Detección de campos de lentejas para detectar la presencia de marchitez por Fusarium y pudrición de la raíz en Türkiye en el clima terrestre

Resumen

Un estudio en la provincia de Yozgat encontró que los factores bióticos, como las enfermedades fúngicas como la marchitez y la pudrición de la raíz, limitan la producción de lentejas. Se encontraron aislados de Fusarium en el 95,4% de las muestras, lo que sugiere estudios locales periódicos y monitoreo regular para el desarrollo de tecnologías sostenibles y estrategias de control efectivas.

Resumen

La lenteja es una importante planta de cultivo de leguminosas autopolinizada. Su producción está limitada por varios factores bióticos, especialmente los agentes fúngicos causantes del complejo de marchitez y pudrición de la raíz. El estudio tuvo como objetivo comprender la epidemiología regional y la etiología de los agentes fúngicos fitopatógenos para desarrollar estrategias de control contra Fusarium spp. Este estudio investigó 83 localidades de siembra de lentejas en la provincia de Yozgat para enfermedades de marchitez, pudrición de la raíz y de la corona causadas por especies comunes de Fusarium durante 2022 y 2023. Se recolectaron plantas de lenteja sintomáticas para el aislamiento e identificación de hongos. Los aislados de Fusarium se agruparon de acuerdo con la morfología de la colonia y se cultivaron en medio PDA. Además, los ADN genómicos obtenidos de aislados de Fusarium se analizaron mediante PCR y se compararon con otros aislados de Fusarium registrados en el NCBI GenBank. Las relaciones genéticas entre los aislados de Fusarium se determinaron utilizando el método de Máxima Parsimonia (MP) en el programa Mega 11. Los resultados, la incidencia media y la tasa de gravedad de las enfermedades de marchitez y pudrición de la raíz en la provincia de Yozgat fueron de 16,9% y 38,6%, respectivamente. Se encontraron aislados de Fusarium en el 95,4% de las muestras. Hubo una homogeneidad de la secuencia de nucleótidos del 99,5% al 100% entre los aislados de F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum y F. solani, y la especie más aislada fue F. oxysporum. El dendrograma MP de los aislados de Fusarium se dividió en dos ramas principales, la primera rama incluyó todos los aislados de F. solani. La segunda rama principal incluyó otras especies de Fusarium aisladas en el presente estudio y en el GenBank del NCBI. El estudio sugiere realizar estudios locales periódicos para determinar la frecuencia de marchitez por Fusarium para su supresión en las lentejas. Se recomienda encarecidamente la supresión oportuna de los daños causados por Fusarium para controlar la enfermedad y conservar el sistema de producción de lentejas.

Introducción

La lenteja (Lens culinaris Medik.), una leguminosa de grano comestible pequeño que pertenece a la familia Fabaceae, es un cultivo de estación fría que se autopoliniza con hojas en forma de aguja y flores de color blanco a púrpura pálido o púrpura oscuro¹. Fue domesticado por los humanos hace unos 10.000 años en la parte mesopotámica del Creciente Fértil y se extendió rápidamente al Nuevo Mundo, incluyendo la cuenca mediterránea y Asia Central, y más tarde se naturalizó en las^Américas. La superficie mundial de cultivo de lentejas es de unos 5,5 millones de hectáreas con una producción de 6,6 millones de toneladas³. Türkiye ocupa^{el 4º lugar} en producción de lentejas después de Canadá, India y Australia. El cultivo de lentejas en Türkiye es muy importante y representa el 6,7% de la producción mundial. La producción total de lentejas de Türkiye es de 474.000 toneladas y se produce en al menos 40 provincias⁴. Alrededor del 89,5 por ciento de la producción de lentejas de Türkiye son lentejas rojas y verdes, que constituyen el 10,5 por ciento de la cosecha de invierno en la región de Anatolia sudoriental. El resto de la cosecha se cultiva como cultivos de verano. Las provincias de Yozgat (39,5 %), Konya (23,7 %), Kırşehir (16,3 %), Çorum (7,6 %) y Ankara (2,9 %) contribuyen en gran medida a la producción de lentejas verdes⁴. La producción de lentejas puede verse limitada por factores de estrés bióticos y abióticos. Las heladas y la sequía son los factores de estrés abiótico más comunes en la producción de lentejas verdes en verano⁵. Las enfermedades fúngicas como la marchitez, la raíz y el complejo de pudrición de la corona causadas por las especies Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium y Fusarium son las enfermedades fúngicas más importantes, que causan una combinación de enfermedades que incluyen marchitamiento, tizón de las plántulas, marchitez y pudrición de la raíz, según el momento de la infección, la susceptibilidad del huésped y las condiciones meteorológicas ^{6,7, 8} de la Constitución.

Fusarium es un hongo filamentoso imperfecto que se encuentra en el suelo, las plantas y los sustratos orgánicos y es un género cosmopolita entre estos patógenos⁹. Causa diversas enfermedades como la marchitez por Fusarium, la pudrición de la raíz y el cuello de la raíz, así como el tizón de la espiga por Fusarium en el trigo, el marchitamiento por Fusarium en las cucurbitáceas y la pudrición de la raíz en la mayoría de las legumbres, incluidas las lentejas 10,11,12. La marchitez vascular, la pudrición de la raíz y del cuello de la raíz causada por Fusarium spp. es la enfermedad más importante de las lentejas en muchas áreas de cultivo de lentejas a nivel mundial¹⁰. Fusarium oxysporum es la especie de Fusarium más común asociada con la marchitez, la pudrición de la raíz y el cuello de la raíz en las lentejas. A nivel mundial, las enfermedades de marchitez, pudrición de la raíz y de la corona son causadas por F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani y F. verticillioides en áreas de plantación de lentejas⁷. Las enfermedades de marchitez, pudrición de la raíz y de la corona causadas por Fusarium spp. ocurren tanto en la etapa de plántula como en la adulta y causan marchitamiento repentino, secado y eventual muerte de las hojas. Los síntomas de la enfermedad incluyen pudrición de la semilla, pudrición de la raíz, marchitamiento de los folíolos superiores, retraso en el crecimiento, encogimiento y enroscamiento de las hojas. En las etapas intermedias y tardías de llenado de las vainas, las semillas generalmente se encogen y los síntomas de la raíz incluyen retraso en el crecimiento, decoloración marrón, puntas de raíz principal dañadas y proliferación de raíces secundarias. La decoloración del tejido vascular puede no observarse en todos los casos¹³.

En la región de Anatolia Central, se han realizado estudios sobre el estado de las enfermedades de marchitez y pudrición de la raíz en las lentejas en cantidades limitadas. Yozgat tiene un clima suave y moderado con abundantes precipitaciones en invierno en comparación con el verano y está clasificado como Dsb (Clima terrestre cálido y húmedo) por Köppen y Geiger¹⁴. La temperatura media es de 9,6 °C con una precipitación media de 512 mm. Yozgat se encuentra en el hemisferio norte. El verano ocurre en junio, julio, agosto y septiembre. Es muy importante contar con información sobre la epidemiología regional y la etiología de los agentes fúngicos fitopatógenos causantes de la enfermedad para desarrollar diferentes estrategias de control contra Fusarium spp. transmitido por el suelo, para el control de la enfermedad¹⁵. En este contexto, los objetivos del presente estudio son determinar e identificar los parámetros de la enfermedad (prevalencia de la enfermedad, incidencia y gravedad) de las enfermedades de marchitez, pudrición de la raíz y de la corona en lentejas mediante la realización de una encuesta en la provincia de Yozgat, donde aproximadamente el 40% de la producción total de lentejas verdes se realiza individualmente, el patógeno Fusarium especies que causan marchitez y pudrición de la raíz en las lentejas mediante análisis morfológicos y moleculares, y determinar los niveles de virulencia individuales de las especies de Fusarium mediante la realización de pruebas de patogenicidad.

Protocolo

NOTA: Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Estudio de campo, muestreo y aislamiento de hongos

NOTA: En 2022 y 2023 se realizaron trabajos de relevamiento, según Endes¹⁶. Se observaron un total de 83 áreas de plantación de lentejas en nueve distritos de la provincia de Yozgat para la enfermedad de marchitez, pudrición de la raíz y del cuello de la raíz (Figura 1).

1. Seleccione campos de lentejas con un área de más de 1000^m2 como área de muestreo. Recoja cada muestra caminando aleatoriamente desde el borde hasta el centro o centro del campo en zigzags caminando a lo largo de las diagonales usando un marco de 1 m² , colocándola aleatoriamente en un mínimo de tres puntos diferentes seleccionados al azar. Recoja las plantas de lentejas que muestren síntomas de enfermedad en cada punto, colóquelas en bolsas de papel y transfiera al laboratorio para su uso en estudios de aislamiento e identificación de hongos.
   NOTA: Las raíces y los cuellos de las plantas de lentejas enfermas transferidas al laboratorio se lavaron primero con agua del grifo para eliminar los residuos gruesos; posteriormente, fueron sometidos a la desinfección de superficies para el aislamiento de los patógenos fúngicos según lo descrito por Endes¹⁶.
2. Remoje los tejidos vegetales enfermos en etanol al 70% durante 10-15 s, y luego enjuague 3 veces durante 3 minutos cada uno en agua estéril. Manténgalos todos en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% durante 5 minutos y enjuague 3 veces durante 5 minutos cada uno nuevamente con agua estéril.
3. Seque los tejidos vegetales húmedos en papeles de filtro en un gabinete estéril para finalizar el proceso de desinfección de superficies. A continuación, corte los tejidos vegetales desinfectados en trozos de 5-10 mm de largo y coloque 4-5 trozos en un medio PDA que contenga un 0,01% de estreptomicina dentro de placas de Petri (90 mm de diámetro). Coloque las placas de Petri en una incubadora en la oscuridad a 25 ± 1 °C durante 4-7 días y observe el crecimiento de hongos.
   NOTA: Los aislados de hongos en desarrollo se purificaron mediante el método de aislamiento de esporas únicas. Para ello, se modificó y utilizó el estudio realizado por Choi et ^al.17 sobre la obtención de cultivos de esporas individuales de hongos pertenecientes a Ascomycetes, Basidiomycetes, Coelomycetes e Hyphomycetes como se describe a continuación.
4. Para purificar los aislados de hongos, mantenga los aislados de hongos obtenidos al final de los estudios de aislamiento en una incubadora a 25 ± 1 °C durante 12 h de luz fluorescente / 12 h de oscuridad durante 15 días para favorecer la formación de estructuras de reproducción anamórficas en PDA.
5. Pese alrededor de 100 mg de micelio de hongos de cultivos de 15 días con una espátula, transfiéralo a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y luego muélalo completamente con morteros de plástico estériles para homogeneizarlo.
6. Agregue 1 mL de agua estéril y vórtice durante 1 min para asegurar la transferencia de esporas al agua. Para ajustar el número de esporas que se transfieren al agua, extraiga 20 μL de esta mezcla con una pipeta y compruebe el número de esporas con un aumento de 10x del microscopio óptico.
7. Cuando la cantidad de esporas sea mayor que la cantidad deseada, diluya la mezcla de esporas y agua en proporciones como 1/10, 1/100 y 1/1000. Proporcione una mezcla que contenga de 4 a 6 esporas en el campo de visión del microscopio.
8. Tome 100 μL de la suspensión de esporas preparada y transfiérala a placas de Petri de 90 mm de diámetro que contengan medio PDA suplementado con estreptomicina al 0,1%. A continuación, extienda la suspensión transferida sobre el PDA con una espátula Drigalski.
9. Incubar las placas de Petri preparadas en la oscuridad a 25 ± 1 °C durante 12-24 h. Al final de este período, transfiera pequeños trozos de hifas desarrollados a partir de un solo conidio con un asa de inoculación a una nueva placa de Petri que contenga medio PDA. Cada cultivo obtenido de cada espora es un cultivo de una sola espora. Almacenarlos para utilizarlos en pruebas de patogenicidad e identificación morfológica y molecular.
   NOTA: El objetivo principal es mantener vivos los aislados de hongos durante mucho tiempo sin cambiar su morfología, genética y virulencia. El proceso de almacenamiento se llevó a cabo utilizando dos métodos diferentes^18,19. Todos los métodos de almacenamiento utilizados en este estudio se explican en detalle a continuación.
   1. El primer método para almacenar muestras es el siguiente. Cultivar aislados de hongos en medio PDA a 25 ± 1 °C con un 12:12 h oscuridad: luz durante 15 días para obtener discos de micelio de 4 mm de diámetro que podrían almacenarse en agua estéril.
   2. Cortar discos de micelio (4 mm de diámetro, 10 discos) con un barrenador del corcho de cultivos fúngicos que crecieron en las condiciones antes mencionadas. Transfiera los discos de micelio a tubos de microcentrífuga que contengan 1 mL de agua estéril. Mantener las muestras en tubos de microcentrífuga en el frigorífico a -20 °C durante 6 meses.
   3. El segundo método para almacenar muestras es el siguiente. En primer lugar, se toma una pizca del disco fúngico puro de los cultivos de esporas individuales obtenidos con un asa de inoculación y se transfiere a placas de Petri que contienen PDA suplementado con cloranfenicol, ácido láctico, ampicilina, rifampicina, tetraciclina, estreptomicina, etc.
   4. Cultivar durante 5-10 días antes del proceso de almacenamiento a 25 ± 1 °C con una condición de 12 h: 12 h oscuridad: luz. Corte y esterilice papeles de filtro de uso general de 1 cm x 1 cm en un autoclave a 121 °C, 15 psi durante 60 min.
   5. Coloque los papeles de filtro en placas de Petri nuevas con el mismo medio o selectivo. Corta colonias/esporas de cultivo fúngico puro y colócalas en la parte superior de cada pieza.
   6. Selle las placas de Petri y colóquelas en una incubadora en condiciones de crecimiento adecuadas (como se mencionó anteriormente). Los aislados de hongos crecen lentamente en el papel de filtro. Incubar durante aproximadamente 15 días para asegurar una colonización completa.
   7. Después de la esporulación o la formación completa de colonias en papeles de filtro, transfiera los trozos de papel individuales a una nueva placa de Petri sin un medio de cultivo. Posteriormente, coloque las placas de Petri en la incubadora hasta que el papel de filtro y los hongos estén completamente secos (aproximadamente 20-30 días).
   8. Después del secado, coloque 10 trozos de papel de filtro en cada sobre de papel estéril, etiquete cada sobre, coloque estos sobres en bolsas de plástico y guarde las bolsas de plástico que contienen los sobres en un recipiente de plástico y transparente a -20 °C.
10. Calcule la tasa de prevalencia de la enfermedad de marchitez de las lentejas, la raíz y la pudrición de la corona en Yozgat de acuerdo con la fórmula que se da a continuación, considerando la prevalencia de la enfermedad en cada campo de lentejas, seguido del nombre del distrito de la provincia.
    Tasa de prevalencia de la enfermedad (%) = (a / b) x 100
    donde a indica el número de campos enfermos; b Indica el número total de campos topográficos en un distrito.
11. Calcular la incidencia de la enfermedad de acuerdo con el método de promedio ponderado reportado por Bora y Karaca²⁰. Cuenta las plantas de cada cuadrado del campo. Sepárelas en plantas enfermas y no enfermas en cada cuadrado y calcule la prevalencia de enfermedades de acuerdo con la fórmula que se da a continuación.
    Tasa de prevalencia de la enfermedad (%) = (x / y) x 100
    donde x indica el número de plantas enfermas; y indica el número total de plantas encuestadas.
12. Calcule la gravedad de la enfermedad de acuerdo con la escala 0-4 de Öğüt²¹, donde 0 = no mostró síntomas, 1 = síntomas de nivel leve en el 25% de las hojas; 2 = síntomas de nivel moderado en el 26%-50% de las hojas; 3= clorosis severa y marchitez en el 51%-75% de las hojas; y 4 = clorosis muy severa y síntomas de marchitamiento o desecación, desprendimiento, retraso del crecimiento u hojas muertas en más del 75% de las plantas en el mismo orden (Figura 2).
13. Calcule la gravedad de la enfermedad utilizando la siguiente fórmula con los valores de escala obtenidos¹⁶.
    Gravedad de la enfermedad (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    donde ni número de plantas en el valor de la escala; VI Valor de la escala; V valor de escala más alto; N número total de plantas observadas; i indica el número de clases.

2. Datos meteorológicos

1. Realizar estudios de encuestas. Para este protocolo, se realizaron encuestas durante los periodos de mayo y junio de 2022 y 2023. Obtenga los valores de temperatura, humedad relativa y precipitación total para el período marzo-julio en 2022, 2023 y años largos de la Dirección de Meteorología Provincial en Yozgat (Tabla 1).

3. Identificación morfológica

1. Comparar las características culturales (color de la colonia, micelio aéreo, tasa de crecimiento de micelios) y conidios (dimensiones de los conidios, forma, color y número de tabiques) de los aislados de Fusarium con las de estudios anteriores e identificar tentativamente las especies fúngicas.
2. Seleccionar muestras representativas de los grupos que se utilizarán en la identificación morfológica. Purifique estas muestras de acuerdo con el método de aislamiento de una sola espora como se mencionó anteriormente. Durante este período, observe las características de pigmentación de las colonias de aislados de Fusarium , así como las estructuras de micro/macroconidios y clamidosporas.
3. Para promover la formación de estructuras micromorfológicas como micro/macroconidios y clamidosporas en los cultivos de hongos puros obtenidos, incubar en PDA a 25 ± 1 °C y 12 h: 12 h oscuridad: luz durante 25-30 días en una incubadora. Mida la longitud y el ancho de los conidios para cada aislado de Fusarium mediante microscopía óptica. Además, documente la estructura, la forma, el color y los septos o sin septos de los conidios utilizando un microscopio óptico suministrado con una cámara digital.
4. Con base en las observaciones anteriores, agrupe los aislados de Fusarium según el nivel de especie, como se describe en Leslie y Suerell²².

4. Identificación molecular

NOTA: El ADN genómico total de los aislados de Fusarium se extrajo utilizando el siguiente método, que fue ligeramente modificado del protocolo de Cenis²³. Los análisis de PCR y electroforesis de los aislados de Fusarium se realizaron utilizando el protocolo descrito por Aras y Endes²⁴.

1. Extracción de ADN genómico fúngico
   1. A partir de un cultivo fresco (de 10 días de antigüedad) de aislados de Fusarium cultivados en PDA, raspe 100 mg de micelio con un bisturí estéril y luego transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 2 mL. Incubar los tubos a -20 °C durante la noche.
   2. Después de la incubación durante la noche, agregue 500 μL de tampón de extracción de ADN (200 mM de Tris-HCl pH: 8,5, 250 mM de NaCl, 25 mM de EDTA, 0,5% de dodecil sulfato de sodio) en los tubos y triture con un mortero de plástico estéril.
   3. A continuación, añadir 150 μL de acetato de sodio 3M (NaOAc) pH 5,2 a los tubos e incubar a -20 °C durante 30 min. Después de esta etapa, centrifugar los tubos a 4.000 x g durante 10 min.
   4. Después de la centrifugación, transfiera 400 μL del sobrenadante en la parte superior del tubo a tubos nuevos (1,5 mL) y agregue un volumen igual de isopropanol (2-propanol). Incubar los nuevos tubos a -20 °C durante 30 min. Durante este tiempo, mezcle suavemente los tubos 5 o 6 veces.
   5. Centrifugar a 4.000 x g durante 10 min para precipitar el ADN genómico y desechar todo el líquido que quede en los tubos.
   6. Agregue 1 mL de etanol al 70% a la bolita de ADN genómico como un sedimento blanco o de color crema en el fondo del tubo. Mezcle suavemente el tubo hacia arriba y hacia abajo 4x-5x durante aproximadamente 1 min, desechando todo el etanol en los tubos. Luego, abra los tubos en flujo de aire laminar durante 30 minutos para evaporar completamente el etanol en la pastilla de ADN.
   7. Para disolver el ADN genómico y almacenarlo durante mucho tiempo, añada 50 μL de solución tampón TE (1M Tris-HCl pH: 8,0; 0,5M EDTA pH 8,0) a los tubos e incubar los tubos en un baño de agua a 65 °C durante 1 h. Durante este tiempo, mezcle suavemente el tubo hacia arriba y hacia abajo de 8 a 10 veces. Almacene el ADN genómico disuelto en una solución tampón TE en un congelador a -20 °C para su uso en estudios moleculares.
2. Para los estudios de PCR, utilice cebadores de oligonucleótidos ITS5 F (5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') para amplificar la región ITS del ADNr²⁵. Realice cada reacción de PCR con 2,5 μL de tampón de PCR 10x, 2,5 μL de MgCl₂ (25 mM), 2,5 μL de dNTP (2 mM), 0,5 μL de cada cebador (10 μM), 2 μL de ADN molde, 0,5 μL de ADN polimerasa Taq (1 U/μL, Fermantas) y 14 μL de sQH2O en un volumen total de 25 μL.
3. Para la reacción de PCR de 25 μL, ejecute el siguiente programa de PCR a 95 °C durante 2 min (desnaturalización inicial), seguido de 40 ciclos; 95 °C durante 30 s (desnaturalización), 55 °C durante 45 s (recocido), 72 °C durante 90 s (extensión) y 72 °C durante 5 min (extensión final). Productos de PCR electroforesa durante 1,5 h a 90 V en gel de agarosa al 1,5% preparado en 1x solución tampón TAE (Tris Base - Ácido Acético Glacial - EDTA).
   1. Para preparar el tampón TAE para la electroforesis en gel, disuelva 242 g de base Tris en 700 ml de agua estéril; añadir los 57,1 mL de ácido acético glacial; añadir los 100 mL de solución de EDTA 0,5 M y ajustar el volumen a 1 L añadiendo agua estéril. Ajuste el pH final del tampón TAE de 1 L 50x a 8,5. Para hacer el tampón de trabajo 1x TAE, agregue 49 partes de agua estéril a 1 parte del tampón TAE 50x.
4. Tiñir los geles con bromuro de etidio de 0,5 μg/mL e inspeccionarlos visualmente haciéndolos visibles en un transiluminador UV.
5. Con el fin de examinar la relación filogenética entre los aislados de agentes de pudrición de la raíz y de la corona, se obtuvieron las secuencias de bases del gen ITS por PCR, que se sintetizaron bidireccionalmente (5'-3' y 3'-5') a través de un proveedor. Comparar las secuencias de bases con los datos genéticos del sitio web del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) y las secuencias de bases del gen ITS de otros aislados de Fusarium en el mundo utilizando el programa Blast. Utilícelo para identificar los aislados a nivel de especie como se describe a continuación.
   1. Ve a https://www.ncbi.nlm.nih.gov sitio web. Haga clic en la pestaña BLAST en la sección Recursos populares.
   2. Haga clic en la pestaña Nucleotide BLAST en la nueva ventana. En la sección Ingresar secuencia de consulta en la nueva ventana, ingrese las secuencias base en formato Fasta y escriba el nombre del estudio en la sección Título del trabajo.
   3. A continuación, marque Bases de datos estándar (nr, etc.) en la pestaña Base de datos en la sección Elegir conjunto de búsqueda en la parte inferior.
   4. Marque Secuencias muy similares (megablast) en la pestaña Optimizar para en la sección Selección de programa y haga clic en la pestaña BLAST en la parte inferior de la página.
6. Utilice el programa de análisis filogenético MEGA 11 para determinar la relación filogenética entre los aislados de Fusarium . Alinear las secuencias de bases utilizando el programa ClustalW y crear los árboles genealógicos genéticos de los aislados según la máxima parsimonia para el gen ITS²⁶.
   1. Para descargar el software de Mega, vaya al sitio web https://www.megasoftware.net e instale el software de Mega. El software MEGA se proporciona GRATIS para su uso en investigación y educación.
   2. Primero, guarde las secuencias en el escritorio como un archivo de bloc de notas (.txt) en formato FASTA. Ejecute el programa de software Mega y haga clic en la pestaña ALIGN . Haga clic en Editar/Construir alineación en la ventana. A continuación, marque Crear una nueva alineación en la nueva ventana y haga clic en Aceptar para confirmar.
   3. Haga clic en la pestaña ADN . Suprímase el 1. Secuencia que aparece automáticamente en la ventana, y vaya a Editar archivo, luego haga clic en la pestaña Insertar secuencia desde archivo . Abra el archivo del Bloc de notas (.txt) que contiene las secuencias y que se encuentra en el escritorio.
   4. En esta etapa, todas las secuencias aparecen en la pantalla. Primero, haga clic en Cualquier secuencia que aparezca en la pantalla, luego marque todas las secuencias con CTRL + A. Abra el archivo de alineación y haga clic en Alinear por Clustal W desde allí, y haga clic en Aceptar para ejecutar el programa en la configuración predeterminada.
   5. Después de examinar las diferencias en la alineación de las secuencias, vaya al archivo de datos, haga clic en Análisis filogenético y luego haga clic en No en la casilla de verificación de la ventana para ver si las secuencias sintetizan proteínas o no. Nuestras secuencias no sintetizan proteínas porque pertenecen a la región ITS.
   6. Regrese a la ventana principal del software Mega. Haga clic en Filogenia y seleccione Construir/Probar árbol (s) de parsimonia máxima. En la nueva ventana, seleccione Método de arranque para la prueba de filogenia e introduzca los valores de arranque 1.000 para probar la fuerza de la bifurcación. En la pestaña Tratamiento de datos faltantes, seleccione Eliminación parcial, seleccione Subtree-prupuping-Regrafting (SPR) como método de búsqueda MP y haga clic en Aceptar para confirmar las operaciones.
   7. Espere a que el resultado del análisis muestre el árbol filogenético.

5. Prueba de patogenicidad

1. Utilice cuatro aislados para estudios de patogenicidad para cada especie representativa de las especies de Fusarium que se identificaron por métodos moleculares. Realizar estudios de patogenicidad a 24 °C, 16 h de luz fluorescente/8 h de fotoperiodo oscuro, con 65% de humedad en una habitación climatizada.
2. Siembre semillas de lentejas en viales de plástico negro con 45 agujeros de 5 cm de diámetro. Mantenga cada vial en hipoclorito de sodio al 1% durante 3 minutos y luego enjuague con agua destilada estéril 3 veces. Secar las semillas en un armario estéril durante 24 h y sembrar con una semilla en cada hoyo.
   NOTA: Las semillas de lenteja de la variedad Kayı 91, sensibles a la enfermedad, se utilizaron en todas las pruebas de patogenicidad⁶. Como método de inoculación se utilizó la técnica de inmersión de plántulas²⁷.
3. Incubar cultivos puros de cada aislado en PDA a 24 °C durante 7-10 días. Raspe las colonias cultivadas a partir del cultivo madre de la superficie del medio con una espátula y prepare la suspensión de esporas/micelio con agua destilada estéril.
4. Elimine los residuos grandes de la suspensión mediante filtración a través de una gasa de 4 capas y ajuste la concentración de esporas/micelio a 1 x 10⁶ esporas/mL con la ayuda de un hemocitómetro.
5. Después de esta etapa, arranque las raíces de las plántulas previamente cultivadas en los viales cuando tengan 2-3 hojas verdaderas. Lavar con agua del grifo y herir ligeramente las raíces con una aguja estéril. Sumerja estas plántulas en la suspensión de esporas/micelio preparada durante 3 minutos y luego trasplántelas a viales de plástico que contengan una mezcla estéril de tierra/turba (2:1; v/v).
6. Para las plántulas utilizadas como controles, arranque sus raíces, lastúrelas y luego plántelas sumergiéndolas solo en agua estéril. Realizar evaluaciones de las pruebas de patogenicidad 3 semanas después del proceso de inoculación según la escala 0-4.
7. Después de que los valores de severidad de la enfermedad calculados se sometieron a transformación de ángulo, se sometió los valores obtenidos a un análisis de varianza y se evaluaron las diferencias entre las medias según la prueba HSD de Tukey (p = 0.05). Severidad de la enfermedad: Los aislados con 0%-15% se evaluaron con muy baja virulencia (LV), los aislados con 16%-35% se evaluaron como baja virulencia (LV), los aislados con 36%-50% se evaluaron como virulencia moderada (O), los aislados con 51%-70% se evaluaron como alta virulencia (VV), los aislados con 71%-100% se evaluaron como muy alta virulencia (VV) y los aislados sin síntomas de enfermedad se evaluaron como aislados saprófitos o epífitos.

Resultados

Determinación de los parámetros de la enfermedad
Se evaluaron un total de 83 áreas de siembra de lentejas que cubrían nueve regiones diferentes de Yozgat en términos de marchitez, raíz y síntomas de pudrición de la corona, extendiéndose sobre un área de 1.1984 x 10⁶ m² (Tabla 2). Se encontraron síntomas de marchitez o pudrición de la raíz en todos los campos. Sin embargo, la incidenci...

Discusión

Se sabe que el marchitamiento por Fusarium causa graves pérdidas de rendimiento económico en algunas partes del mundo³¹. La enfermedad se notificó por primera vez en Hungría³² y posteriormente en muchos países como Egipto, India, Myanmar, Nepal, Pakistán, Turquía, Siria y Estados Unidos³³. Kumar et ^al.34 informaron de una amplia distribución de marchitez de las lentejas, pudri...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-lactic acid	Merck	100366	Was used as an antibiotic in studies.
2-propanol	Merck	109634	Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)	Eppendorf Research	LB.EP.3123000012	Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)	Eppendorf Research	LB.EP.4924000916	Used to measure small volumes of liquids.
Agar	Merck	110453	For use in making fungal media.
Agarose	Sigma-Aldrich	18300012	For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room	?klimlab		Was used to grow plants under controlled conditions.
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9393	Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balance	Shimadzu ATX224		Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizer	Zealway	GF-120DR	It was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscope	Leica DM750		For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinet	HFsafe Class II A2		To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
Centrifugal	DLAB DM1424	LB.DL.903001124	Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	220551	Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer set	Sigma-Aldrich	Z165220	It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slide	ISOLAB	075.01.006 / 075.02.005	Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrate	Merck	108342	For use in making fungal media.
DFC450 with digital camera	Leica		Digital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope	Leica	MIC5246	Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresis	thermo fisher scientific	B2-UVT
Dna gel loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611	For use in molecular diagnostics.
dNTP mix	Thermo Scientific	R0192	Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)	Thermo Scientific	K1082	For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatule	ISOLAB	082.03.001	It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta	Thermo Scientific	17892	For use in molecular diagnostics.
Ethanol	Merck	100983	Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758	Used in molecular studies.
Filter paper	ISOLAB	107.58.158	Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinet	ZHICHENG ZXDS-A-1090		For use in incubation processes.
Fume hood	Elektromag EM1201	LB.EM.EM1201	It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging system	Syngene G:BOX Chemi XX6		For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladder	Thermo Scientific	SM0372	For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acid	Merck	1005706	Used in molecular studies.
Glycerol	Merck	104094	For use in stock culture of fungi.
Lancet	ISOLAB	048.50.002	Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	814733	Used in molecular studies.
Measuring tape	ISOLAB	016.07.500	Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubes	ISOLAB	0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003	Used to store different volumes of liquids.
PCR tube	ISOLAB	123.01.002	It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishes	ISOLAB	120.13.090	For use in growing fungus culture.
Pipette tips	ISOLAB	005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004	To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bag	ISOLAB	039.30.005	Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic pot	ToXA		Was used for growing plants.
Pliers, clamps	ISOLAB	048.08.130	It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortar	ISOLAB	038.02.150	Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agar	Condalab	1022	For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water system	human CORPORATION	LT.HC.NHP009	Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)	Vestel		For use in the storage of stock materials.
Rifampicin	Sigma-Aldrich	557303	Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetate	Merck	106268	Used in molecular studies.
Sodium chloride	Merck	1064041000	Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143	Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solution	Merck	105614	Used for surface disinfection.
Spatula	ISOLAB	047.33.210	It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomyc?n sulfate	BioShop Canada	STP101	To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pure	Tekkim	TK.200650	For use as a disinfectant in all stages of work.
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T3258	Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCR	Bio?Rad T100		For use in genomic analyses.
Thoma lam	ISOLAB	075.03.002	For use in spore counting.
Tris HCL	Roche	10812846001	Used in molecular studies.
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Used in molecular studies.
Tween 80	Merck	822187	For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteks	Velp WIZARD	LB.VLP.F202A0175	Used to mix substances in liquid volumes.
Water baths	Memmert WNB 22	1018-5702	It was used during incubation in dna extraction studies.