicken Sie auf die Registerkarte BLAST am unteren Rand der Seite.
6. Verwenden Sie das phylogenetische Analyseprogramm MEGA 11, um die phylogenetische Verwandtschaft zwischen Fusarium-Isolaten zu bestimmen. Richten Sie die Basensequenzen mit dem ClustalW-Programm aus und erstellen Sie die genetischen Stammbäume der Isolate entsprechend der maximalen Parsimony für das ITS-Gen²⁶.
   1. Um die Mega-Software herunterzuladen, gehen Sie auf die Website https://www.megasoftware.net und installieren Sie die Mega-Software. Die MEGA-Software wird KOSTENLOS für den Einsatz in Forschung und Lehre zur Verfügung gestellt.
   2. Speichern Sie zunächst die Sequenzen auf dem Desktop als Notepad-Datei (.txt) im FASTA-Format. Führen Sie das Mega-Softwareprogramm aus und klicken Sie auf die Registerkarte ALIGN . Klicken Sie im Fenster auf Bearbeiten/Achse erstellen . Aktivieren Sie anschließend die Option Neue Achse im neuen Fenster erstellen und klicken Sie zur Bestätigung auf OK .
   3. Klicken Sie auf die Registerkarte DNA . Löschen Sie die Nummer 1. Sequenz, die automatisch im Fenster angezeigt wird, gehen Sie zur Datei bearbeiten und klicken Sie dann auf Sequenz aus der Registerkarte Datei einfügen . Öffnen Sie die Editor-Datei (.txt), die die Sequenzen enthält und sich auf dem Desktop befindet.
   4. Zu diesem Zeitpunkt werden alle Sequenzen auf dem Bildschirm angezeigt. Klicken Sie zuerst auf Eine beliebige Sequenz , die auf dem Bildschirm erscheint, und markieren Sie dann alle Sequenzen mit STRG + A. Öffnen Sie die Alignment-Datei und klicken Sie dort auf Align by Clustal W und klicken Sie auf OK , um das Programm in den Standardeinstellungen auszuführen.
   5. Nachdem Sie die Unterschiede in der Ausrichtung der Sequenzen untersucht haben, gehen Sie zur Datendatei, klicken Sie auf Phylogenetische Analyse und klicken Sie dann auf Nein in der Checkbox im Fenster, um anzugeben, ob die Sequenzen Proteine synthetisieren oder nicht. Unsere Sequenzen synthetisieren keine Proteine, da sie zur ITS-Region gehören.
   6. Kehren Sie zum Hauptfenster der Mega-Software zurück. Klicken Sie auf Phylogenie und wählen Sie Maximale Parsimony Tree(s) erstellen/testen. Wählen Sie im neuen Fenster die Bootstrap-Methode für den Phylogenietest aus, und geben Sie die Bootstrap-Werte 1.000 ein, um die Verzweigungsstärke zu testen. Wählen Sie auf der Registerkarte Lücken/fehlende Datenbehandlung die Option Teilweise Löschung aus, wählen Sie Subtree-pruning-Regrafting (SPR) als MP-Suchmethode aus und klicken Sie auf OK , um die Vorgänge zu bestätigen.
   7. Warten Sie auf das Analyseergebnis, um den phylogenetischen Baum anzuzeigen.

5. Test der Pathogenität

1. Es werden vier Isolate für Pathogenitätsstudien für jede repräsentative Spezies aus der Fusarium-Spezies verwendet, die mit molekularen Methoden identifiziert wurden. Durchführung von Pathogenitätsuntersuchungen bei 24 °C, 16 h Fluoreszenzlicht/8 h Dunkelphotoperiode und 65 % Luftfeuchtigkeit in einem klimatisierten Raum.
2. Säen Sie die Linsensamen in schwarze Plastikfläschchen mit 45 Löchern von 5 cm Durchmesser. Bewahren Sie jedes Fläschchen 3 Minuten lang in 1%igem Natriumhypochlorit auf und spülen Sie es dann 3x mit sterilem destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Samen 24 Stunden lang in einem sterilen Schrank und säen Sie mit je einem Samen in jedes Loch.
   HINWEIS: Die Linsensamen der Sorte Kayı 91, die empfindlich auf die Krankheit reagieren, wurden in allen Pathogenitätstests verwendet⁶. Als Inokulationsmethode²⁷ wurde die Technik des Eintauchens von Sämlingen verwendet.
3. Inkubieren Sie Reinkulturen jedes Isolats 7-10 Tage lang in PDA bei 24 °C. Die aus der Stammkultur gezüchteten Kolonien mit einem Spachtel von der Oberfläche des Mediums abkratzen und die Sporen-/Myzelsuspension mit sterilem destilliertem Wasser vorbereiten.
4. Entfernen Sie große Rückstände aus der Suspension durch Filtration durch ein 4-lagiges Käsetuch und stellen Sie die Sporen-/Myzelkonzentration mit Hilfe eines Hämozytometers auf 1 x 10⁶ Sporen/ml ein.
5. Nach dieser Phase entwurzeln Sie die Wurzeln der Sämlinge, die zuvor in den Fläschchen gewachsen sind, wenn sie 2-3 echte Blätter haben. In Leitungswasser waschen und die Wurzeln mit einer sterilen Nadel leicht verletzen. Tauchen Sie diese Sämlinge 3 Minuten lang in die vorbereitete Sporen-/Myzelsuspension und pflanzen Sie sie dann in Plastikfläschchen mit einer sterilen Erde/Torf-Mischung (2:1; v/v) um.
6. Für die Sämlinge, die als Kontrollen verwendet werden, entwurzeln Sie ihre Wurzeln, verletzen Sie sie und pflanzen Sie sie dann, indem Sie sie nur in steriles Wasser tauchen. Führen Sie 3 Wochen nach dem Impfprozess Bewertungen der Pathogenitätstests gemäß der Skala von 0-4 durch.
7. Nachdem die berechneten Schweregradwerte der Erkrankung einer Winkeltransformation unterzogen wurden, unterziehen Sie die erhaltenen Werte einer Varianzanalyse und bewerten Sie die Unterschiede zwischen den Mittelwerten nach dem Tukey'schen HSD-Test (p = 0,05). Schweregrad der Erkrankung: Isolate mit 0%-15% wurden als sehr niedrige Virulenz (LV) bewertet, Isolate mit 16%-35% wurden als niedrige Virulenz (LV) bewertet, Isolate mit 36%-50% wurden als moderate Virulenz (O) bewertet, Isolate mit 51%-70% wurden als hohe Virulenz (VV) bewertet, Isolate mit 71%-100% wurden als sehr hohe Virulenz (VV) bewertet und Isolate ohne Krankheitssymptome wurden als saprophytische oder epiphytische Isolate bewertet.

Ergebnisse

Bestimmung von Krankheitsparametern
Insgesamt wurden 83 Linsenaussaatflächen in neun verschiedenen Regionen von Yozgat auf einer Fläche von 1.1984 x 10^{6 m2} hinsichtlich der Symptome der Welke-, Wurzel- und Kronenfäule untersucht (Tabelle 2). Die Symptome der Welke- oder Wurzelfäule traten auf allen Feldern auf. Die Inzidenz der Welke- und Wurzelfäule in Yozgat wurde jedoch mit 16,9 % und der ...

Diskussion

Es ist bekannt, dass die Fusarium-Welke in einigen Teilen der Welt zu erheblichen wirtschaftlichen Ertragseinbußen führt³¹. Die Krankheit wurde zuerst in Ungarn^{gemeldet 32} und später in vielen Ländern wie Ägypten, Indien, Myanmar, Nepal, Pakistan, Türkiye, Syrien und den USA³³. Kumar et ^al.34 berichteten über eine weite Verbreitung von Linsenwelke, Wurzel- und Wurzelhalsfäule ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-lactic acid	Merck	100366	Was used as an antibiotic in studies.
2-propanol	Merck	109634	Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)	Eppendorf Research	LB.EP.3123000012	Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)	Eppendorf Research	LB.EP.4924000916	Used to measure small volumes of liquids.
Agar	Merck	110453	For use in making fungal media.
Agarose	Sigma-Aldrich	18300012	For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room	?klimlab		Was used to grow plants under controlled conditions.
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9393	Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balance	Shimadzu ATX224		Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizer	Zealway	GF-120DR	It was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscope	Leica DM750		For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinet	HFsafe Class II A2		To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
Centrifugal	DLAB DM1424	LB.DL.903001124	Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	220551	Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer set	Sigma-Aldrich	Z165220	It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slide	ISOLAB	075.01.006 / 075.02.005	Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrate	Merck	108342	For use in making fungal media.
DFC450 with digital camera	Leica		Digital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope	Leica	MIC5246	Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresis	thermo fisher scientific	B2-UVT
Dna gel loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611	For use in molecular diagnostics.
dNTP mix	Thermo Scientific	R0192	Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)	Thermo Scientific	K1082	For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatule	ISOLAB	082.03.001	It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta	Thermo Scientific	17892	For use in molecular diagnostics.
Ethanol	Merck	100983	Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758	Used in molecular studies.
Filter paper	ISOLAB	107.58.158	Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinet	ZHICHENG ZXDS-A-1090		For use in incubation processes.
Fume hood	Elektromag EM1201	LB.EM.EM1201	It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging system	Syngene G:BOX Chemi XX6		For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladder	Thermo Scientific	SM0372	For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acid	Merck	1005706	Used in molecular studies.
Glycerol	Merck	104094	For use in stock culture of fungi.
Lancet	ISOLAB	048.50.002	Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	814733	Used in molecular studies.
Measuring tape	ISOLAB	016.07.500	Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubes	ISOLAB	0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003	Used to store different volumes of liquids.
PCR tube	ISOLAB	123.01.002	It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishes	ISOLAB	120.13.090	For use in growing fungus culture.
Pipette tips	ISOLAB	005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004	To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bag	ISOLAB	039.30.005	Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic pot	ToXA		Was used for growing plants.
Pliers, clamps	ISOLAB	048.08.130	It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortar	ISOLAB	038.02.150	Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agar	Condalab	1022	For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water system	human CORPORATION	LT.HC.NHP009	Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)	Vestel		For use in the storage of stock materials.
Rifampicin	Sigma-Aldrich	557303	Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetate	Merck	106268	Used in molecular studies.
Sodium chloride	Merck	1064041000	Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143	Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solution	Merck	105614	Used for surface disinfection.
Spatula	ISOLAB	047.33.210	It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomyc?n sulfate	BioShop Canada	STP101	To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pure	Tekkim	TK.200650	For use as a disinfectant in all stages of work.
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T3258	Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCR	Bio?Rad T100		For use in genomic analyses.
Thoma lam	ISOLAB	075.03.002	For use in spore counting.
Tris HCL	Roche	10812846001	Used in molecular studies.
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Used in molecular studies.
Tween 80	Merck	822187	For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteks	Velp WIZARD	LB.VLP.F202A0175	Used to mix substances in liquid volumes.
Water baths	Memmert WNB 22	1018-5702	It was used during incubation in dna extraction studies.