בדיקת שדות עדשים לנוכחות נבילת פוסריום וריקבון שורשים בטורקיה תחת אקלים יבשתי

Summary

מחקר במחוז יוזגת מצא כי גורמים ביוטיים, כגון מחלות פטרייתיות כמו נבילה וריקבון שורשים, מגבילים את ייצור העדשים. מבודדי פוסריום נמצאו ב-95.4% מהדגימות, מה שמרמז על סקרים מקומיים תקופתיים וניטור קבוע לפיתוח טכנולוגיה בת קיימא ואסטרטגיות בקרה יעילות.

Abstract

עדשים הן צמח קטניות חשוב המאביק את עצמו. ייצורו מוגבל על ידי גורמים ביוטיים שונים, במיוחד חומרים פטרייתיים הגורמים לקומפלקס הנבילה וריקבון השורשים. המחקר נועד להבין את האפידמיולוגיה והאטיולוגיה האזורית של גורמים פטרייתיים פיטופתוגניים כדי לפתח אסטרטגיות בקרה נגד Fusarium spp הנישא בקרקע. מחקר זה חקר 83 יישובים לזריעת עדשים במחוז יוזגת עבור מחלות נבול, שורש וריקבון כתר הנגרמות על ידי מיני פוסריום נפוצים במהלך 2022 ו-2023. צמחי עדשים סימפטומטיים נאספו לבידוד וזיהוי פטרייתי. מבודדי הפוסריום קובצו לפי מורפולוגיה של המושבה ותורבו על מדיום PDA. יתר על כן, DNA גנומי שהתקבל מבודדי Fusarium נותח באמצעות PCR והושווה לבודדי Fusarium אחרים הרשומים ב-NCBI GenBank. הקשרים הגנטיים בין מבודדי Fusarium נקבעו בשיטת Maximum Parsimony (MP) בתוכנית Mega 11. התוצאות, השכיחות הממוצעת ושיעור חומרת המחלה של מחלות נבילה וריקבון שורשים במחוז יוזגת נקבעו כ-16.9% ו-38.6%, בהתאמה. מבודדי פוסריום נמצאו ב-95.4% מהדגימות. הייתה הומוגניות של רצף נוקלאוטידים של 99.5% עד 100% בקרב מבודדים של F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum ו-F. solani , והמין המבודד ביותר היה F. oxysporum. הדנדרוגרמה MP של מבודדי Fusarium חולקה לשני ענפים עיקריים, הענף הראשון כלל את כל מבודדי F. solani . הענף העיקרי השני כלל מיני Fusarium אחרים שבודדו במחקר הנוכחי וב-NCBI GenBank. המחקר מציע סקרים מקומיים תקופתיים כדי לקבוע את תדירות נבילת הפוסריום לדיכוי בעדשים. מומלץ מאוד לדכא בזמן נזקים מבוססי פוסריום כדי לשלוט במחלה ולשמר את מערכת ייצור העדשים.

Introduction

עדשים (Lens culinaris Medik.), קטנית קטנה למאכל השייכת למשפחת Fabaceae, היא יבול המאביק את עצמו בעונה קרירה עם עלים דמויי מחט ופרחים לבנים עד סגולים בהירים או סגולים כהים¹. הוא בוית על ידי בני אדם לפני כ-10,000 שנה בחלק המסופוטמי של הסהר הפורה והתפשט במהירות לעולם החדש, כולל אגן הים התיכון ומרכז אסיה, ומאוחר יותר התאזרח באמריקה². שטח גידול העדשים העולמי הוא כ-5.5 מיליון דונם עם ייצור של 6.6 מיליון טון³. טורקיה מדורגת^{במקום הרביעי} בייצור עדשים אחרי קנדה, הודו ואוסטרליה. גידול עדשים בטורקיה חשוב מאוד ומהווה 6.7% מהייצור העולמי. סך ייצור העדשים של טורקיה הוא 474,000 טון והוא מיוצר בלפחות 40 מחוזות⁴. כ-89.5% מייצור העדשים בטורקיה מורכב מעדשים אדומות וירוקות, המהוות 10.5% מיבול החורף באזור דרום מזרח אנטוליה. שאר היבול גדל כגידולי קיץ. מחוזות יוזגאט (39.5%), קוניה (23.7%), קירשהיר (16.3%), צ'ורום (7.6%) ואנקרה (2.9%) תורמים במידה רבה לייצור העדשים הירוקות⁴. ייצור עדשים יכול להיות מוגבל על ידי גורמי לחץ ביוטיים ואביוטיים. כפור ובצורת הם גורמי הלחץ האביוטיים הנפוצים ביותר בייצור עדשים ירוקות בקיץ⁵. מחלות פטרייתיות כמו קומפלקס ריקבון נבול, שורש וכתר הנגרמות על ידי Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium ומיני Fusarium הן המחלות הפטרייתיות החשובות ביותר, הגורמות לשילוב של מחלות כולל שיכוך, דלקת שתילים, נבילה וריקבון שורשים, בהתאם לעיתוי ההדבקה, רגישות המארח ותנאים מטאורולוגיים ^{6,7, 8}.

פוסריום היא פטרייה חוטית לא מושלמת הנמצאת באדמה, בצמחים ובמצעים אורגניים והיא סוג קוסמופוליטי בין פתוגנים אלה⁹. הוא גורם למחלות שונות כגון נבילת פוסריום, ריקבון שורש וריקבון צווארון שורש, כמו גם דלקת ראש פוסריום בחיטה, נבילת פוסריום בקוקורביטים וריקבון שורשים ברוב הקטניות, כולל עדשים 10,11,12. ריקבון צווארון הנבילה של כלי הדם, השורש והשורש הנגרם על ידי Fusarium spp. היא המחלה החשובה ביותר של עדשים באזורי גידול עדשים רבים ברחבי העולם¹⁰. Fusarium oxysporum הוא מין הפוסריום הנפוץ ביותר הקשור לריקבון נבול, שורש ושורש בעדשים. ברחבי העולם, מחלות נבולה, שורש וריקבון כתר נגרמות על ידי F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani ו- F. verticillioides באזורי שתילת עדשים⁷. מחלות ריקבון שורש וכתר הנגרמות על ידי Fusarium spp. מתרחשות הן בשלבי השתיל והן בשלבי הבגרות וגורמות לנבילה פתאומית, ייבוש ובסופו של דבר מוות של העלים. תסמיני המחלה כוללים ריקבון זרעים, ריקבון שורשים, עלעלים עליונים נבולים, עיכוב, התכווצות וסלסול עלים. בשלבים האמצעיים והמאוחרים של מילוי התרמילים, הזרעים בדרך כלל מתכווצים, ותסמיני השורש כוללים עיכוב בצמיחה, שינוי צבע חום, קצות שורשים פגומים והתפשטות של שורשים משניים. ייתכן שלא נראה שינוי צבע של רקמת כלי הדם בכל המקרים¹³.

באזור מרכז אנטוליה נערכו מחקרים על מצב מחלות נבילה וריקבון שורשים בעדשים במספרים מוגבלים. ליוזגת יש אקלים מתון ומתון עם שפע גשמים בחורף בהשוואה לקיץ והיא מסווגת כ-Dsb (אקלים יבשתי חם ולח) על ידי קופן וגייגר¹⁴. הטמפרטורה הממוצעת היא 9.6 מעלות צלזיוס עם משקעים ממוצעים של 512 מ"מ. יוזגת ממוקמת בחצי הכדור הצפוני. הקיץ מתרחש ביוני, יולי, אוגוסט וספטמבר. חשוב מאוד שיהיה מידע על האפידמיולוגיה והאטיולוגיה האזורית של הגורמים הפטרייתיים הפיטופתוגניים הגורמים למחלה לפיתוח אסטרטגיות בקרה שונות נגד Fusarium spp. הנישאים באדמה, כדי לשלוט במחלה¹⁵. בהקשר זה, מטרות המחקר הנוכחי הן לקבוע ולזהות - את פרמטרי המחלה (שכיחות, שכיחות וחומרת המחלה) של מחלות נבולה, שורש וריקבון כתר בעדשים על ידי ביצוע סקר במחוז יוזגת, שם כ-40% מכלל ייצור העדשים הירוקות נעשה לבד, הפוסריום הפתוגני מינים הגורמים לנבילה וריקבון שורשים בעדשים על ידי ניתוחים מורפולוגיים ומולקולריים, ולקבוע את רמות האלימות האישיות של מיני הפוסריום על ידי ביצוע בדיקות פתוגניות.

Protocol

הערה: פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. סקר שדה, דגימה ובידוד פטרייתי

הערה: עבודות הסקר בוצעו בשנים 2022 ו-2023, על פי Endes¹⁶. בסך הכל נצפו 83 אזורי שתילת עדשים המכסים תשעה מחוזות במחוז יוזגת עבור מחלת ריקבון צווארון נבול, שורש ושורש (איור 1).

1. בחר שדות עדשים בשטח של מעל 1000 מ^"ר כאזור דגימה. אסוף כל דגימה על ידי הליכה אקראית מהגבול למרכז או לאמצע השדה על ידי זיגזגים ההולכים לאורך האלכסונים באמצעות מסגרת של 1 מ^"ר , והצבתה באופן אקראי במינימום של שלוש נקודות שונות שנבחרו באופן אקראי. אספו צמחי עדשים המראים תסמיני מחלה מכל נקודה, הכניסו אותם לשקיות נייר והעבירו אותם למעבדה לשימוש במחקרי בידוד וזיהוי פטריות.
   הערה: השורשים וצווארוני השורש של צמחי עדשים חולים שהועברו למעבדה נשטפו תחילה במי ברז כדי להיפטר משאריות גסות; מאוחר יותר, הם עברו חיטוי פני השטח לבידוד הפתוגנים הפטרייתיים כפי שתואר על ידי אנדס¹⁶.
2. משרים רקמות צמחים חולות באתנול 70% למשך 10-15 שניות, ולאחר מכן שוטפים 3 פעמים למשך 3 דקות כל אחת במים סטריליים. החזיקו את כולם ב-1% נתרן היפוכלוריט (NaOCl) למשך 5 דקות, ושטפו 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד שוב במים סטריליים.
3. יבש את רקמות הצמח הרטובות על ניירות סינון בארון סטרילי כדי לסיים את תהליך חיטוי פני השטח. לאחר מכן, חותכים את רקמות הצמח המחוטאות לחתיכות באורך 5-10 מ"מ ומניחים 4-5 חתיכות על מדיום PDA המכיל 0.01% סטרפטומיצין בתוך צלחות פטרי (קוטר 90 מ"מ). הכניסו את צלחות הפטרי לחממה בחושך בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 4-7 ימים והתבוננו בצמיחת הפטרייה.
   הערה: המבודדים הפטרייתיים המתפתחים טוהרו בשיטת בידוד הנבגים הבודדים. למטרה זו, המחקר שנערך על ידי Choi et ^al.17 על השגת תרביות נבגים בודדות של פטריות השייכות ל-Ascomycetes, Basidiomycetes, Coelomycetes ו-Hyphomycetes שונו ושימשו כמתואר להלן.
4. כדי לטהר מבודדים פטרייתיים, שמור את המבודדים הפטרייתיים שהתקבלו בתום מחקרי הבידוד בחממה בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות של אור פלורסנט / 12 שעות חושך למשך 15 יום כדי לעודד היווצרות מבני רבייה אנמורפיים על PDA.
5. שוקלים כ -100 מ"ג תפטיר פטריות מתרבויות בנות 15 יום בעזרת מרית, מעבירים אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל ואז טוחנים אותו היטב עם עלי פלסטיק סטריליים להומוגניזציה.
6. הוסף 1 מ"ל מים סטריליים ומערבולת למשך דקה אחת כדי להבטיח העברת נבגים למים. כדי להתאים את מספר הנבגים המועברים למים, צייר 20 מיקרוליטר מתערובת זו בעזרת פיפטה ובדוק את מספר הנבגים בהגדלה פי 10 של מיקרוסקופ האור.
7. כאשר כמות הנבגים גדולה מהכמות הרצויה, יש לדלל את תערובת הנבגים-מים ביחסים כגון 1/10, 1/100 ו-1/1000. ספק תערובת המכילה 4-6 נבגים בשדה הראייה של המיקרוסקופ.
8. קח 100 מיקרוליטר מתרחיף הנבגים המוכן והעביר אותו לצלחות פטרי בקוטר 90 מ"מ המכילות מדיום PDA בתוספת 0.1% סטרפטומיצין. לאחר מכן, מורחים את המתלה המועבר על מחשב כף היד בעזרת מרית דריגלסקי.
9. דגרו את מנות הפטרי המוכנות בחושך בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך 12-24 שעות. בסוף תקופה זו, חתיכות קטנות של קורים התפתחו מקונידיה אחת עם לולאת חיסון לצלחת פטרי חדשה המכילה מדיום PDA. כל תרבות המתקבלת מכל נבג היא תרבית נבגים אחת. אחסן אותם לשימוש בבדיקות פתוגניות וזיהוי מורפולוגי ומולקולרי.
   הערה: המטרה העיקרית היא לשמור על מבודדים פטרייתיים בחיים לאורך זמן מבלי לשנות את המורפולוגיה, הגנטיקה והאלימות שלהם. תהליך האחסון בוצע בשתי שיטות שונות^18,19. כל שיטות האחסון המשמשות במחקר זה מוסברות בפירוט להלן.
   1. השיטה הראשונה לאחסון דגימות היא כדלקמן. גדל מבודדים פטרייתיים על מדיום PDA בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס עם חושך של 12:12 שעות: אור למשך 15 יום כדי לקבל דיסקיות תפטיר בקוטר 4 מ"מ שניתן לאחסן במים סטריליים.
   2. חותכים דיסקיות תפטיר (קוטר 4 מ"מ, 10 דיסקים) עם מקדח שעם מתרביות פטרייתיות שגדלו בתנאים הנ"ל. העבירו את דיסקי התפטיר לצינורות מיקרו-צנטריפוגה המכילים 1 מ"ל מים סטריליים. שמור את הדגימות בצינורות מיקרו-צנטריפוגה במקרר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
   3. השיטה השנייה לאחסון דגימות היא כדלקמן. ראשית, קחו קמצוץ מהדיסק הפטרייתי הטהור מתרביות הנבגים הבודדות המתקבלות עם לולאת חיסון והעבירו אותו לצלחות פטרי המכילות PDA בתוספת כלורמפניקול, חומצה לקטית, אמפיצילין, ריפמפיצין, טטרציקלין, סטרפטומיצין וכו'.
   4. גדל במשך 5-10 ימים לפני תהליך האחסון בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס בתנאי אור של 12 שעות: 12 שעות. חותכים ומעקרים ניירות סינון לשימוש כללי בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ בחיטוי ב-121 מעלות צלזיוס, 15 psi למשך 60 דקות.
   5. מניחים את ניירות הסינון בצלחות פטרי חדשות עם מדיום זהה או סלקטיבי. חותכים מושבות/נבגים מתרבות פטרייתית טהורה ומניחים אותם על החלק העליון של כל חתיכה.
   6. אוטמים את צלחות הפטרי ומניחים אותן בחממה בתנאי גידול מתאימים (כאמור לעיל). הפטריות המבודדות גדלות לאט על נייר פילטר. יש לדגור במשך כ-15 יום כדי להבטיח קולוניזציה מלאה.
   7. לאחר נבג או היווצרות מושבה מלאה על ניירות סינון, העבירו את פיסות הנייר הבודדות לצלחת פטרי חדשה ללא מדיום תרבית. מאוחר יותר, הכניסו את כלי הפטרי לחממה עד שנייר הסינון והפטרייה יבשים לחלוטין (כ-20-30 יום).
   8. לאחר הייבוש הכניסו 10 פיסות נייר סינון לכל מעטפת נייר סטרילית, סמנו כל מעטפה, הכניסו את המעטפות לשקיות ניילון ואחסנו את שקיות הניילון המכילות את המעטפות בכלי פלסטיק ושקוף בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
10. חשב את שיעור השכיחות של מחלת נבילת עדשים, שורש וריקבון כתר ביוזגת על פי הנוסחה המופיעה להלן, בהתחשב בשכיחות המחלה בכל שדה עדשים, ואחריו שם המחוז של המחוז.
    שיעור שכיחות המחלה (%) = (a / b) x 100
    כאשר a מציין את מספר השדות החולים; b מציין את המספר הכולל של השדות שנסקרו במחוז.
11. חשב את שכיחות המחלה על פי שיטת הממוצע המשוקלל שדווחה על ידי בורה וקראצ'ה²⁰. ספרו את הצמחים בכל ריבוע בשדה. הפרד אותם לצמחים חולים ולא חולים בכל ריבוע וחשב את שכיחות המחלה לפי הנוסחה המופיעה להלן.
    שיעור שכיחות המחלה (%) = (x / y) x 100
    כאשר x מציין את מספר הצמחים החולים; y מציין את המספר הכולל של הצמחים שנסקרו.
12. חשב את חומרת המחלה לפי הסולם 0-4 של Öğüt²¹, כאשר 0 = לא הראה תסמינים, 1 = תסמינים ברמה קלה ב -25% מהעלים; 2 = תסמינים ברמה בינונית ב-26%-50% מהעלים; 3= כלורוזיס חמור ונבילה ב-51%-75% מהעלים; ו-4 = כלורוזיס חמור מאוד ותסמיני נבילה או ייבוש, נשירה, עיכוב בגדילה או עלים מתים ביותר מ-75% צמחים באותו סדר (איור 2).
13. חשב את חומרת המחלה באמצעות הנוסחה הבאה עם ערכי הסולם שהתקבלו¹⁶.
    חומרת המחלה (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    כאשר ni מספר הצמחים בערך הסולם; ערך סולם vi; ערך V בקנה מידה גבוה ביותר; N המספר הכולל של הצמחים שנצפו; i מציין את מספר המחלקות.

2. נתונים מטאורולוגיים

1. לערוך מחקרי סקרים. לצורך פרוטוקול זה, נערכו סקרים בתקופות מאי ויוני 2022 ו-2023. קבל את ערכי הטמפרטורה, הלחות היחסית וסך המשקעים לתקופה מרץ-יולי בשנים 2022, 2023, ושנים ארוכות מהמנהלת למטאורולוגיה מחוזית ב-Yozgat (טבלה 1).

3. זיהוי מורפולוגי

1. השווה את המאפיינים התרבותיים (צבע המושבה, תפטיר אווירי, קצב גידול התפטיר) והקונידיאלי (מידות קונידיאליות, צורה, צבע ומספר המחיצות) של מבודדי הפוסריום לאלה של מחקרים קודמים וזהה באופן זמני מיני פטרייה.
2. בחר דגימות מייצגות מהקבוצות שישמשו בזיהוי מורפולוגי. טהר דגימות אלו על פי שיטת בידוד הנבגים הבודדת כאמור לעיל. במהלך תקופה זו, שימו לב למאפייני הפיגמנטציה של המושבה של מבודדי פוסריום וכן מבני מיקרו/מקרוקונידיה וכלמידוספור.
3. כדי לקדם את היווצרותם של מבנים מיקרומורפולוגיים כגון מיקרו/מקרוקונידיה וכלמידוספורים בתרביות הפטריות הטהורות המתקבלות, דגרו על PDA בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ו-12 שעות: 12 שעות חושך: אור למשך 25-30 יום בחממה. מדוד את האורך והרוחב של קונידיה עבור כל Fusarium מבודד על ידי מיקרוסקופ אור. בנוסף, תעד את המבנה, הצורה, הצבע והמחיצה או ללא מחיצות של הקונידיה באמצעות מיקרוסקופ אור המסופק עם מצלמה דיגיטלית.
4. בהתבסס על התצפיות לעיל, קבץ את מבודדי הפוסריום לפי רמת המינים, כמתואר בלסלי וסוארל²².

4. זיהוי מולקולרי

הערה: ה-DNA הגנומי הכולל של מבודדי הפוסריום חולץ בשיטה הבאה, ששונתה מעט מהפרוטוקול של Cenis²³. ניתוחי PCR ואלקטרופורזה של מבודדי פוסריום בוצעו באמצעות הפרוטוקול שתואר על ידי אראס ואנדס²⁴.

1. מיצוי DNA גנומי פטרייתי
   1. מתרבית טרייה (בת 10 ימים) של Fusarium isolates הגדלים על PDA, מגרדים 100 מ"ג תפטיר עם אזמל סטרילי ולאחר מכן מעבירים אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   2. לאחר דגירה של לילה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מיצוי DNA (200 מ"מ Tris-HCl pH: 8.5, 250 מ"מ NaCl, 25 מ"מ EDTA, 0.5% נתרן דודציל סולפט) לתוך הצינורות ומועך בעזרת עלי פלסטיק סטרילי.
   3. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של 3M נתרן אצטט (NaOAc) pH 5.2 לצינורות ודגירה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר שלב זה, צנטריפוגה את הצינורות ב -4,000 x גרם למשך 10 דקות.
   4. לאחר צנטריפוגה, העבירו 400 מיקרוליטר של הסופרנטנט בחלק העליון של הצינור לצינורות חדשים (1.5 מ"ל) והוסיפו נפח שווה של איזופרופנול (2-פרופנול). דגרו את הצינורות החדשים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך תקופה זו, ערבבו בעדינות את הצינורות פי 5 או 6.
   5. צנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 10 דקות כדי לזרז את ה-DNA הגנומי ולהשליך את כל הנוזל שנותר בצינורות.
   6. הוסף 1 מ"ל של 70% אתנול לכדור ה-DNA הגנומי כמשקע לבן או בצבע שמנת בתחתית הצינור. מערבבים בעדינות את הצינור למעלה ולמטה 4x-5x למשך כדקה אחת, וזורקים את כל האתנול בצינורות. לאחר מכן, פתח את הצינורות בזרימת אוויר למינרית למשך 30 דקות כדי לאדות לחלוטין את האתנול על כדור ה-DNA.
   7. כדי להמיס את ה-DNA הגנומי ולאחסן אותו לאורך זמן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת חיץ TE (1M Tris-HCl pH: 8.0; 0.5M EDTA pH 8.0) לצינורות ודגר את הצינורות באמבט מים ב-65 מעלות צלזיוס למשך שעה. במהלך תקופה זו, ערבבו בעדינות את הצינור למעלה ולמטה פי 8-10. אחסן את ה-DNA הגנומי המומס בתמיסת חיץ TE במקפיא עמוק של -20 מעלות צלזיוס לשימוש במחקרים מולקולריים.
2. למחקרי PCR, השתמש בפריימרים אוליגונוקלאוטידים ITS5 F (5′GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') כדי להגביר את אזור ה- ITS של rDNA²⁵. בצע כל תגובת PCR עם 2.5 מיקרוליטר של מאגר PCR פי 10, 2.5 מיקרוליטר של MgCl₂ (25 מ"מ), 2.5 מיקרוליטר של dNTP (2 מ"מ), 0.5 מיקרוליטר מכל פריימר (10 מיקרומטר), 2 מיקרוליטר של DNA תבנית, 0.5 מיקרוליטר של Taq DNA פולימראז (1 U/μL, פרמנטס) ו-14 מיקרוליטר של sQH2O בנפח כולל של 25 מיקרוליטר.
3. עבור תגובת PCR של 25 מיקרוליטר, הפעל את תוכנית ה-PCR הבאה 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (דנטורציה ראשונית), ואחריה 40 מחזורים; 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (דנטורציה), 55 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (חישול), 72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות (הארכה) ו-72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (הארכה סופית). מוצרי PCR אלקטרופוריים למשך 1.5 שעות ב-90 וולט בג'ל אגרוז 1.5% המוכן בתמיסת חיץ 1x TAE (Tris Base - Glacial Acetic Acid - EDTA).
   1. להכנת מאגר TAE לאלקטרופורזה של ג'ל, ממיסים 242 גרם בסיס טריס ב-700 מ"ל מים סטריליים; הוסף 57.1 מ"ל של חומצה אצטית קרחון; הוסף את 100 מ"ל של תמיסת EDTA של 0.5 M, והתאם את הנפח ל-1 ליטר על ידי הוספת מים סטריליים. התאם את ה-pH הסופי של מאגר 1 L 50x TAE ל-8.5. כדי ליצור את מאגר העבודה 1x TAE, הוסף 49 חלקים של מים סטריליים לחלק אחד של מאגר ה-50x TAE.
4. צבעו את הג'לים ב-0.5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד ובדקו אותם ויזואלית על ידי הפיכתם לגלויים על גבי משדר UV.
5. על מנת לבחון את הקשר הפילוגנטי בין מבודדי חומר ריקבון שורש וכתר, השג את רצפי הבסיס של הגן ITS על ידי PCR, שסונתזו באופן דו-כיווני (5'-3' ו-3'-5') באמצעות ספק. השווה את רצפי הבסיס עם נתוני הגנים מאתר NCBI (המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי) ורצפי הבסיס של גן ה-ITS של מבודדי Fusarium אחרים בעולם באמצעות תוכנית Blast. השתמש בזה כדי לזהות את המבודדים ברמת המין כמתואר להלן.
   1. עבור אל אתר האינטרנט https://www.ncbi.nlm.nih.gov. לחץ על הכרטיסייה BLAST בקטע משאבים פופולריים.
   2. לחץ על הכרטיסייה פיצוץ נוקלאוטיד בחלון החדש. בקטע הזן רצף שאילתות בחלון החדש, הזן את רצפי הבסיס בפורמט Fasta וכתוב את שם המחקר בסעיף תפקיד.
   3. לאחר מכן, בדוק מסדי נתונים סטנדרטיים (nr וכו') בכרטיסייה מסד נתונים בקטע בחר ערכת חיפוש בתחתית.
   4. בדוק רצפים דומים מאוד (מגה-בלסט) בכרטיסייה אופטימיזציה עבור בקטע בחירת תוכנית ולחץ על הכרטיסייה BLAST בתחתית העמוד.
6. השתמש בתוכנית הניתוח הפילוגנטי MEGA 11 כדי לקבוע את הקשר הפילוגנטי בין מבודדי פוסריום . יישר את רצפי הבסיס באמצעות תוכנית ClustalW וצור את עצי המשפחה הגנטיים של המבודדים בהתאם לחסכון המקסימלי עבור הגן ITS²⁶.
   1. להורדת תוכנת מגה, היכנסו לאתר https://www.megasoftware.net, והתקינו את תוכנת מגה. תוכנת MEGA ניתנת בחינם לשימוש במחקר וחינוך.
   2. תחילה, שמור את הרצפים בשולחן העבודה כקובץ פנקס רשימות (.txt) בפורמט FASTA. הפעל את תוכנת מגה ולחץ על הכרטיסייה ALIGN . לחץ על ערוך/בנה יישור בחלון. לאחר מכן, סמן צור יישור חדש בחלון החדש ולחץ על אישור כדי לאשר.
   3. לחץ על לשונית DNA . מחק את ה- 1. רצף שמופיע אוטומטית בחלון, ועבור אל ערוך קובץ, ולאחר מכן לחץ על הוסף רצף מקובץ הכרטיסייה. פתח את קובץ פנקס הרשימות (.txt) המכיל את הרצפים וממוקם בשולחן העבודה.
   4. בשלב זה, כל הרצפים מופיעים על המסך. ראשית, לחץ על כל רצף שמופיע על המסך, ולאחר מכן סמן את כל הרצפים עם CTRL + A. פתח את יישור file ולחץ על Align by Clustal W משם, ולחץ על אישור כדי להפעיל את התוכנית בהגדרות ברירת המחדל.
   5. לאחר בחינת ההבדלים ביישור הרצפים, עבור לקובץ הנתונים, לחץ על ניתוח פילוגנטי ולאחר מכן לחץ על לא בתיבת הסימון בחלון אם הרצפים מסנתזים חלבונים או לא. הרצפים שלנו אינם מסנתזים חלבונים מכיוון שהם שייכים לאזור ה-ITS.
   6. חזור לחלון הראשי של תוכנת מגה. לחץ על פילוגנטיה ובחר בנה/בדוק עצי חסכון מקסימליים. בחלון החדש, בחר שיטת אתחול עבור מבחן הפילוגניה והזן ערכי אתחול 1,000 כדי לבדוק את חוזק הענף. בכרטיסייה Gaps/Data Treatment (טיפול בנתונים חסרים), בחר Partial Deletion, בחר Subtree-pruning-Regrafting (SPR) כשיטת החיפוש MP ולחץ על OK כדי לאשר את הפעולות.
   7. המתן לתוצאת הניתוח כדי להראות את העץ הפילוגנטי.

5. מבחן פתוגניות

1. השתמש בארבעה מבודדים למחקרי פתוגניות עבור כל מין מייצג ממיני הפוסריום שזוהו בשיטות מולקולריות. בצע מחקרי פתוגניות ב-24 מעלות צלזיוס, 16 שעות של אור פלואורסצנטי/8 שעות אור חושך, עם 65% לחות בחדר ממוזג.
2. זורעים זרעי עדשים בבקבוקוני פלסטיק שחורים עם 45 חורים בקוטר 5 ס"מ. שמור כל בקבוקון בנתרן היפוכלוריט 1% למשך 3 דקות ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים סטריליים פי 3. יבש את הזרעים בארון סטרילי למשך 24 שעות וזרע עם זרע אחד בכל חור.
   הערה: זרעי העדשים מזן Kayı 91, הרגישים למחלה, שימשו בכל בדיקות הפתוגניות⁶. טכניקת טבילת השתילים שימשה כשיטת החיסון²⁷.
3. דגרו תרביות טהורות של כל איזולט ב-PDA ב-24 מעלות צלזיוס למשך 7-10 ימים. מגרדים את המושבות המעובדות מתרבות הציר מפני השטח של המדיום בעזרת מרית ומכינים את תרחיף הנבגים/תפטיר באמצעות מים מזוקקים סטריליים.
4. הסר שאריות גדולות מהתרחיף על ידי סינון דרך בד גבינה בן 4 שכבות והתאם את ריכוז הנבגים/תפטיר ל-1 x 10⁶ נבגים/מ"ל בעזרת המוציטומטר.
5. לאחר שלב זה, עקרו את שורשי השתילים שגדלו בעבר בבקבוקונים כאשר יש להם 2-3 עלים אמיתיים. שוטפים במי ברז ופוצעים מעט שורשים בעזרת מחט סטרילית. טבלו את השתילים הללו בתרחיף הנבגים/תפטיר המוכן למשך 3 דקות ולאחר מכן השתלו אותם בבקבוקוני פלסטיק המכילים תערובת אדמה/כבול סטרילית (2:1; v/v).
6. עבור השתילים המשמשים כבקרות, עקרו את שורשיהם, פצעו אותם ואז שתלו אותם על ידי טבילתם במים סטריליים בלבד. בצע הערכות בדיקת פתוגניות 3 שבועות לאחר תהליך החיסון לפי סולם 0-4.
7. לאחר שערכי חומרת המחלה המחושבים עברו שינוי זווית, הכניסו את הערכים שהתקבלו לניתוח שונות והעריכו את ההבדלים בין הממוצעים על פי מבחן HSD (p = 0.05) של Tukey. חומרת המחלה: מבודדים עם 0%-15% הוערכו כבעלי אלימות נמוכה מאוד (LV), מבודדים עם 16%-35% הוערכו כאלימות נמוכה (LV), מבודדים עם 36%-50% הוערכו כאלימות בינונית (O), מבודדים עם 51%-70% הוערכו כאלימות גבוהה (VV), מבודדים עם 71%-100% הוערכו כאלימות גבוהה מאוד (VV) ומבודדים ללא תסמיני מחלה הוערכו כמבודדים ספרופיטיים או אפיפיטיים.

תוצאות

קביעת פרמטרים של מחלה
בסך הכל נסקרו 83 אזורי זריעת עדשים המכסים תשעה אזורים שונים של יוזגת במונחים של תסמיני מחלת נבול, שורש וריקבון עטרה, המשתרעים על פני שטח של 1.1984 x 10⁶ מ^"ר (טבלה 2). תסמיני מחלת נבילה או ריקבון שורשים נתקלו ב...

Discussion

ידוע כי נבילת פוסריום גורמת לאובדן תשואה כלכלי חמור בחלקים מסוימים של העולם³¹. המחלה דווחה לראשונה בהונגריה³² ומאוחר יותר דווחה במדינות רבות כמו מצרים, הודו, מיאנמר, נפאל, פקיסטן, טורקיה, סוריה וארה"ב³³. Kumar et ^al.34 דיווח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-lactic acid	Merck	100366	Was used as an antibiotic in studies.
2-propanol	Merck	109634	Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)	Eppendorf Research	LB.EP.3123000012	Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)	Eppendorf Research	LB.EP.4924000916	Used to measure small volumes of liquids.
Agar	Merck	110453	For use in making fungal media.
Agarose	Sigma-Aldrich	18300012	For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room	İklimlab		Was used to grow plants under controlled conditions.
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9393	Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balance	Shimadzu ATX224		Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizer	Zealway	GF-120DR	It was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscope	Leica DM750		For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinet	HFsafe Class II A2		To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
Centrifugal	DLAB DM1424	LB.DL.903001124	Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	220551	Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer set	Sigma-Aldrich	Z165220	It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slide	ISOLAB	075.01.006 / 075.02.005	Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrate	Merck	108342	For use in making fungal media.
DFC450 with digital camera	Leica		Digital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope	Leica	MIC5246	Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresis	thermo fisher scientific	B2-UVT
Dna gel loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611	For use in molecular diagnostics.
dNTP mix	Thermo Scientific	R0192	Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)	Thermo Scientific	K1082	For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatule	ISOLAB	082.03.001	It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta	Thermo Scientific	17892	For use in molecular diagnostics.
Ethanol	Merck	100983	Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758	Used in molecular studies.
Filter paper	ISOLAB	107.58.158	Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinet	ZHICHENG ZXDS-A-1090		For use in incubation processes.
Fume hood	Elektromag EM1201	LB.EM.EM1201	It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging system	Syngene G:BOX Chemi XX6		For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladder	Thermo Scientific	SM0372	For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acid	Merck	1005706	Used in molecular studies.
Glycerol	Merck	104094	For use in stock culture of fungi.
Lancet	ISOLAB	048.50.002	Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	814733	Used in molecular studies.
Measuring tape	ISOLAB	016.07.500	Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubes	ISOLAB	0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003	Used to store different volumes of liquids.
PCR tube	ISOLAB	123.01.002	It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishes	ISOLAB	120.13.090	For use in growing fungus culture.
Pipette tips	ISOLAB	005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004	To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bag	ISOLAB	039.30.005	Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic pot	ToXA		Was used for growing plants.
Pliers, clamps	ISOLAB	048.08.130	It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortar	ISOLAB	038.02.150	Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agar	Condalab	1022	For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water system	human CORPORATION	LT.HC.NHP009	Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)	Vestel		For use in the storage of stock materials.
Rifampicin	Sigma-Aldrich	557303	Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetate	Merck	106268	Used in molecular studies.
Sodium chloride	Merck	1064041000	Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143	Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solution	Merck	105614	Used for surface disinfection.
Spatula	ISOLAB	047.33.210	It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomycın sulfate	BioShop Canada	STP101	To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pure	Tekkim	TK.200650	For use as a disinfectant in all stages of work.
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T3258	Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCR	Bio‐Rad T100		For use in genomic analyses.
Thoma lam	ISOLAB	075.03.002	For use in spore counting.
Tris HCL	Roche	10812846001	Used in molecular studies.
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Used in molecular studies.
Tween 80	Merck	822187	For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteks	Velp WIZARD	LB.VLP.F202A0175	Used to mix substances in liquid volumes.
Water baths	Memmert WNB 22	1018-5702	It was used during incubation in dna extraction studies.