Dépistage de la présence de fusariose et de pourriture des racines dans les champs de lentilles en Türkiye sous climat terrestre

Résumé

Une étude menée dans la province de Yozgat a révélé que des facteurs biotiques, tels que les maladies fongiques comme le flétrissement et la pourriture des racines, limitent la production de lentilles. Des isolats de Fusarium ont été trouvés dans 95,4 % des échantillons, ce qui suggère des relevés locaux périodiques et une surveillance régulière pour le développement de technologies durables et des stratégies de lutte efficaces.

Résumé

La lentille est une légumineuse autogame importante. Sa production est limitée par divers facteurs biotiques, en particulier les agents fongiques à l’origine du flétrissement et de la pourriture des racines. L’étude visait à comprendre l’épidémiologie et l’étiologie régionales des agents fongiques phytopathogènes afin d’élaborer des stratégies de lutte contre Fusarium spp. Cette étude a porté sur 83 sites de semis de lentilles dans la province de Yozgat pour les maladies du flétrissement, de la pourriture des racines et du collet causées par des espèces communes de Fusarium en 2022 et 2023. Des plants de lentilles symptomatiques ont été prélevés pour l’isolement et l’identification des champignons. Les isolats de Fusarium ont été regroupés en fonction de la morphologie de la colonie et cultivés sur un milieu PDA. De plus, les ADN génomiques obtenus à partir d’isolats de Fusarium ont été analysés par PCR et comparés à d’autres isolats de Fusarium enregistrés dans le NCBI GenBank. Les relations génétiques entre les isolats de Fusarium ont été déterminées à l’aide de la méthode de parcimonie maximale (MP) dans le programme Mega 11. Les résultats, l’incidence moyenne et le taux de gravité des maladies du flétrissement et de la pourriture des racines dans la province de Yozgat ont été déterminés à 16,9 % et 38,6 %, respectivement. Des isolats de Fusarium ont été trouvés dans 95,4 % des échantillons. Il y avait une homogénéité de la séquence nucléotidique de 99,5 % à 100 % entre les isolats de F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum et F. solani , et l’espèce la plus isolée était F. oxysporum. Le dendrogramme MP des isolats de Fusarium a été divisé en deux branches principales, la première branche comprenant tous les isolats de F. solani . La deuxième branche principale comprenait d’autres espèces de Fusarium isolées dans la présente étude et dans NCBI GenBank. L’étude suggère des relevés locaux périodiques pour déterminer la fréquence de la fusariose pour la répression chez les lentilles. Il est fortement suggéré de supprimer en temps opportun les dommages causés par le Fusarium afin de contrôler la maladie et de conserver le système de production de lentilles.

Introduction

La lentille (Lens culinaris Medik.), une petite légumineuse comestible appartenant à la famille des Fabacées, est une culture autogame de saison fraîche avec des feuilles en forme d’aiguilles et des fleurs blanches à violet pâle ou violet foncé¹. Il a été domestiqué par l’homme il y a environ 10 000 ans dans la partie mésopotamienne du Croissant fertile et s’est rapidement répandu dans le Nouveau Monde, y compris le bassin méditerranéen et l’Asie centrale, et plus tard, il a été naturalisé dans les Amériques². La superficie mondiale de culture de lentilles est d’environ 5,5 millions d’hectares avec une production de 6,6 millions de^tonnes3. La Türkiye se classe au 4e^{rang pour} la production de lentilles après le Canada, l’Inde et l’Australie. La culture des lentilles en Turquie est très importante et représente 6,7 % de la production mondiale. La production totale de lentilles de la Turquie est de 474 000 tonnes et est produite dans au moins 40 provinces⁴. Environ 89,5 % de la production de lentilles de la Turquie est constituée de lentilles rouges et vertes, qui constituent 10,5 % de la récolte d’hiver dans la région de l’Anatolie du Sud-Est. Le reste de la récolte est cultivé comme des cultures d’été. Les provinces de Yozgat (39,5 %), Konya (23,7 %), Kırşehir (16,3 %), Çorum (7,6 %) et Ankara (2,9 %) contribuent largement à la production de lentilles vertes⁴. La production de lentilles peut être limitée par des facteurs de stress biotiques et abiotiques. Le gel et la sécheresse sont les facteurs de stress abiotique les plus courants dans la production de lentilles vertes d’été⁵. Les maladies fongiques telles que le flétrissement, la pourriture des racines et du collet causées par Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium et les espèces Fusarium sont les maladies fongiques les plus importantes, qui provoquent une combinaison de maladies, notamment la fonte des semis, le flétrissement des plantules, le flétrissement et la pourriture des racines, en fonction du moment de l’infection, de la sensibilité de l’hôte et des conditions météorologiques ^{6,7, 8}. Épisode 8

Fusarium est un champignon filamenteux imparfait que l’on trouve dans le sol, les plantes et les substrats organiques et est un genre cosmopolite parmi ces agents pathogènes⁹. Il provoque diverses maladies telles que la fusariose, la pourriture des racines et du collet, ainsi que la fusariose de l’épi du blé, la fusariose des cucurbitacées et la pourriture des racines dans la plupart des légumineuses, y compris les lentilles 10,11,12. Le flétrissement vasculaire, la pourriture des racines et du collet causée par Fusarium spp. est la maladie la plus importante des lentilles dans de nombreuses zones de culture de lentilles à l’échelle mondiale¹⁰. Fusarium oxysporum est l’espèce de Fusarium la plus commune associée au flétrissement, à la pourriture des racines et du collet des racines chez les lentilles. À l’échelle mondiale, le flétrissement, les maladies des racines et de la pourriture du collet sont causés par F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani et F. verticillioides dans les zones de plantation de lentilles⁷. Le flétrissement, la pourriture des racines et du collet causée par Fusarium spp. surviennent aux stades des plantules et des adultes et provoquent un flétrissement soudain, un dessèchement et éventuellement la mort des feuilles. Les symptômes de la maladie comprennent la pourriture des graines, la pourriture des racines, le flétrissement des folioles supérieures, le rabougrissement, le rétrécissement et l’enroulement des feuilles. Aux stades moyens et tardifs de remplissage des gousses, les graines sont généralement rétrécies et les symptômes racinaires comprennent un retard de croissance, une décoloration brune, des pointes de racine pivotante endommagées et une prolifération de racines secondaires. La décoloration du tissu vasculaire peut ne pas être observée dans tous les cas¹³.

Dans la région de l’Anatolie centrale, un nombre limité d’études ont été menées sur l’état des maladies du flétrissement et de la pourriture des racines chez les lentilles. Yozgat a un climat doux et modéré avec des précipitations abondantes en hiver par rapport à l’été et est classé comme Dsb (climat terrestre chaud et humide) par Köppen et Geiger¹⁴. La température moyenne est de 9,6 °C avec des précipitations moyennes de 512 mm. Yozgat est situé dans l’hémisphère nord. L’été a lieu en juin, juillet, août et septembre. Il est très important d’avoir des informations sur l’épidémiologie et l’étiologie régionales des agents fongiques phytopathogènes qui causent la maladie pour élaborer différentes stratégies de lutte contre Fusarium spp. transmise par le sol, afin de contrôler la maladie¹⁵. Dans ce contexte, les objectifs de la présente étude sont de déterminer et d’identifier les paramètres pathologiques (prévalence, incidence et gravité de la maladie) des maladies du flétrissement, de la pourriture des racines et de la pourriture du collet chez les lentilles en menant une enquête dans la province de Yozgat, où environ 40 % de la production totale de lentilles vertes est réalisée individuellement, le pathogène Fusarium espèces qui causent le flétrissement et la pourriture des racines chez les lentilles par des analyses morphologiques et moléculaires, et pour déterminer les niveaux de virulence individuels des espèces Fusarium en effectuant des tests de pathogénicité.

Protocole

REMARQUE : Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Étude sur le terrain, échantillonnage et isolement fongique

REMARQUE : Des travaux d’enquête ont été réalisés en 2022 et 2023, selon Endes¹⁶. Au total, 83 zones de plantation de lentilles couvrant neuf districts de la province de Yozgat ont été observées pour le flétrissement, la pourriture des racines et la pourriture du collet (figure 1).

1. Choisissez des champs de lentilles de plus de 1000 m² comme zone d’échantillonnage. Prélevez chaque échantillon en marchant au hasard de la bordure au centre ou au milieu du champ en zigzags le long des diagonales à l’aide d’un cadre de 1 m² , en le plaçant au hasard à un minimum de trois points différents choisis au hasard. Prélever les plants de lentilles présentant des symptômes de maladie à chaque point, les mettre dans des sacs en papier et les transférer au laboratoire pour les utiliser dans des études d’isolement et d’identification fongiques.
   REMARQUE : Les racines et les collets des plants de lentilles malades transférés au laboratoire ont d’abord été lavés à l’eau du robinet pour éliminer les résidus grossiers ; plus tard, ils ont été soumis à une désinfection de surface pour l’isolement des agents pathogènes fongiques tels que décrits par Endes¹⁶.
2. Faites tremper les tissus végétaux malades dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 à 15 s, puis rincez 3 fois pendant 3 minutes chacun dans de l’eau stérile. Maintenez-les tous dans de l’hypochlorite de sodium à 1 % (NaOCl) pendant 5 minutes et rincez-les 3 fois pendant 5 minutes chacun à l’eau stérile.
3. Séchez les tissus végétaux humides sur des papiers filtres dans une armoire stérile pour terminer le processus de désinfection des surfaces. Ensuite, coupez les tissus végétaux désinfectés en morceaux de 5 à 10 mm de long et placez 4 à 5 morceaux sur un milieu PDA contenant 0,01 % de streptomycine dans des boîtes de Pétri (90 mm de diamètre). Mettez les boîtes de Pétri dans un incubateur à l’obscurité à 25 ± 1 °C pendant 4 à 7 jours et observez la croissance fongique.
   REMARQUE : Les isolats fongiques en développement ont été purifiés par la méthode d’isolement d’une seule spore. À cette fin, l’étude menée par Choi et ^al.17 sur l’obtention de cultures de spores uniques de champignons appartenant aux Ascomycètes, aux Basidiomycètes, aux Coelomycètes et aux Hyphomycètes a été modifiée et utilisée comme décrit ci-dessous.
4. Pour purifier les isolats fongiques, conserver les isolats fongiques obtenus à la fin des études d’isolement dans un incubateur à 25 ± 1 °C pendant 12 h de lumière fluorescente / 12 h d’obscurité pendant 15 jours pour favoriser la formation de structures de reproduction anamorphiques sur PDA.
5. Pesez environ 100 mg de mycélium champignonique provenant de cultures âgées de 15 jours à l’aide d’une spatule, transférez-le dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml, puis broyez-le soigneusement avec des pilons en plastique stériles pour l’homogénéisation.
6. Ajouter 1 mL d’eau stérile et agiter pendant 1 min pour assurer le transfert des spores dans l’eau. Pour ajuster le nombre de spores transférées dans l’eau, prélevez 20 μL de ce mélange à l’aide d’une pipette et vérifiez le nombre de spores sous un grossissement de 10x au microscope optique.
7. Lorsque la quantité de spores est supérieure à la quantité souhaitée, diluez le mélange spore-eau dans des proportions telles que 1/10, 1/100 et 1/1000. Fournir un mélange contenant 4 à 6 spores dans le champ de vision du microscope.
8. Prélever 100 μL de la suspension de spores préparée et la transférer dans des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre contenant un milieu PDA complété par 0,1 % de streptomycine. Ensuite, étalez la suspension transférée sur le PDA à l’aide d’une spatule Drigalski.
9. Incuber les boîtes de Pétri préparées dans l’obscurité à 25 ± 1 °C pendant 12 à 24 h. À la fin de cette période, transférez de petits morceaux d’hyphes développés à partir d’un seul conidie avec une boucle d’inoculation dans une nouvelle boîte de Pétri contenant un milieu de PDA. Chaque culture obtenue à partir de chaque spore est une culture de spores unique. Stockez-les pour les utiliser dans les tests de pathogénicité et l’identification morphologique et moléculaire.
   REMARQUE : L’objectif principal est de maintenir les isolats fongiques en vie pendant une longue période sans modifier leur morphologie, leur génétique et leur virulence. Le processus de stockage a été effectué à l’aide de deux méthodes différentes^18,19. Toutes les méthodes de stockage utilisées dans cette étude sont expliquées en détail ci-dessous.
   1. La première méthode de stockage des échantillons est la suivante. Cultiver des isolats fongiques sur un milieu PDA à 25 ± 1 °C avec une obscurité de 12:12 h : lumière pendant 15 jours pour obtenir des disques de mycélium de 4 mm de diamètre qui peuvent être stockés dans de l’eau stérile.
   2. Coupez des disques de mycélium (4 mm de diamètre, 10 disques) avec un foreur de liège à partir de cultures fongiques qui ont poussé dans les conditions susmentionnées. Transférez les disques de mycélium dans des tubes de microcentrifugation contenant 1 mL d’eau stérile. Conservez les échantillons dans des tubes de microcentrifugation au réfrigérateur à -20 °C pendant 6 mois.
   3. La deuxième méthode de stockage des échantillons est la suivante. Tout d’abord, prélevez une pincée du disque fongique pur des cultures de spores uniques obtenues avec une boucle d’inoculation et transférez-la dans des boîtes de Pétri contenant de la PDA complétée par du chloramphénicol, de l’acide lactique, de l’ampicilline, de la rifampicine, de la tétracycline, de la streptomycine, etc.
   4. Cultiver pendant 5 à 10 jours avant le processus de stockage à 25 ± 1 °C avec une condition de 12 h : 12 h sombre : claire. Coupez et stérilisez des papiers-filtres à usage général de 1 cm x 1 cm dans un autoclave à 121 °C, 15 psi pendant 60 min.
   5. Placez les papiers filtres dans de nouvelles boîtes de Pétri avec le même milieu ou un milieu sélectif. Coupez les colonies/spores d’une culture fongique pure et placez-les sur le dessus de chaque morceau.
   6. Fermez les boîtes de Pétri et placez-les dans un incubateur dans des conditions de croissance appropriées (comme mentionné ci-dessus). Les isolats fongiques se développent lentement sur du papier filtre. Incuber pendant environ 15 jours pour assurer une colonisation complète.
   7. Après la sporulation ou la formation complète de la colonie sur des papiers filtres, transférez les morceaux de papier individuels dans une nouvelle boîte de Pétri sans milieu de culture. Plus tard, mettez les boîtes de Pétri dans l’incubateur jusqu’à ce que le papier filtre et le champignon soient complètement secs (environ 20-30 jours).
   8. Après séchage, mettez 10 morceaux de papier filtre dans chaque enveloppe en papier stérile, étiquetez chaque enveloppe, mettez ces enveloppes dans des sacs en plastique et conservez les sacs en plastique contenant les enveloppes dans un récipient en plastique transparent à -20 °C.
10. Calculez le taux de prévalence de la flétrissure de la lentille, de la pourriture des racines et de la pourriture du collet à Yozgat selon la formule donnée ci-dessous, en tenant compte de la prévalence de la maladie dans chaque champ de lentilles, suivie du nom du district de la province.
    Taux de prévalence de la maladie ( %) = (a / b) x 100
    où a indique le nombre de champs malades ; b indique le nombre total de champs étudiés dans un district.
11. Calculer l’incidence de la maladie selon la méthode de la moyenne pondérée rapportée par Bora et Karaca²⁰. Comptez les plantes dans chaque carré du champ. Séparez-les en plantes malades et non malades dans chaque carré et calculez la prévalence de la maladie selon la formule donnée ci-dessous.
    Taux de prévalence de la maladie ( %) = (x / y) x 100
    où x indique le nombre de plantes malades ; y indique le nombre total d’individus inventoriés.
12. Calculer la gravité de la maladie selon l’échelle 0-4 d’Öğüt²¹, où 0 = ne présentait aucun symptôme, 1 = symptômes légers chez 25 % des feuilles ; 2 = symptômes modérés chez 26 à 50 % des feuilles ; 3 = chlorose sévère et flétrissement dans 51 à 75 % des feuilles ; et 4 = chlorose très sévère et symptômes de flétrissement ou de dessèchement, de mue, de retard de croissance ou de feuilles mortes sur plus de 75 % des plantes dans le même ordre (figure 2).
13. Calculer la gravité de la maladie à l’aide de la formule suivante avec les valeurs d’échelle obtenues¹⁶.
    Gravité de la maladie ( %) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    où ni nombre de plantes dans la valeur d’échelle ; vi valeur de l’échelle ; V valeur d’échelle la plus élevée ; N nombre total de plantes observées ; i indique le nombre de classes.

2. Données météorologiques

1. Réaliser des études d’enquête. Pour ce protocole, des enquêtes ont été menées au cours des périodes de mai et juin 2022 et 2023. Obtenez les valeurs de température, d’humidité relative et de précipitations totales pour la période mars-juillet en 2022, 2023 et les longues années auprès de la Direction de la météorologie provinciale de Yozgat (tableau 1).

3. Identification morphologique

1. Comparer les caractéristiques culturelles (couleur de la colonie, mycélium aérien, taux de croissance du mycélium) et conidieuses (dimensions des isolats de Fusarium, forme, couleur et nombre de septum) des isolats de Fusarium à celles d’études antérieures et identifier provisoirement les espèces fongiques.
2. Sélectionner des échantillons représentatifs dans les groupes à utiliser pour l’identification morphologique. Purifiez ces échantillons selon la méthode d’isolement des spores uniques mentionnée ci-dessus. Au cours de cette période, observez les caractéristiques de pigmentation des colonies d’isolats de Fusarium ainsi que les structures des micro/macroconidies et des chlamydospores.
3. Pour favoriser la formation de structures micromorphologiques telles que les micro/macroconidies et les chlamydospores dans les cultures fongiques pures obtenues, incuber sur PDA à 25 ± 1 °C et 12 h : 12 h sombre : lumière pendant 25-30 jours dans un incubateur. Mesurer la longueur et la largeur des conidies de chaque isolat de Fusarium par microscopie optique. De plus, documentez la structure, la forme, la couleur et les septa ou non des conidies à l’aide d’un microscope optique fourni avec un appareil photo numérique.
4. À la lumière des observations ci-dessus, regrouper les isolats de Fusarium selon le niveau de l’espèce, tel que décrit dans Leslie et Suerell²².

4. Identification moléculaire

REMARQUE : L’ADN génomique total des isolats de Fusarium a été extrait à l’aide de la méthode suivante, qui a été légèrement modifiée par rapport au protocole de Cenis²³. Les analyses PCR et l’électrophorèse des isolats de Fusarium ont été réalisées selon le protocole décrit par Aras et Endes²⁴.

1. Extraction d’ADN génomique fongique
   1. À partir d’une culture fraîche (âgée de 10 jours) d’isolats de Fusarium cultivés sur PCA, grattez 100 mg de mycélium à l’aide d’un scalpel stérile, puis transférez-le dans un tube de microcentrifugation de 2 ml. Incuber les tubes à -20 °C pendant la nuit.
   2. Après une nuit d’incubation, ajoutez 500 μL de tampon d’extraction d’ADN (200 mM Tris-HCl pH : 8,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 % de dodécylsulfate de sodium) dans les tubes et écrasez-les avec un pilon en plastique stérile.
   3. Par la suite, ajouter 150 μL d’acétate de sodium 3M (NaOAc) pH 5,2 dans les tubes et incuber à -20 °C pendant 30 min. Après cette étape, centrifugez les tubes à 4 000 x g pendant 10 min.
   4. Après la centrifugation, transférez 400 μL du surnageant situé dans la partie supérieure du tube dans de nouveaux tubes (1,5 mL) et ajoutez un volume égal d’isopropanol (2-propanol). Incuber les nouveaux tubes à -20 °C pendant 30 min. Pendant ce temps, mélangez doucement les tubes 5x ou 6x.
   5. Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min pour précipiter l’ADN génomique et jeter tout le liquide restant dans les tubes.
   6. Ajoutez 1 ml d’éthanol à 70 % à la pastille d’ADN génomique sous la forme d’un sédiment blanc ou crème au fond du tube. Mélangez doucement le tube de haut en bas 4x-5x pendant environ 1 min, en jetant tout l’éthanol dans les tubes. Ensuite, ouvrez les tubes en flux d’air laminaire pendant 30 min pour évaporer complètement l’éthanol sur la pastille d’ADN.
   7. Pour dissoudre l’ADN génomique et le stocker pendant une longue période, ajoutez 50 μL de solution tampon TE (1M Tris-HCl pH : 8,0 ; 0,5M EDTA pH 8,0) dans les tubes et incubez les tubes dans un bain-marie à 65 °C pendant 1 h. Pendant ce temps, mélangez doucement le tube de haut en bas 8x-10x. Conservez l’ADN génomique dissous dans une solution tampon TE dans un congélateur à -20 °C pour l’utiliser dans des études moléculaires.
2. Pour les études PCR, utilisez les amorces oligonucléotidiques ITS5 F (5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') pour amplifier la région ITS de l’ADNr²⁵. Effectuez chaque réaction PCR avec 2,5 μL de tampon PCR 10x, 2,5 μL de MgCl₂ (25 mM), 2,5 μL de dNTP (2 mM), 0,5 μL de chaque amorce (10 μM), 2 μL d’ADN matrice, 0,5 μL d’ADN polymérase Taq (1 U/μL, Fermantas) et 14 μL de sQH2O dans un volume total de 25 μL.
3. Pour la réaction PCR de 25 μL, exécutez le programme PCR suivant à 95 °C pendant 2 min (dénaturation initiale), suivi de 40 cycles ; 95 °C pendant 30 s (dénaturation), 55 °C pendant 45 s (recuit), 72 °C pendant 90 s (extension) et 72 °C pendant 5 min (extension finale). Produits PCR par électrophorèse pendant 1,5 h à 90 V dans un gel d’agarose à 1,5 % préparé dans une solution tampon 1x TAE (Tris Base - Glacial Acetic Acid - EDTA).
   1. Pour préparer le tampon TAE pour l’électrophorèse sur gel, dissoudre 242 g de base Tris dans 700 mL d’eau stérile ; ajouter les 57,1 mL d’acide acétique glacial ; ajouter 100 mL de solution d’EDTA 0,5 M et ajuster le volume à 1 L en ajoutant de l’eau stérile. Ajustez le pH final du tampon TAE de 1 L 50x à 8,5. Pour fabriquer le tampon de travail 1x TAE, ajoutez 49 parties d’eau stérile à 1 partie du tampon 50x TAE.
4. Teindre les gels avec 0,5 μg/mL de bromure d’éthidium et les inspecter visuellement en les rendant visibles sur un transilluminateur UV.
5. Afin d’examiner la relation phylogénétique entre les isolats de l’agent de pourriture racinaire et du collet, obtenir les séquences de base du gène ITS par PCR, qui ont été synthétisées de manière bidirectionnelle (5'-3' et 3'-5') par l’intermédiaire d’un fournisseur. Comparez les séquences de base avec les données génétiques du site Web du NCBI (National Center of Biotechnology Information) et les séquences de base du gène ITS d’autres isolats de Fusarium dans le monde à l’aide du programme Blast. Utilisez-le pour identifier les isolats au niveau de l’espèce, comme décrit ci-dessous.
   1. Rendez-vous sur https://www.ncbi.nlm.nih.gov site web. Cliquez sur l’onglet BLAST dans la section Ressources populaires.
   2. Cliquez sur l’onglet Nucleotide BLAST dans la nouvelle fenêtre. Dans la section Entrer la séquence de requête de la nouvelle fenêtre, entrez les séquences de base au format Fasta et écrivez le nom de l’étude dans la section Titre du poste.
   3. Ensuite, cochez Bases de données standard (nr, etc.) dans l’onglet Base de données de la section Choisir un jeu de recherche en bas.
   4. Cochez Séquences très similaires (mégablast) dans l’onglet Optimiser pour de la section Sélection de programme et cliquez sur l’onglet BLAST en bas de la page.
6. Utilisez le programme d’analyse phylogénétique MEGA 11 pour déterminer la relation phylogénétique entre les isolats de Fusarium . Alignez les séquences de base à l’aide du programme ClustalW et créez les arbres généalogiques génétiques des isolats selon la parcimonie maximale pour le gène ITS²⁶.
   1. Pour télécharger le logiciel Mega, rendez-vous sur le site Web https://www.megasoftware.net et installez le logiciel Mega. Le logiciel MEGA est fourni GRATUITEMENT pour une utilisation dans la recherche et l’éducation.
   2. Tout d’abord, enregistrez les séquences sur le bureau en tant que fichier Bloc-notes (.txt) au format FATA. Exécutez le logiciel Mega et cliquez sur l’onglet ALIGNER . Cliquez sur Modifier/Construire l’alignement dans la fenêtre. Ensuite, cochez la case Créer un nouvel alignement dans la nouvelle fenêtre et cliquez sur OK pour confirmer.
   3. Cliquez sur l’onglet ADN . Supprimez le 1. Séquence qui apparaît automatiquement dans la fenêtre, et allez dans le fichier Editer, puis cliquez sur Insérer une séquence depuis l’onglet Fichier . Ouvrez le fichier du Bloc-notes (.txt) qui contient les séquences et qui se trouve sur le bureau.
   4. À ce stade, toutes les séquences apparaissent à l’écran. Tout d’abord, cliquez sur N’importe quelle séquence qui apparaît à l’écran, puis marquez toutes les séquences avec CTRL + A. Ouvrez le fichier d’alignement et cliquez sur Aligner par Clustal W à partir de là, puis cliquez sur OK pour exécuter le programme dans les paramètres par défaut.
   5. Après avoir examiné les différences dans l’alignement des séquences, allez dans le fichier de données, cliquez sur Analyse phylogénétique puis cliquez sur Non dans la case à cocher de la fenêtre pour savoir si les séquences synthétisent des protéines ou non. Nos séquences ne synthétisent pas de protéines car elles appartiennent à la région ITS.
   6. Retournez à la fenêtre principale du logiciel Mega. Cliquez sur Phylogénie et sélectionnez Construire/Tester un ou plusieurs arbres de parcimonie maximum. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Méthode bootstrap pour le test de phylogénie et entrez les valeurs bootstrap 1 000 pour tester la force de la branche. Dans l’onglet Lacunes/Traitement des données manquantes, sélectionnez Suppression partielle, SPR (Subtree-pruning-Regrafting) comme méthode de recherche MP, puis cliquez sur OK pour confirmer les opérations.
   7. Attendez le résultat de l’analyse pour afficher l’arbre phylogénétique.

5. Test de pathogénicité

1. Utiliser quatre isolats pour les études de pathogénicité de chaque espèce représentative des espèces de Fusarium qui ont été identifiées par des méthodes moléculaires. Effectuer des études de pathogénicité à 24 °C, 16 h de lumière fluorescente / 8 h de photopériode sombre, avec 65 % d’humidité dans une pièce climatisée.
2. Semez les graines de lentilles dans des flacons en plastique noir à 45 trous de 5 cm de diamètre. Conservez chaque flacon dans de l’hypochlorite de sodium à 1 % pendant 3 minutes, puis rincez 3 fois à l’eau distillée stérile. Faites sécher les graines dans une armoire stérile pendant 24 h et semez avec une graine dans chaque trou.
   REMARQUE : Les graines de lentilles de la variété Kayı 91, sensibles à la maladie, ont été utilisées dans tous les essais de pathogénicité⁶. La technique d’immersion des semis a été utilisée comme méthode d’inoculation²⁷.
3. Incuber des cultures pures de chaque isolat dans de la PCA à 24 °C pendant 7 à 10 jours. Grattez les colonies cultivées à partir de la culture mère à la surface du milieu à l’aide d’une spatule et préparez la suspension de spores/mycélium avec de l’eau distillée stérile.
4. Éliminer les gros résidus de la suspension par filtration à travers une étamine à 4 couches et ajuster la concentration de spores/mycélium à 1 x 10⁶ spores/mL à l’aide d’un hémocytomètre.
5. Après cette étape, déracinez les racines des plants précédemment cultivés dans les flacons lorsqu’ils ont 2-3 vraies feuilles. Lavez à l’eau du robinet et blessez légèrement les racines avec une aiguille stérile. Immergez ces plants dans la suspension de spores/mycélium préparée pendant 3 min, puis transplantez-les dans des flacons en plastique contenant un mélange stérile de sol et de tourbe (2:1 ; v/v).
6. Pour les semis utilisés comme témoins, déracinez leurs racines, blessez-les, puis plantez-les en les immergeant uniquement dans de l’eau stérile. Effectuer les évaluations des tests de pathogénicité 3 semaines après le processus d’inoculation selon l’échelle de 0 à 4.
7. Après que les valeurs calculées de gravité de la maladie ont été soumises à la transformation angulaire, soumettez les valeurs obtenues à l’analyse de variance et évaluez les différences entre les moyennes selon le test HSD de Tukey (p = 0,05). Sévérité de la maladie : Les isolats présentant une virulence de 0 à 15 % ont été évalués comme ayant une virulence très faible (VG), les isolats de 16 % à 35 % ont été évalués comme étant de faible virulence (VG), les isolats de 36 % à 50 % ont été évalués comme ayant une virulence modérée (O), les isolats de 51 % à 70 % ont été évalués comme ayant une virulence élevée (VV), les isolats de 71 % à 100 % ont été évalués comme étant de très grande virulence (VV) et les isolats sans symptômes de la maladie ont été évalués comme des isolats saprophytes ou épiphytes.

Résultats

Détermination des paramètres de la maladie
Au total, 83 zones de semis de lentilles couvrant neuf régions différentes de Yozgat ont été évaluées en termes de flétrissement, de racines et de symptômes de la pourriture du collet, s’étendant sur une superficie de 1,1984 x 10⁶ m² (tableau 2). Des symptômes de flétrissement ou de pourriture des racines ont été observés dans tous les c...

Discussion

La fusariose est connue pour causer de graves pertes de rendement économique dans certaines parties du monde³¹. La maladie a été signalée pour la première fois en Hongrie³² et plus tard dans de nombreux pays tels que l’Égypte, l’Inde, le Myanmar, le Népal, le Pakistan, la Turquie, la Syrie et les États-Unis³³. Kumar et ^al.34 ont signalé une large distribution de la flétr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-lactic acid	Merck	100366	Was used as an antibiotic in studies.
2-propanol	Merck	109634	Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)	Eppendorf Research	LB.EP.3123000012	Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)	Eppendorf Research	LB.EP.4924000916	Used to measure small volumes of liquids.
Agar	Merck	110453	For use in making fungal media.
Agarose	Sigma-Aldrich	18300012	For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room	İklimlab		Was used to grow plants under controlled conditions.
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9393	Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balance	Shimadzu ATX224		Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizer	Zealway	GF-120DR	It was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscope	Leica DM750		For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinet	HFsafe Class II A2		To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
Centrifugal	DLAB DM1424	LB.DL.903001124	Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	220551	Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer set	Sigma-Aldrich	Z165220	It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slide	ISOLAB	075.01.006 / 075.02.005	Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrate	Merck	108342	For use in making fungal media.
DFC450 with digital camera	Leica		Digital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope	Leica	MIC5246	Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresis	thermo fisher scientific	B2-UVT
Dna gel loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611	For use in molecular diagnostics.
dNTP mix	Thermo Scientific	R0192	Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)	Thermo Scientific	K1082	For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatule	ISOLAB	082.03.001	It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta	Thermo Scientific	17892	For use in molecular diagnostics.
Ethanol	Merck	100983	Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758	Used in molecular studies.
Filter paper	ISOLAB	107.58.158	Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinet	ZHICHENG ZXDS-A-1090		For use in incubation processes.
Fume hood	Elektromag EM1201	LB.EM.EM1201	It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging system	Syngene G:BOX Chemi XX6		For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladder	Thermo Scientific	SM0372	For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acid	Merck	1005706	Used in molecular studies.
Glycerol	Merck	104094	For use in stock culture of fungi.
Lancet	ISOLAB	048.50.002	Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	814733	Used in molecular studies.
Measuring tape	ISOLAB	016.07.500	Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubes	ISOLAB	0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003	Used to store different volumes of liquids.
PCR tube	ISOLAB	123.01.002	It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishes	ISOLAB	120.13.090	For use in growing fungus culture.
Pipette tips	ISOLAB	005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004	To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bag	ISOLAB	039.30.005	Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic pot	ToXA		Was used for growing plants.
Pliers, clamps	ISOLAB	048.08.130	It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortar	ISOLAB	038.02.150	Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agar	Condalab	1022	For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water system	human CORPORATION	LT.HC.NHP009	Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)	Vestel		For use in the storage of stock materials.
Rifampicin	Sigma-Aldrich	557303	Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetate	Merck	106268	Used in molecular studies.
Sodium chloride	Merck	1064041000	Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143	Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solution	Merck	105614	Used for surface disinfection.
Spatula	ISOLAB	047.33.210	It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomycın sulfate	BioShop Canada	STP101	To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pure	Tekkim	TK.200650	For use as a disinfectant in all stages of work.
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T3258	Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCR	Bio‐Rad T100		For use in genomic analyses.
Thoma lam	ISOLAB	075.03.002	For use in spore counting.
Tris HCL	Roche	10812846001	Used in molecular studies.
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Used in molecular studies.
Tween 80	Merck	822187	For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteks	Velp WIZARD	LB.VLP.F202A0175	Used to mix substances in liquid volumes.
Water baths	Memmert WNB 22	1018-5702	It was used during incubation in dna extraction studies.