Screening dei campi di lenticchie per la presenza di Fusarium appassimento e marciume radicale in Turchia in clima terrestre

Riepilogo

Uno studio nella provincia di Yozgat ha scoperto che i fattori biotici, come le malattie fungine come l'avvizzimento e il marciume radicale, limitano la produzione di lenticchie. Gli isolati di Fusarium sono stati trovati nel 95,4% dei campioni, suggerendo indagini locali periodiche e un monitoraggio regolare per lo sviluppo di tecnologie sostenibili e strategie di controllo efficaci.

Abstract

La lenticchia è un'importante pianta di leguminose autoimpollinate. La sua produzione è limitata da vari fattori biotici, in particolare dagli agenti fungini che causano il complesso di appassimento e marciume radicale. Lo studio mirava a comprendere l'epidemiologia e l'eziologia regionale degli agenti fungini fitopatogeni per sviluppare strategie di controllo contro Fusarium spp. Questo studio ha esaminato 83 località di semina di lenticchie nella provincia di Yozgat per le malattie da appassimento, marciume radicale e della corona causate da specie comuni di Fusarium durante il 2022 e il 2023. Le piante di lenticchie sintomatiche sono state raccolte per l'isolamento e l'identificazione dei funghi. Gli isolati di Fusarium sono stati raggruppati in base alla morfologia della colonia e coltivati su terreno PDA. Inoltre, il DNA genomico ottenuto da isolati di Fusarium è stato analizzato mediante PCR e confrontato con altri isolati di Fusarium registrati nella NCBI GenBank. Le relazioni genetiche tra gli isolati di Fusarium sono state determinate utilizzando il metodo della massima parsimonia (MP) nel programma Mega 11. I risultati, l'incidenza media e il tasso di gravità della malattia delle malattie da avvizzimento e marciume radicale nella provincia di Yozgat sono stati determinati rispettivamente al 16,9% e al 38,6%. Gli isolati di Fusarium sono stati trovati nel 95,4% dei campioni. C'era un'omogeneità di sequenza nucleotidica dal 99,5% al 100% tra gli isolati di F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum e F. solani, e la specie più isolata era F. oxysporum. Il dendrogramma MP degli isolati di Fusarium è stato diviso in due rami principali, il primo ramo comprendeva tutti gli isolati di F. solani. Il secondo ramo principale comprendeva altre specie di Fusarium isolate nel presente studio e in NCBI GenBank. Lo studio suggerisce indagini locali periodiche per determinare la frequenza dell'appassimento del Fusarium per la soppressione nelle lenticchie. La soppressione tempestiva dei danni a base di Fusarium è fortemente consigliata per controllare la malattia e conservare il sistema di produzione delle lenticchie.

Introduzione

La lenticchia (Lens culinaris Medik.), un piccolo legume commestibile appartenente alla famiglia delle Fabaceae, è una coltura autoimpollinante, di stagione fresca, con foglie aghiformi e fiori da bianchi a viola pallido o viola scuro¹. È stato addomesticato dall'uomo circa 10.000 anni fa nella parte mesopotamica della Mezzaluna Fertile e si è rapidamente diffuso nel Nuovo Mondo, compreso il bacino del Mediterraneo e l'Asia centrale, e successivamente è stato naturalizzato nelle Americhe². L'area di coltivazione mondiale delle lenticchie è di circa 5,5 milioni di ettari con una produzione di 6,6 milioni di tonnellate³. La Turchia è al 4°^posto nella produzione di lenticchie dopo Canada, India e Australia. La coltivazione delle lenticchie in Turchia è molto importante e rappresenta il 6,7% della produzione mondiale. La produzione totale di lenticchie della Turchia è di 474.000 tonnellate ed è prodotta in almeno 40^province. Circa l'89,5% della produzione di lenticchie della Turchia è costituita da lenticchie rosse e verdi, che costituiscono il 10,5% del raccolto invernale nella regione dell'Anatolia sud-orientale. Il resto del raccolto viene coltivato come colture estive. Le province di Yozgat (39,5%), Konya (23,7%), Kırşehir (16,3%), Çorum (7,6%) e Ankara (2,9%) contribuiscono in gran parte alla produzione di lenticchie verdi⁴. La produzione di lenticchie può essere limitata da fattori di stress biotici e abiotici. Il gelo e la siccità sono i fattori di stress abiotico più comuni nella produzione estiva di lenticchie verdi⁵. Le malattie fungine come il complesso di marciume dell'avvizzimento, delle radici e della corona causate dalle specie Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium e Fusarium sono le malattie fungine più importanti, che causano una combinazione di malattie tra cui lo smorzamento, la peronospora della piantina, l'avvizzimento e il marciume radicale, a seconda dei tempi dell'infezione, della suscettibilità dell'ospite e delle condizioni meteorologiche ^{6,7, 8}.

Fusarium è un fungo filamentoso imperfetto che si trova nel suolo, nelle piante e nei substrati organici ed è un genere cosmopolita tra questi patogeni⁹. Provoca varie malattie come l'appassimento del Fusarium, il marciume delle radici e del colletto delle radici, così come la peronospora del Fusarium nel grano, l'appassimento del Fusarium nelle cucurbitacee e il marciume radicale nella maggior parte dei legumi, comprese le lenticchie 10,11,12. L'avvizzimento vascolare, il marciume delle radici e del colletto delle radici causato da Fusarium spp. è la malattia più importante delle lenticchie in molte aree di coltivazione delle lenticchie a livello globale¹⁰. Fusarium oxysporum è la specie di Fusarium più comune associata al marciume dell'appassimento, della radice e del colletto delle radici nelle lenticchie. A livello globale, le malattie da appassimento, radici e marciume della corona sono causate da F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani e F. verticillioides nelle aree di piantagione di lenticchie⁷. Le malattie dell'avvizzimento, delle radici e del marciume della corona causate da Fusarium spp. si verificano sia nella fase di piantina che in quella adulta e causano appassimento improvviso, essiccazione e morte finale delle foglie. I sintomi della malattia includono marciume dei semi, marciume radicale, appassimento delle foglioline superiori, arresto della crescita, restringimento e arricciamento delle foglie. Nelle fasi intermedie e tardive di riempimento del baccello, i semi vengono solitamente rimpiccioliti e i sintomi delle radici includono crescita stentata, scolorimento marrone, punte dei fittoni danneggiate e proliferazione di radici secondarie. Lo scolorimento del tessuto vascolare può non essere visibile in tutti i casi¹³.

Nella regione dell'Anatolia centrale, gli studi sullo stato delle malattie dell'avvizzimento e del marciume radicale nelle lenticchie sono stati condotti in numero limitato. Yozgat ha un clima mite e moderato con abbondanti precipitazioni in inverno rispetto all'estate ed è classificato come Dsb (Caldo, umido clima terrestre) da Köppen e Geiger¹⁴. La temperatura media è di 9,6 °C con precipitazioni medie di 512 mm. Yozgat si trova nell'emisfero boreale. L'estate si verifica nei mesi di giugno, luglio, agosto e settembre. È molto importante disporre di informazioni sull'epidemiologia regionale e sull'eziologia degli agenti fungini fitopatogeni che causano la malattia per sviluppare diverse strategie di controllo contro Fusarium spp. trasportato nel suolo, per controllare la malattia¹⁵. In questo contesto, gli obiettivi del presente studio sono determinare e identificare i parametri della malattia (prevalenza, incidenza e gravità della malattia) delle malattie da appassimento, radice e marciume della corona nelle lenticchie, conducendo un'indagine nella provincia di Yozgat, dove circa il 40% della produzione totale di lenticchie verdi viene effettuata singolarmente, il Fusarium patogeno specie che causano avvizzimento e marciume radicale nelle lenticchie mediante analisi morfologiche e molecolari, e per determinare i livelli individuali di virulenza della specie Fusarium mediante l'esecuzione di test di patogenicità.

Protocollo

NOTA: I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Indagine sul campo, campionamento e isolamento dei funghi

NOTA: Il lavoro di indagine è stato svolto nel 2022 e nel 2023, secondo Endes¹⁶. Un totale di 83 aree di piantagione di lenticchie che coprono nove distretti nella provincia di Yozgat sono state osservate per la malattia dell'avvizzimento, delle radici e del marciume del colletto delle radici (Figura 1).

1. Selezionare i campi di lenticchie con un'area superiore a 1000 m² come area di campionamento. Raccogli ogni campione camminando casualmente dal bordo al centro o al centro del campo camminando a zigzag lungo le diagonali utilizzando un fotogramma di 1 m² , posizionandolo casualmente in un minimo di tre punti diversi selezionati casualmente. Raccogli le piante di lenticchie che mostrano i sintomi della malattia da ogni punto, mettile in sacchetti di carta e trasferiscile in laboratorio per l'uso negli studi di isolamento e identificazione dei funghi.
   NOTA: Le radici e i colletti delle piante di lenticchie malate trasferite in laboratorio sono stati prima lavati con acqua di rubinetto per eliminare i residui grossolani; successivamente, sono stati sottoposti a disinfezione superficiale per l'isolamento dei patogeni fungini come descritto da Endes¹⁶.
2. Immergere i tessuti vegetali malati in etanolo al 70% per 10-15 secondi, quindi sciacquare 3 volte per 3 minuti ciascuno in acqua sterile. Tenerli tutti in ipoclorito di sodio all'1% (NaOCl) per 5 minuti e risciacquare nuovamente 3 volte per 5 minuti ciascuno con acqua sterile.
3. Asciugare i fazzoletti vegetali bagnati su carta da filtro in un armadio sterile per completare il processo di disinfezione della superficie. Successivamente, tagliare i tessuti vegetali disinfettati in pezzi lunghi 5-10 mm e posizionare 4-5 pezzi su un terreno PDA contenente lo 0,01% di streptomicina all'interno di piastre di Petri (90 mm di diametro). Mettere le piastre di Petri in un'incubatrice al buio a 25 ± 1 °C per 4-7 giorni e osservare la crescita dei funghi.
   NOTA: Gli isolati fungini in via di sviluppo sono stati purificati attraverso il metodo di isolamento a spore singole. A questo scopo, lo studio condotto da Choi et ^al.17 sull'ottenimento di colture di singole spore di funghi appartenenti ad Ascomiceti, Basidiomiceti, Celomiceti e Ifomiceti è stato modificato e utilizzato come descritto di seguito.
4. Per purificare gli isolati fungini, conservare gli isolati fungini ottenuti al termine degli studi di isolamento in un incubatore a 25 ± 1 °C per 12 ore di luce fluorescente / 12 ore di buio per 15 giorni per favorire la formazione di strutture di riproduzione anamorfiche su PDA.
5. Pesare circa 100 mg di micelio fungino da colture di 15 giorni con una spatola, trasferirlo in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 ml e quindi macinarlo accuratamente con pestelli di plastica sterili per l'omogeneizzazione.
6. Aggiungere 1 ml di acqua sterile e agitare per 1 minuto per garantire il trasferimento delle spore nell'acqua. Per regolare il numero di spore che si trasferiscono nell'acqua, prelevare 20 μl di questa miscela con una pipetta e controllare il numero di spore con l'ingrandimento 10x del microscopio ottico.
7. Quando la quantità di spore è superiore alla quantità desiderata, diluire la miscela di spore e acqua in rapporti come 1/10, 1/100 e 1/1000. Fornire una miscela contenente 4-6 spore nel campo visivo del microscopio.
8. Prelevare 100 μl della sospensione di spore preparata e trasferirla in piastre di Petri di 90 mm di diametro contenenti terreno PDA integrato con streptomicina allo 0,1%. Quindi, stendere la sospensione trasferita sul PDA con una spatola Drigalski.
9. Incubare le piastre di Petri preparate al buio a 25 ± 1 °C per 12-24 ore. Al termine di questo periodo, trasferire piccoli pezzi di ife sviluppate da un singolo conidi con un anello di inoculazione in una nuova piastra di Petri contenente terreno PDA. Ogni coltura ottenuta da ogni spora è una singola coltura di spore. Conservarli per essere utilizzati nei test di patogenicità e nell'identificazione morfologica e molecolare.
   NOTA: Lo scopo principale è quello di mantenere in vita gli isolati fungini per lungo tempo senza modificarne la morfologia, la genetica e la virulenza. Il processo di stoccaggio è stato effettuato utilizzando due metodi diversi^18,19. Tutti i metodi di conservazione utilizzati in questo studio sono spiegati in dettaglio di seguito.
   1. Il primo metodo per conservare i campioni è il seguente. Coltivare isolati fungini su terreno PDA a 25 ± 1 °C con un buio: luce di 12:12 h per 15 giorni per ottenere dischi di micelio di 4 mm di diametro che potrebbero essere conservati in acqua sterile.
   2. Tagliare dischi di micelio (diametro 4 mm, 10 dischi) con una piralide da sughero da colture fungine cresciute nelle condizioni sopra menzionate. Trasferire i dischi di micelio in provette da microcentrifuga contenenti 1 mL di acqua sterile. Conservare i campioni in provette da microcentrifuga in frigorifero a -20 °C per 6 mesi.
   3. Il secondo metodo per conservare i campioni è il seguente. In primo luogo, prelevare un pizzico del disco fungino puro dalle singole colture di spore ottenute con un ciclo di inoculazione e trasferirlo in piastre di Petri contenenti PDA integrati con cloramfenicolo, acido lattico, ampicillina, rifampicina, tetraciclina, streptomicina, ecc.
   4. Coltivare per 5-10 giorni prima del processo di conservazione a 25 ± 1 °C con una condizione di buio di 12 ore: 12 ore: luce. Tagliare e sterilizzare la carta da filtro per uso generico da 1 cm x 1 cm in autoclave a 121 °C, 15 psi per 60 min.
   5. Mettere la carta da filtro in nuove piastre di Petri con lo stesso mezzo o con un mezzo selettivo. Taglia le colonie/spore dalla coltura fungina pura e posizionale sopra ogni pezzo.
   6. Sigillare le piastre di Petri e metterle in un'incubatrice in condizioni di crescita adeguate (come menzionato sopra). Gli isolati fungini crescono lentamente sulla carta da filtro. Incubare per circa 15 giorni per garantire la completa colonizzazione.
   7. Dopo la sporulazione o la completa formazione di colonie su carta da filtro, trasferire i singoli pezzi di carta in una nuova capsula di Petri senza terreno di coltura. Successivamente, metti le piastre di Petri nell'incubatrice fino a quando la carta da filtro e il fungo non sono completamente asciutti (circa 20-30 giorni).
   8. Dopo l'asciugatura, mettere 10 pezzi di carta da filtro in ogni busta di carta sterile, etichettare ogni busta, mettere queste buste in sacchetti di plastica e conservare i sacchetti di plastica contenenti le buste in un contenitore di plastica trasparente a -20 °C.
10. Calcola il tasso di prevalenza della malattia dell'appassimento, delle radici e del marciume della corona delle lenticchie a Yozgat secondo la formula riportata di seguito, considerando la prevalenza della malattia in ogni campo di lenticchie, seguita dal nome del distretto della provincia.
    Tasso di prevalenza della malattia (%) = (a / b) x 100
    dove a indica il numero di campi malati; b indica il numero totale di campi rilevati in un distretto.
11. Calcolare l'incidenza della malattia secondo il metodo della media ponderata riportato da Bora e Karaca²⁰. Conta le piante in ogni quadrato del campo. Separali in piante malate e non malate in ogni quadrato e calcola la prevalenza della malattia secondo la formula indicata di seguito.
    Tasso di prevalenza della malattia (%) = (x / a) x 100
    dove x indica il numero di piante malate; y indica il numero totale di piante censite.
12. Calcolare la gravità della malattia secondo la scala 0-4 di Öğüt²¹, dove 0 = non ha mostrato sintomi, 1 = sintomi di livello lieve nel 25% delle foglie; 2 = sintomi di livello moderato nel 26%-50% delle foglie; 3= grave clorosi e appassimento nel 51%-75% delle foglie; e 4 = sintomi di clorosi e avvizzimento molto gravi o essiccazione, caduta, ritardo della crescita o foglie morte su più del 75% delle piante nello stesso ordine (Figura 2).
13. Calcolare la gravità della malattia utilizzando la seguente formula con i valori della scala ottenuti¹⁶.
    Gravità della malattia (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    dove ni numero di piante nel valore di scala; valore della scala vi; V valore di scala più alto; N numero totale di piante osservate; I indica il numero di classi.

2. Dati meteorologici

1. Condurre studi di indagine. Per questo protocollo, le indagini sono state condotte nei periodi di maggio e giugno 2022 e 2023. Ottenere i valori di temperatura, umidità relativa e precipitazioni totali per il periodo marzo-luglio 2022, 2023 e lunghi anni dalla Direzione della meteorologia provinciale di Yozgat (Tabella 1).

3. Identificazione morfologica

1. Confrontate le caratteristiche culturali (colore della colonia, micelio aereo, tasso di crescita dei miceli) e conidiali (dimensioni, forma, colore e numero di setto conidiale) degli isolati di Fusarium con quelle di studi precedenti e identificate provvisoriamente le specie fungine.
2. Selezionare campioni rappresentativi dai gruppi da utilizzare nell'identificazione morfologica. Purificare questi campioni secondo il metodo di isolamento a spore singole, come menzionato sopra. Durante questo periodo, osservare le caratteristiche di pigmentazione delle colonie degli isolati di Fusarium e le strutture di micro/macroconidi e clamidospore.
3. Per favorire la formazione di strutture micromorfologiche quali micro/macroconidi e clamidospore nelle colture fungine pure ottenute, incubare su PDA a 25 ± 1 °C e 12 h: 12 h buio: luce per 25-30 giorni in incubatore. Misurare la lunghezza e la larghezza dei conidi per ogni isolato di Fusarium mediante microscopia ottica. Inoltre, documenta la struttura, la forma, il colore e i setti o senza setti dei conidi utilizzando un microscopio ottico fornito con una fotocamera digitale.
4. Sulla base delle osservazioni di cui sopra, raggruppare gli isolati di Fusarium in base al livello di specie, come descritto in Leslie e Suerell²².

4. Identificazione molecolare

NOTA: Il DNA genomico totale degli isolati di Fusarium è stato estratto utilizzando il seguente metodo, che è stato leggermente modificato rispetto al protocollo del Cenis²³. Le analisi PCR e l'elettroforesi degli isolati di Fusarium sono state eseguite utilizzando il protocollo descritto da Aras ed Endes²⁴.

1. Estrazione del DNA genomico fungino
   1. Da una coltura fresca (di 10 giorni) di isolati di Fusarium coltivati su PDA, raschiare 100 mg di micelio con un bisturi sterile e poi trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 2 mL. Incubare le provette a -20 °C per una notte.
   2. Dopo l'incubazione notturna, aggiungere 500 μL di tampone di estrazione del DNA (200 mM Tris-HCl pH: 8,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% di sodio dodecil solfato) nelle provette e schiacciare con un pestello di plastica sterile.
   3. Successivamente, aggiungere 150 μl di acetato di sodio 3M (NaOAc) pH 5.2 alle provette e incubare a -20 °C per 30 minuti. Al termine di questa fase, centrifugare le provette a 4.000 x g per 10 min.
   4. Dopo la centrifugazione, trasferire 400 μl del surnatante nella parte superiore della provetta in nuove provette (1,5 mL) e aggiungere un volume uguale di isopropanolo (2-propanolo). Incubare le nuove provette a -20 °C per 30 minuti. Durante questo periodo, mescolare delicatamente i tubi 5 o 6 volte.
   5. Centrifugare a 4.000 x g per 10 minuti per precipitare il DNA genomico e scartare tutto il liquido rimasto nelle provette.
   6. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% al pellet di DNA genomico sotto forma di sedimento bianco o color crema sul fondo della provetta. Mescolare delicatamente il tubo su e giù 4x-5x per circa 1 minuto, scartando tutto l'etanolo nei tubi. Quindi, aprire le provette in flusso d'aria laminare per 30 minuti per far evaporare completamente l'etanolo sul pellet di DNA.
   7. Per sciogliere il DNA genomico e conservarlo a lungo, aggiungere 50 μL di soluzione tampone TE (1M Tris-HCl pH: 8,0; 0,5M EDTA pH 8.0) alle provette e incubare le provette in un bagno d'acqua a 65 °C per 1 ora. Durante questo periodo, mescolare delicatamente il tubo su e giù 8x-10x. Conservare il DNA genomico disciolto in una soluzione tampone TE in un congelatore profondo a -20 °C per l'uso negli studi molecolari.
2. Per gli studi di PCR, utilizzare i primer oligonucleotidici ITS5 F (5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') per amplificare la regione ITS dell'rDNA²⁵. Eseguire ogni reazione di PCR con 2,5 μL di tampone PCR 10x, 2,5 μL di MgCl₂ (25 mM), 2,5 μL di dNTP (2 mM), 0,5 μL di ciascun primer (10 μM), 2 μL di DNA stampo, 0,5 μL di Taq DNA polimerasi (1 U/μL, Fermantas) e 14 μL di sQH2O in un volume totale di 25 μL.
3. Per la reazione PCR da 25 μL, eseguire il seguente programma PCR a 95 °C per 2 minuti (denaturazione iniziale), seguito da 40 cicli; 95 °C per 30 s (denaturazione), 55 °C per 45 s (ricottura), 72 °C per 90 s (estensione) e 72 °C per 5 min (estensione finale). Prodotti per PCR elettroforica per 1,5 ore a 90 V in gel di agarosio all'1,5% preparato in 1x soluzione tampone TAE (Tris Base - Acido acetico glaciale - EDTA).
   1. Per preparare il tampone TAE per l'elettroforesi su gel, sciogliere 242 g di base Tris in 700 ml di acqua sterile; aggiungere i 57,1 mL di acido acetico glaciale; aggiungere i 100 ml di soluzione 0,5 M EDTA e regolare il volume a 1 litro aggiungendo acqua sterile. Regolare il pH finale del tampone TAE 50x da 1 L a 8,5. Per realizzare il tampone di lavoro 1x TAE, aggiungere 49 parti di acqua sterile a 1 parte del tampone 50x TAE.
4. Colorare i gel con 0,5 μg/mL di bromuro di etidio e ispezionarli visivamente rendendoli visibili su un transilluminatore UV.
5. Al fine di esaminare la relazione filogenetica tra gli isolati dell'agente del marciume radicale e della corona, ottenere le sequenze di basi geniche ITS mediante PCR, che sono state sintetizzate in modo bidirezionale (5'-3' e 3'-5') attraverso un fornitore. Confrontare le sequenze di base con i dati genetici del sito web NCBI (National Center of Biotechnology Information) e le sequenze di base del gene ITS di altri isolati di Fusarium nel mondo utilizzando il programma Blast. Usalo per identificare gli isolati a livello di specie come descritto di seguito.
   1. Vai al https://www.ncbi.nlm.nih.gov sito web. Fare clic sulla scheda BLAST nella sezione Risorse popolari.
   2. Fare clic sulla scheda Nucleotide BLAST nella nuova finestra. Nella sezione Inserisci sequenza di query nella nuova finestra, inserisci le sequenze di base in formato Fasta e scrivi il nome dello studio nella sezione Titolo di lavoro.
   3. Successivamente, selezionare Database standard (nr ecc.) nella scheda Database nella sezione Scegli set di ricerca in basso.
   4. Seleziona Sequenze molto simili (megablast) nella scheda Ottimizza per nella sezione Selezione programma e fai clic sulla scheda BLAST in fondo alla pagina.
6. Utilizza il programma di analisi filogenetica MEGA 11 per determinare la relazione filogenetica tra gli isolati di Fusarium . Allineare le sequenze di basi utilizzando il programma ClustalW e creare gli alberi genealogici genetici degli isolati secondo la massima parsimonia per il gene ITS²⁶.
   1. Per scaricare il software Mega, vai al sito Web https://www.megasoftware.net e installa il software Mega. Il software MEGA viene fornito GRATUITAMENTE per l'uso nella ricerca e nell'istruzione.
   2. Innanzitutto, salva le sequenze sul desktop come file Blocco note (.txt) in formato FASTA. Esegui il programma software Mega e fai clic sulla scheda ALLINEA . Fare clic su Modifica/Crea allineamento nella finestra. Successivamente, seleziona Crea un nuovo allineamento nella nuova finestra e fai clic su OK per confermare.
   3. Fare clic sulla scheda DNA . Eliminare il file 1. Sequenza che appare automaticamente nella finestra, e vai su Modifica file, quindi fai clic su Inserisci sequenza dalla scheda File . Aprire il file Blocco note (.txt) che contiene le sequenze e si trova sul desktop.
   4. A questo punto, tutte le sequenze appaiono sullo schermo. Innanzitutto, fai clic su Qualsiasi sequenza che appare sullo schermo, quindi contrassegna tutte le sequenze con CTRL + A. Apri il file di allineamento e fai clic su Allinea con Clustal W da lì, quindi fai clic su OK per eseguire il programma nelle impostazioni predefinite.
   5. Dopo aver esaminato le differenze nell'allineamento delle sequenze, vai al file di dati, fai clic su Analisi filogenetica e quindi fai clic su No nella casella di controllo nella finestra per sapere se le sequenze sintetizzano proteine o meno. Le nostre sequenze non sintetizzano proteine perché appartengono alla regione ITS.
   6. Torna alla finestra principale del software Mega. Fare clic su Filogenesi e selezionare Costruisci/Testa l'albero (o gli alberi) della parsimonia massima. Nella nuova finestra, seleziona Metodo di bootstrap per il test filogenesi e inserisci i valori di bootstrap 1.000 per testare la forza del ramo. Nella scheda Gaps/Trattamento dati mancante, selezionare Eliminazione parziale, selezionare Subtree-poning-Regrafting (SPR) come metodo di ricerca MP e fare clic su OK per confermare le operazioni.
   7. Attendi il risultato dell'analisi per mostrare l'albero filogenetico.

5. Test di patogenicità

1. Utilizzare quattro isolati per gli studi di patogenicità per ogni specie rappresentativa delle specie Fusarium che sono state identificate con metodi molecolari. Eseguire studi di patogenicità a 24 °C, 16 ore di luce fluorescente/8 ore di fotoperiodo scuro, con un'umidità del 65% in una stanza climatizzata.
2. Semina i semi di lenticchia in fiale di plastica nera con 45 fori di 5 cm di diametro. Conservare ogni fiala in ipoclorito di sodio all'1% per 3 minuti e poi risciacquare con acqua distillata sterile 3 volte. Essiccare i semi in un armadio sterile per 24 ore e seminare con un seme in ogni buca.
   NOTA: I semi di lenticchia della varietà Kayı 91, sensibili alla malattia, sono stati utilizzati in tutti i test di patogenicità⁶. La tecnica di immersione della piantina è stata utilizzata come metodo di inoculazione²⁷.
3. Incubare colture pure di ciascun isolato in PDA a 24 °C per 7-10 giorni. Raschiare le colonie coltivate dalla coltura madre dalla superficie del terreno con una spatola e preparare la sospensione di spore/micelio utilizzando acqua distillata sterile.
4. Rimuovere i residui di grandi dimensioni dalla sospensione mediante filtrazione attraverso una garza a 4 strati e regolare la concentrazione di spore/micelio a 1 x 10⁶ spore/mL con l'aiuto di un emocitometro.
5. Dopo questa fase, sradicare le radici delle piantine precedentemente cresciute nelle fiale quando hanno 2-3 foglie vere. Lavare con acqua di rubinetto e ferire leggermente le radici con un ago sterile. Immergere queste piantine nella sospensione preparata di spore/micelio per 3 minuti e poi trapiantarle in fiale di plastica contenenti una miscela sterile di terriccio/torba (2:1; v/v).
6. Per le piantine usate come controlli, sradicate le loro radici, feritele, e poi piantatele immergendole solo in acqua sterile. Effettuare valutazioni del test di patogenicità 3 settimane dopo il processo di inoculazione secondo la scala 0-4.
7. Dopo che i valori di gravità della malattia calcolati sono stati sottoposti a trasformazione angolare, sottoporre i valori ottenuti ad analisi della varianza e valutare le differenze tra le medie secondo il test HSD di Tukey (p = 0,05). Gravità della malattia: gli isolati con lo 0%-15% sono stati valutati come aventi virulenza molto bassa (LV), gli isolati con il 16%-35% sono stati valutati come bassa virulenza (LV), gli isolati con il 36%-50% sono stati valutati come virulenza moderata (O), gli isolati con il 51%-70% sono stati valutati come ad alta virulenza (VV), gli isolati con il 71%-100% sono stati valutati come ad altissima virulenza (VV) e gli isolati senza sintomi di malattia sono stati valutati come isolati saprofitici o epifiti.

Risultati

Determinazione dei parametri della malattia
Un totale di 83 aree di semina di lenticchie che coprono nove diverse regioni di Yozgat sono state valutate in termini di sintomi di appassimento, radice e marciume della corona, che si estendono su un'area di 1,1984 x 10⁶ m² (Tabella 2). I sintomi della malattia dell'avvizzimento o del marciume radicale sono stati riscontrati in tutti i campi. Tuttavia,...

Discussione

È noto che l'appassimento del Fusarium causa gravi perdite di resa economica in alcune parti del mondo³¹. La malattia è stata segnalata per la prima volta in Ungheria³² e successivamente in molti paesi come Egitto, India, Myanmar, Nepal, Pakistan, Turchia, Siria e Stati Uniti³³. Kumar et ^al.34 hanno riportato un'ampia distribuzione di marciume avvizzito delle lenticchie, delle radic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-lactic acid	Merck	100366	Was used as an antibiotic in studies.
2-propanol	Merck	109634	Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)	Eppendorf Research	LB.EP.3123000012	Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)	Eppendorf Research	LB.EP.4924000916	Used to measure small volumes of liquids.
Agar	Merck	110453	For use in making fungal media.
Agarose	Sigma-Aldrich	18300012	For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room	?klimlab		Was used to grow plants under controlled conditions.
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9393	Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balance	Shimadzu ATX224		Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizer	Zealway	GF-120DR	It was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscope	Leica DM750		For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinet	HFsafe Class II A2		To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
Centrifugal	DLAB DM1424	LB.DL.903001124	Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	220551	Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer set	Sigma-Aldrich	Z165220	It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slide	ISOLAB	075.01.006 / 075.02.005	Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrate	Merck	108342	For use in making fungal media.
DFC450 with digital camera	Leica		Digital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope	Leica	MIC5246	Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresis	thermo fisher scientific	B2-UVT
Dna gel loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611	For use in molecular diagnostics.
dNTP mix	Thermo Scientific	R0192	Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)	Thermo Scientific	K1082	For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatule	ISOLAB	082.03.001	It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta	Thermo Scientific	17892	For use in molecular diagnostics.
Ethanol	Merck	100983	Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758	Used in molecular studies.
Filter paper	ISOLAB	107.58.158	Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinet	ZHICHENG ZXDS-A-1090		For use in incubation processes.
Fume hood	Elektromag EM1201	LB.EM.EM1201	It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging system	Syngene G:BOX Chemi XX6		For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladder	Thermo Scientific	SM0372	For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acid	Merck	1005706	Used in molecular studies.
Glycerol	Merck	104094	For use in stock culture of fungi.
Lancet	ISOLAB	048.50.002	Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	814733	Used in molecular studies.
Measuring tape	ISOLAB	016.07.500	Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubes	ISOLAB	0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003	Used to store different volumes of liquids.
PCR tube	ISOLAB	123.01.002	It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishes	ISOLAB	120.13.090	For use in growing fungus culture.
Pipette tips	ISOLAB	005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004	To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bag	ISOLAB	039.30.005	Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic pot	ToXA		Was used for growing plants.
Pliers, clamps	ISOLAB	048.08.130	It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortar	ISOLAB	038.02.150	Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agar	Condalab	1022	For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water system	human CORPORATION	LT.HC.NHP009	Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)	Vestel		For use in the storage of stock materials.
Rifampicin	Sigma-Aldrich	557303	Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetate	Merck	106268	Used in molecular studies.
Sodium chloride	Merck	1064041000	Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143	Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solution	Merck	105614	Used for surface disinfection.
Spatula	ISOLAB	047.33.210	It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomyc?n sulfate	BioShop Canada	STP101	To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pure	Tekkim	TK.200650	For use as a disinfectant in all stages of work.
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T3258	Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCR	Bio?Rad T100		For use in genomic analyses.
Thoma lam	ISOLAB	075.03.002	For use in spore counting.
Tris HCL	Roche	10812846001	Used in molecular studies.
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Used in molecular studies.
Tween 80	Merck	822187	For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteks	Velp WIZARD	LB.VLP.F202A0175	Used to mix substances in liquid volumes.
Water baths	Memmert WNB 22	1018-5702	It was used during incubation in dna extraction studies.