Türkiye'de Karasal İklim Altında Mercimek Tarlalarının Fusarium Solgunluğu ve Kök Çürüklüğü Açısından Taranması

Özet

Yozgat ilinde yapılan bir araştırma, solgunluk ve kök çürüklüğü gibi mantar hastalıkları gibi biyotik faktörlerin mercimek üretimini sınırladığını buldu. Fusarium izolatları örneklerin %95,4'ünde bulundu, bu da sürdürülebilir teknoloji geliştirme ve etkili kontrol stratejileri için periyodik yerel anketler ve düzenli izleme önermektedir.

Özet

Mercimek, kendi kendine tozlaşan önemli bir baklagil mahsulü bitkisidir. Üretimi, solgunluk ve kök çürüklüğü kompleksine neden olan mantar ajanları başta olmak üzere çeşitli biyotik faktörlerle sınırlıdır. Bu çalışmada fitopatojenik fungal etkenlerin bölgesel epidemiyolojisi ve etiyolojisinin anlaşılarak toprak kaynaklı Fusarium spp.'ye karşı kontrol stratejilerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada, Yozgat ilinde 2022 ve 2023 yıllarında yaygın olarak görülen Fusarium türlerinin neden olduğu solgunluk, kök ve taç çürüklüğü hastalıkları açısından 83 mercimek ekim bölgesi incelenmiştir. Mantar izolasyonu ve identifikasyonu için semptomatik mercimek bitkileri toplandı. Fusarium izolatları koloni morfolojisine göre gruplandırıldı ve PDA besiyerinde kültüre edildi. Ayrıca, Fusarium izolatlarından elde edilen genomik DNA'lar PCR kullanılarak analiz edildi ve NCBI GenBank'ta kayıtlı diğer Fusarium izolatları ile karşılaştırıldı. Fusarium izolatları arasındaki genetik ilişkiler Mega 11 programında Maximum Parsimony (MP) yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Yozgat ilinde solgunluk ve kök çürüklüğü hastalıklarının sonuçları, ortalama insidansı ve hastalık şiddet oranı sırasıyla %16.9 ve %38.6 olarak bulundu. Örneklerin %95.4'ünde Fusarium izolatları bulunmuştur. F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum ve F. solani izolatları arasında %99,5 ile %100 arasında nükleotid dizi homojenliği bulunmuş olup, en çok izole edilen tür F. oxysporum olmuştur. Fusarium izolatlarının MP dendrogramı iki ana dala ayrıldı, ilk dal tüm F. solani izolatlarını içeriyordu. İkinci ana dal, bu çalışmada ve NCBI GenBank'ta izole edilen diğer Fusarium türlerini içeriyordu. Çalışma, mercimekte baskılanma için Fusarium solgunluğunun sıklığını belirlemek için periyodik yerel araştırmalar önermektedir. Hastalığı kontrol altına almak ve mercimek üretim sistemini korumak için Fusarium bazlı hasarların zamanında bastırılması şiddetle tavsiye edilir.

Giriş

Fabaceae familyasına ait küçük yenilebilir bir baklagil olan mercimek (Lens culinaris Medik.), iğne benzeri yaprakları ve beyaz ila soluk mor veya koyu mor çiçekleri olan kendi kendine tozlaşan, serin mevsim mahsulüdür¹. Yaklaşık 10.000 yıl önce Bereketli Hilal'in Mezopotamya bölgesinde insanlar tarafından evcilleştirildi ve hızla Akdeniz Havzası ve Orta Asya da dahil olmak üzere Yeni Dünya'ya yayıldı ve daha sonra Amerika^2'ye vatandaşlığa kabul edildi. Dünya mercimek ekim alanı yaklaşık 5,5 milyon hektar olup, üretim 6,6 milyon tondur³. Türkiye, mercimek üretiminde Kanada, Hindistan ve Avustralya'dan sonra 4.^sırada yer almaktadır. Türkiye'de mercimek yetiştiriciliği çok önemlidir ve dünya üretiminin %6,7'sini oluşturmaktadır. Türkiye'nin toplam mercimek üretimi 474.000 ton olup, en az 40 ilde üretilmektedir⁴. Türkiye'nin mercimek üretiminin yaklaşık %89,5'ini kırmızı ve yeşil mercimek oluşturmakta olup, bu oran Güneydoğu Anadolu Bölgesi'nde kışlık mahsulün %10,5'ini oluşturmaktadır. Mahsulün geri kalanı yaz bitkileri olarak yetiştirilir. Yozgat (%39,5), Konya (%23,7), Kırşehir (%16,3), Çorum (%7,6) ve Ankara (%2,9) illeri yeşil mercimek üretimine büyük ölçüde katkı sağlamaktadır⁴. Mercimek üretimi biyotik ve abiyotik stres faktörleri ile sınırlanabilir. Don ve kuraklık, yaz yeşil mercimek üretiminde en sık görülen abiyotik stres faktörleridir⁵. Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium ve Fusarium türlerinin neden olduğu solgunluk, kök ve taç çürüklüğü kompleksi gibi mantar hastalıkları, enfeksiyonun zamanlamasına, konak duyarlılığına ve meteorolojik koşullara bağlı olarak sönümleme, fide yanıklığı, solgunluk ve kök çürüklüğü gibi hastalıkların bir kombinasyonuna neden olan en önemli mantar hastalıklarıdır ^{6,7, 8}.

Fusarium, toprakta, bitkilerde ve organik substratlarda bulunan ipliksi kusurlu bir mantardır ve bu patojenler arasında kozmopolit bir cinstir⁹. Fusarium solgunluğu, kök ve kök boğazı çürüklüğü gibi çeşitli hastalıkların yanı sıra buğdayda Fusarium baş yanıklığı, kabakgillerde Fusarium solgunluğu ve mercimek de dahil olmak üzere çoğu baklagilde kök çürüklüğüne neden olur 10,11,12. Fusarium spp.'nin neden olduğu damar solgunluğu, kök ve kök boğazı çürüklüğü tüm dünyada birçok mercimek ekim alanında mercimeğin en önemli hastalığıdır¹⁰. Fusarium oxysporum, mercimekte solgunluk, kök ve kök boğazı çürüklüğü ile ilişkili en yaygın Fusarium türüdür. Tüm dünyada mercimek ekim alanlarında solgunluk, kök ve taç çürüklüğü hastalıklarına F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani ve F. verticillioides neden olmaktadır⁷. Fusarium spp.'nin neden olduğu solgunluk, kök ve taç çürüklüğü hastalıkları hem fide hem de yetişkin aşamalarında ortaya çıkar ve yaprakların ani solmasına, kurumasına ve sonunda ölümüne neden olur. Hastalığın belirtileri arasında tohum çürümesi, kök çürümesi, üst yaprakçıkların solması, bodurluk, büzülme ve yaprakların kıvrılması yer alır. Orta ve geç bakla doldurma aşamalarında, tohumlar genellikle küçülür ve kök semptomları arasında bodur büyüme, kahverengi renk değişikliği, hasarlı kazık kök uçları ve ikincil köklerin çoğalması yer alır. Damar dokusunda renk değişikliği her olguda görülmeyebilir¹³.

İç Anadolu Bölgesi'nde mercimekte solgunluk ve kök çürüklüğü hastalıklarının durumu ile ilgili çalışmalar sınırlı sayıda yapılmıştır. Ilıman ve ılıman bir iklime sahip olan Yozgat, kış aylarında yaz aylarına göre bol yağış alır ve Köppen ve Geiger¹⁴ tarafından Dsb (Ilık, nemli karasal iklim) olarak sınıflandırılır. Ortalama sıcaklık 9,6 °C, ortalama yağış miktarı 512 mm'dir. Yozgat kuzey yarımkürede yer almaktadır. Yaz haziran, temmuz, ağustos ve eylül aylarında gerçekleşir. Hastalık kontrolünde toprak kaynaklı Fusarium spp.'ye karşı farklı kontrol stratejilerinin geliştirilmesi için hastalığa neden olan fitopatojenik mantar etkenlerinin bölgesel epidemiyolojisi ve etiyolojisi hakkında bilgi sahibi olmak çok önemlidir¹⁵. Bu bağlamda, bu çalışmanın amacı, toplam yeşil mercimek üretiminin yaklaşık %40'ının tek başına yapıldığı Yozgat ilinde bir yüzey araştırması yapılarak mercimekte solgunluk, kök ve taç çürüklüğü hastalıklarının hastalık parametrelerinin (hastalık prevalansı, insidansı ve şiddeti) belirlenmesi ve tanımlanmasıdır Mercimeklerde solgunluk ve kök çürüklüğüne neden olan türlerin morfolojik ve moleküler analizler ile belirlenmesi ve Fusarium türlerinin patojenite testleri yapılarak tekil virülans seviyelerinin belirlenmesidir.

Protokol

NOT: Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Saha araştırması, numune alma ve mantar izolasyonu

NOT: Anket çalışması 2022 ve 2023 yıllarında Endes^16'ya göre yapılmıştır. Yozgat ilinde dokuz ilçeyi kapsayan toplam 83 mercimek ekim alanında solgunluk, kök ve kök boğazı çürüklüğü hastalığı gözlenmiştir (Şekil 1).

1. Örnekleme alanı olarak 1000^m2'den büyük mercimek tarlalarını seçin. Her bir örneği, 1^m2'lik bir çerçeve kullanarak köşegenler boyunca zikzaklar çizerek sınırdan alanın merkezine veya ortasına rastgele yürüyerek toplayın ve rastgele seçilen en az üç farklı noktaya yerleştirin. Hastalık belirtisi gösteren mercimek bitkilerini her noktadan toplayarak kese kağıtlarına koyup, mantar izolasyonu ve tanımlama çalışmalarında kullanılmak üzere laboratuvara aktarıyor.
   NOT: Laboratuvara aktarılan hastalıklı mercimek bitkilerinin kökleri ve kök boğazları önce iri tortulardan kurtulmak için musluk suyu ile yıkanmış; daha sonra, Endes¹⁶ tarafından tarif edildiği gibi mantar patojenlerinin izolasyonu için yüzey dezenfeksiyonuna tabi tutuldular.
2. Hastalıklı bitki dokularını 10-15 saniye% 70 etanol içinde bekletin ve ardından 3 kez steril suda her birini 3 dakika durulayın. Hepsini %1 sodyum hipoklorit (NaOCl) içinde 5 dakika tutun ve her birini 3 kez 5 dakika steril su ile tekrar durulayın.
3. Yüzey dezenfeksiyon işlemini bitirmek için ıslak bitki dokularını steril bir dolapta filtre kağıtları üzerinde kurutun. Bunu takiben, dezenfekte edilmiş bitki dokularını 5-10 mm uzunluğunda parçalar halinde kesin ve 4-5 parçayı Petri kapları (90 mm çapında) içinde% 0.01 streptomisin içeren bir PDA ortamına yerleştirin. Petri kaplarını karanlıkta 25 ± 1 °C'de 4-7 gün boyunca bir kuluçka makinesine koyun ve mantar büyümesini gözlemleyin.
   NOT: Gelişen mantar izolatları tek spor izolasyon yöntemi ile saflaştırılmıştır. Bu amaçla, Choi ve ^ark.17 tarafından Ascomycetes, Basidiomycetes, Coelomycetes ve Hyphomycetes'e ait mantarların tek spor kültürlerinin elde edilmesi üzerine yapılan çalışmada aşağıda tarif edildiği gibi modifiye edilmiş ve kullanılmıştır.
4. Mantar izolatlarını saflaştırmak için, izolasyon çalışmaları sonunda elde edilen mantar izolatlarını 25 ± 1 °C'de 12 saat floresan ışık / 12 saat karanlıkta 15 gün süreyle bir inkübatörde bekleterek PDA üzerinde anamorfik üreme yapılarının oluşumunu teşvik edin.
5. 15 günlük kültürlerden yaklaşık 100 mg mantar miselyumunu bir spatula ile tartın, 1.5 mL'lik steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve ardından homojenizasyon için steril plastik tokmaklarla iyice öğütün.
6. Sporların suya transferini sağlamak için 1 mL steril su ekleyin ve 1 dakika boyunca girdap yapın. Suya geçen sporların sayısını ayarlamak için, bu karışımdan bir pipetle 20 μL çekin ve ışık mikroskobunun 10x büyütmesi altında spor sayısını kontrol edin.
7. Spor miktarı istenilen miktardan fazla olduğunda spor-su karışımını 1/10, 1/100 ve 1/1000 gibi oranlarda seyreltiniz. Mikroskop görüş alanında 4-6 spor içeren bir karışım sağlayın.
8. Hazırlanan spor süspansiyonunun 100 μL'sini alın ve% 0.1 streptomisin ile takviye edilmiş PDA ortamı içeren 90 mm çapındaki Petri kaplarına aktarın. Ardından, aktarılan süspansiyonu bir Drigalski spatula ile PDA üzerine yayın.
9. Hazırlanan Petri kaplarını karanlıkta 25 ± 1 °C'de 12-24 saat inkübe edin. Bu sürenin sonunda, bir aşılama halkası olan tek bir konidiadan geliştirilen küçük hif parçalarını, PDA ortamı içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Her spordan elde edilen her kültür, tek bir spor kültürüdür. Bunları patojenite testlerinde ve morfolojik ve moleküler tanımlamada kullanılmak üzere saklayın.
   NOT: Temel amaç, mantar izolatlarını morfolojilerini, genetiklerini ve virülanslarını değiştirmeden uzun süre canlı tutmaktır. Depolama işlemi iki farklı yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir^18,19. Bu çalışmada kullanılan tüm saklama yöntemleri aşağıda detaylı olarak açıklanmıştır.
   1. Numuneleri saklamanın ilk yöntemi aşağıdaki gibidir. Steril suda saklanabilen 4 mm çapında miselyum diskleri elde etmek için 12:12 saat karanlık: 15 gün boyunca 25 ± 1 ° C'de mantar izolatlarını büyütün: 15 gün boyunca aydınlatın.
   2. Miselyum disklerini (4 mm çapında, 10 disk) yukarıda belirtilen koşullar altında büyüyen mantar kültürlerinden bir mantar delici ile kesin. Miselyum disklerini 1 mL steril su içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Numuneleri mikrosantrifüj tüplerinde buzdolabında -20 °C'de 6 ay saklayın.
   3. Numuneleri saklamanın ikinci yöntemi aşağıdaki gibidir. İlk olarak, bir aşılama halkası ile elde edilen tek spor kültürlerinden saf mantar diskinden bir tutam alın ve kloramfenikol, laktik asit, ampisilin, rifampisin, tetrasiklin, streptomisin vb. ile takviye edilmiş PDA içeren Petri kaplarına aktarın.
   4. Depolama işleminden 5-10 gün önce 25 ± 1 °C'de 12 saat: 12 saat karanlık: aydınlık durumda büyütün. 1 cm x 1 cm genel amaçlı filtre kağıtlarını otoklavda 121 °C, 15 psi'de 60 dakika kesin ve sterilize edin.
   5. Filtre kağıtlarını aynı veya seçici ortama sahip yeni Petri kaplarına yerleştirin. Saf mantar kültüründen kolonileri/sporları kesin ve her parçanın üzerine yerleştirin.
   6. Petri kaplarını kapatın ve uygun büyüme koşullarında (yukarıda belirtildiği gibi) bir inkübatöre yerleştirin. Mantar izolatları filtre kağıdı üzerinde yavaş büyür. Tam kolonizasyonu sağlamak için yaklaşık 15 gün kuluçkaya yatırın.
   7. Filtre kağıtlarında sporülasyon veya tam koloni oluşumundan sonra, tek tek kağıt parçalarını kültür ortamı olmayan yeni bir petri kabına aktarın. Daha sonra, filtre kağıdı ve mantar tamamen kuruyana kadar (yaklaşık 20-30 gün) Petri kaplarını inkübatöre koyun.
   8. Kuruduktan sonra her bir steril kağıt zarfın içine 10 adet filtre kağıdı koyun, her zarfı etiketleyin, bu zarfları plastik poşetlere koyun ve zarfların bulunduğu plastik poşetleri -20 °C'de plastik ve şeffaf bir kapta saklayın.
10. Yozgat'ta mercimek solgunluğu, kök ve taç çürüklüğü hastalığının yaygınlık oranını, her bir mercimek tarlasında hastalığın yaygınlığını ve ardından ilin ilçe adını göz önünde bulundurarak aşağıda verilen formüle göre hesaplayın.
    Hastalık yaygınlık oranı (%) = (a / b) x 100
    burada a, hastalıklı alanların sayısını gösterir; b, bir ilçede incelenen alanların toplam sayısını gösterir.
11. Bora ve Karaca²⁰ tarafından bildirilen ağırlıklı ortalama yöntemine göre hastalığın görülme sıklığını hesaplayın. Tarladaki her karedeki bitkileri sayın. Bunları her karede hastalıklı ve hastalıksız bitkilere ayırın ve aşağıda verilen formüle göre hastalık prevalansını hesaplayın.
    Hastalık yaygınlık oranı (%) = (x / y) x 100
    burada x hastalıklı bitkilerin sayısını gösterir; Y, incelenen toplam bitki sayısını gösterir.
12. Öğüt^21'in 0-4 ölçeğine göre hastalık şiddetini hesaplayın, burada 0 = hiçbir belirti göstermedi, 1 = yaprakların %25'inde hafif düzeyde semptomlar; 2 = yaprakların %26-50'sinde orta düzeyde semptomlar; 3= yaprakların %51-75'inde şiddetli kloroz ve solma; ve 4 = aynı sırayla %75'ten fazla bitkide çok şiddetli kloroz ve solma semptomları veya kuruma, dökülme, büyüme geriliği veya ölü yapraklar (Şekil 2).
13. Elde edilen ölçek değerleri ile aşağıdaki formülü kullanarak hastalık şiddetini hesaplayın¹⁶.
    Hastalık Şiddeti (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    burada ölçek değerindeki bitki sayısı ni; VI ölçek değeri; V en yüksek ölçek değeri; N gözlenen toplam bitki sayısı; i, sınıf sayısını gösterir.

2. Meteorolojik veriler

1. Anket çalışmaları yapın. Bu protokol için 2022 yılı Mayıs ve Haziran ayları ile 2023 dönemlerinde anket çalışmaları gerçekleştirilmiştir. 2022, 2023 yılı Mart-Temmuz dönemi ve uzun yıllara ait sıcaklık, bağıl nem ve toplam yağış değerlerini Yozgat İl Meteoroloji Müdürlüğü'nden temin ediniz (Tablo 1).

3. Morfolojik tanımlama

1. Fusarium izolatlarının kültürel (koloni rengi, hava miselyumu, misel büyüme hızı) ve konidiyal (konidiyal boyutlar, şekil, renk ve septum sayısı) özelliklerini daha önceki çalışmalarınkilerle karşılaştırın ve mantar türlerini geçici olarak tanımlayın.
2. Morfolojik tanımlamada kullanılacak gruplardan temsili örnekler seçin. Bu numuneleri yukarıda belirtildiği gibi tek spor izolasyon yöntemine göre saflaştırın. Bu süre zarfında, Fusarium izolatlarının koloni pigmentasyon özelliklerinin yanı sıra mikro/makrokonidia ve klamidospor yapılarını gözlemleyin.
3. Elde edilen saf mantar kültürlerinde mikro/makrokonidia ve klamidosporlar gibi mikromorfolojik yapıların oluşumunu teşvik etmek için, bir inkübatörde 25 ± 1 °C'de ve 12 saat: 12 saat karanlık: 25-30 gün boyunca PDA'da inkübe edin. Işık mikroskobu ile her Fusarium izolatı için conidia'nın uzunluğunu ve genişliğini ölçün. Ek olarak, bir dijital kamerayla birlikte verilen bir ışık mikroskobu kullanarak conidia'nın yapısını, şeklini, rengini ve septasını veya septasını belgeleyin.
4. Yukarıdaki gözlemlere dayanarak, Fusarium izolatlarını Leslie ve Suerell^22'de açıklandığı gibi tür düzeyine göre gruplandırın.

4. Moleküler tanımlama

NOT: Fusarium izolatlarının toplam genomik DNA'sı, Cenis ²³ protokolünden biraz modifiye edilmiş olan aşağıdaki yöntem kullanılarak ekstrakte edildi. Fusarium izolatlarının PCR analizleri ve elektroforezi Aras ve Endes²⁴ tarafından tarif edilen protokol kullanılarak gerçekleştirildi.

1. Mantar genomik DNA ekstraksiyonu
   1. PDA üzerinde yetiştirilen taze bir Fusarium izolat kültüründen (10 günlük), steril bir neşter ile 100 mg miselyum kazıyın ve daha sonra 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri gece boyunca -20 °C'de inkübe edin.
   2. Gece boyunca inkübasyondan sonra, tüplere 500 μL DNA ekstraksiyon tamponu (200 mM Tris-HCl pH: 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA,% 0.5 Sodyum dodesil sülfat) ekleyin ve steril bir plastik tokmak ile ezin.
   3. Daha sonra, tüplere 150 μL 3M sodyum asetat (NaOAc) pH 5.2 ekleyin ve -20 °C'de 30 dakika inkübe edin. Bu aşamadan sonra, tüpleri 10 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin.
   4. Santrifüjlemeden sonra, tüpün üst kısmındaki 400 μL süpernatanı yeni tüplere (1.5 mL) aktarın ve eşit hacimde izopropanol (2-propanol) ekleyin. Yeni tüpleri -20 °C'de 30 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, tüpleri 5x veya 6x yavaşça karıştırın.
   5. Genomik DNA'yı çökeltmek için 10 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin ve tüplerde kalan tüm sıvıyı atın.
   6. Tüpün dibinde beyaz veya krem renkli bir tortu olarak genomik DNA peletine 1 mL %70 etanol ekleyin. Tüpü yaklaşık 1 dakika boyunca 4x-5x yukarı ve aşağı karıştırın ve tüplerdeki tüm etanolü atın. Ardından, DNA peleti üzerindeki etanolü tamamen buharlaştırmak için tüpleri laminer hava akışında 30 dakika açın.
   7. Genomik DNA'yı çözmek ve uzun süre saklamak için, tüplere 50 μL TE (1M Tris-HCl pH: 8.0; 0.5M EDTA pH 8.0) tampon çözeltisi ekleyin ve tüpleri 65 ° C'de 1 saat boyunca bir su banyosunda inkübe edin. Bu süre zarfında, tüpü yavaşça 8x-10x yukarı ve aşağı karıştırın. TE tampon çözeltisi içinde çözünen genomik DNA'yı moleküler çalışmalarda kullanılmak üzere -20 °C'lik derin dondurucuda saklayın.
2. PCR çalışmaları için, rDNA 25'in ITS bölgesini amplifiye etmek için oligonükleotid primerleri ITS5 F (5'GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') /^ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') kullanın. Her PCR reaksiyonunu 2.5 μL 10x PCR tamponu, 2.5 μL MgCl₂ (25 mM), 2.5 μL dNTP (2 mM), her primerden 0.5 μL (10 μM), 2 μL şablon DNA, 0.5 μL Taq DNA polimeraz (1 U/μL, Fermantas) ve 14 μL sQH2O ile toplam 25 μL hacimde gerçekleştirin.
3. 25 μL PCR reaksiyonu için, aşağıdaki PCR programını 95 °C'de 2 dakika (ilk denatürasyon), ardından 40 döngü çalıştırın; 30 sn için 95 °C (denatürasyon), 45 sn için 55 °C (tavlama), 90 sn için 72 °C (uzatma) ve 5 dk için 72 °C (son uzatma). 1x TAE (Tris Baz - Buzul Asetik Asit - EDTA) tampon çözeltisinde hazırlanan% 1.5 agaroz jel içinde 90 V'ta 1.5 saat boyunca elektroforez PCR ürünleri.
   1. Jel elektroforezi için TAE tamponu hazırlamak için 242 g Tris bazını 700 mL steril suda çözün; 57.1 mL Buzlu asetik asit ekleyin; 100 mL 0,5 M EDTA solüsyonunu ekleyin ve steril su ekleyerek hacmi 1 L'ye ayarlayın. 1 L 50x TAE tamponunun son pH'ını 8,5'e ayarlayın. 1x TAE çalışma tamponunu yapmak için, 50x TAE tamponunun 1 kısmına 49 kısım steril su ekleyin.
4. Jelleri 0,5 μg/mL etidyum bromür ile boyayın ve bir UV transilluminatöründe görünür hale getirerek görsel olarak inceleyin.
5. Kök ve taç çürüklüğü ajan izolatları arasındaki filogenetik ilişkiyi incelemek için, bir satıcı aracılığıyla çift yönlü olarak (5'-3' ve 3'- 5') sentezlenen PCR ile ITS gen baz dizilerini elde edin. Blast programını kullanarak baz dizilerini NCBI (Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi) web sitesindeki gen verileriyle ve dünyadaki diğer Fusarium izolatlarının ITS geninin baz dizileriyle karşılaştırın. Aşağıda açıklandığı gibi tür düzeyinde izolatları tanımlamak için bunu kullanın.
   1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov web sitesine gidin. Popüler Kaynaklar bölümündeki BLAST sekmesine tıklayın.
   2. Yeni penceredeki Nucleotide BLAST sekmesine tıklayın. Yeni pencerede yer alan Enter Query Sequence (Sorgu Sırasını Girin) bölümünde, temel dizileri Fasta formatında girin ve İş Unvanı kısmına etüdün adını yazın.
   3. Daha sonra alt kısımda bulunan Choose Search Set (Arama Kümesi Seç) kısmında Database sekmesinde Standard databases (nr etc.) seçeneğini işaretleyiniz.
   4. Program Seçimi bölümündeki Optimize for sekmesinde Highly similar sequences (megablast) seçeneğini işaretleyin ve sayfanın altındaki BLAST sekmesine tıklayın.
6. Fusarium izolatları arasındaki filogenetik ilişkiyi belirlemek için MEGA 11 filogenetik analiz programını kullanın. ClustalW programını kullanarak baz dizilerini hizalayın ve ITS geni²⁶ için maksimum cimriliğe göre izolatların genetik aile ağaçlarını oluşturun.
   1. Mega yazılımını indirmek için https://www.megasoftware.net web sitesine gidin ve Mega yazılımını yükleyin. MEGA yazılımı, araştırma ve eğitimde kullanılmak üzere ÜCRETSİZ olarak sağlanmaktadır.
   2. İlk olarak, dizileri masaüstüne FASTA formatında bir Not Defteri dosyası (.txt) olarak kaydedin. Mega yazılım programını çalıştırın ve ALIGN sekmesine tıklayın. Pencerede Hizalamayı Düzenle/Oluştur'a tıklayın. Ardından, kontrol edin Yeni Bir Hizalama Oluştur yeni pencerede ve onaylamak için Tamam'a tıklayın.
   3. DNA sekmesine tıklayın. 1'i silin. Pencerede otomatik olarak görünen sıra ve Dosyayı düzenle'ye gidin, ardından Dosyadan Sıra Ekle sekmesine tıklayın. Dizileri içeren ve masaüstünde bulunan Not Defteri (.txt) dosyasını açın.
   4. Bu aşamada, tüm diziler ekranda belirir. Önce ekranda görünen Herhangi Bir Diziye tıklayın, ardından tüm dizileri CTRL + A ile işaretleyin. Alignment (Hizalama) dosyasını açın ve oradan Align by Clustal W (Clustal W ile Hizala ) seçeneğine tıklayın ve programı varsayılan ayarlarda çalıştırmak için OK (Tamam ) butonuna tıklayın.
   5. Dizilerin hizalanmasındaki farklılıkları inceledikten sonra, Veri dosyasına gidin, Filogenetik Analiz'e tıklayın ve ardından dizilerin protein sentezleyip sentezlemediğini görmek için penceredeki onay kutusunda Hayır'a tıklayın. Dizilerimiz proteinleri sentezlemezler çünkü bunlar ITS bölgesine aittir.
   6. Mega yazılımının ana penceresine dönün. Filogeni'ye tıklayın ve Maksimum Parsimony Ağaç(lar)ını Oluştur/Test Et'i seçin. Yeni pencerede, Filogeni testi için Bootstrap Yöntemi'ni seçin ve Dal gücünü test etmek için bootstrap değerlerini 1.000 girin. Boşluklar/eksik Veri İşleme sekmesinde Kısmi Silme'yi seçin, MP arama yöntemi olarak Alt Ağaç-budama-Yeniden Aşılama (SPR) seçeneğini belirleyin ve işlemleri onaylamak için Tamam'a tıklayın.
   7. Analiz sonucunun Filogenetik ağacı göstermesini bekleyin.

5. Patojenite testi

1. Moleküler yöntemlerle tanımlanan Fusarium türlerinden her temsili tür için patojenite çalışmaları için dört izolat kullanın. Klimalı bir odada 24 °C'de, 16 saat floresan ışığında / 8 saat karanlık fotoperiyotta, %65 nemde patojenite çalışmaları gerçekleştirin.
2. Mercimek tohumlarını 5 cm çapında 45 delikli siyah plastik şişelere ekin. Her şişeyi 3 dakika% 1 sodyum hipoklorit içinde tutun ve ardından 3 kez steril damıtılmış su ile durulayın. Tohumları steril bir dolapta 24 saat kurutun ve her deliğe bir tohum ekin.
   NOT: Tüm patojenite testlerinde hastalığa duyarlı Kayı 91 çeşidinin mercimek tohumları kullanılmıştır⁶. Aşılama yöntemi olarak fide daldırma tekniği kullanılmıştır²⁷.
3. Her izolatın saf kültürlerini PDA'da 24 ° C'de 7-10 gün inkübe edin. Stok kültüründen yetiştirilen kolonileri bir spatula ile ortamın yüzeyinden kazıyın ve steril damıtılmış su kullanarak spor/miselyum süspansiyonunu hazırlayın.
4. 4 katmanlı bir tülbentten süzülerek süspansiyondaki büyük kalıntıları çıkarın ve spor/miselyum konsantrasyonunu bir hemositometre yardımıyla 1 x 10⁶ spor/mL'ye ayarlayın.
5. Bu aşamadan sonra, daha önce şişelerde yetiştirilen fidelerin köklerini 2-3 gerçek yaprakları olduğunda sökün. Musluk suyunda yıkayın ve steril bir iğne ile kökleri hafifçe yaralayın. Bu fideleri hazırlanan spor/miselyum süspansiyonuna 3 dakika daldırın ve ardından steril toprak/turba (2:1; h/h) karışımı içeren plastik şişelere nakledin.
6. Kontrol olarak kullanılan fideler için köklerini sökün, yaralayın ve ardından sadece steril suya batırarak dikin. Aşılama işleminden 3 hafta sonra 0-4 ölçeğine göre patojenite test değerlendirmeleri yapın.
7. Hesaplanan hastalık şiddet değerleri açı dönüşümüne tabi tutulduktan sonra elde edilen değerler varyans analizine tabi tutulmuş ve Tukey'in HSD (p=0.05) testine göre ortalamalar arasındaki farklar değerlendirilmiştir. Hastalık şiddeti: %0-%15 olan izolatlar çok düşük virülanslı (LV), %16-%35 oranlı izolatlar düşük virülanslı (LV), %36-%50 olan izolatlar orta virülanslı (O), %51-%70 oranlı izolatlar yüksek virülanslı (VV), %71-%100 oranlı izolatlar çok yüksek virülanslı (VV) ve hastalık semptomu olmayan izolatlar saprofit veya epifitik izolat olarak değerlendirildi.

Sonuçlar

Hastalık parametrelerinin belirlenmesi
Yozgat'ın dokuz farklı bölgesini kapsayan toplam 83 mercimek ekim alanı, 1.1984 x 10^{6 m2'lik} bir alana yayılan solgunluk, kök ve taç çürüklüğü hastalığı belirtileri açısından değerlendirilmiştir (Tablo 2). Solgunluk veya kök çürüklüğü hastalığı semptomları ile her alanda karşılaşılmıştır. Ancak Yozgat'ta solgunluk ve k?...

Tartışmalar

Fusarium solgunluğunun dünyanın bazı bölgelerinde ciddi ekonomik verim kayıplarına neden olduğu bilinmektedir³¹. Hastalık ilk olarak Macaristan'da³² bildirilmiş ve daha sonra Mısır, Hindistan, Myanmar, Nepal, Pakistan, Türkiye, Suriye ve ABD gibi birçok ülkede bildirilmiştir³³. Kumar ve ^ark.34, dünya çapında en az 26 ülkede meydana geldiğine dair raporlarla birlik...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-lactic acid	Merck	100366	Was used as an antibiotic in studies.
2-propanol	Merck	109634	Used in molecular studies.
Adjustable micro automatic pipette (0.1-2.5 µL)	Eppendorf Research	LB.EP.3123000012	Used to measure small volumes of liquids.
Adjustable micro automatic pipette set (2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1.000 µl)	Eppendorf Research	LB.EP.4924000916	Used to measure small volumes of liquids.
Agar	Merck	110453	For use in making fungal media.
Agarose	Sigma-Aldrich	18300012	For use in gel preparation in electrophoresis.
Air conditioning room	?klimlab		Was used to grow plants under controlled conditions.
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9393	Was used as an antibiotic in studies.
Analytical precision balance	Shimadzu ATX224		Was used to weigh the solid materials used in the study.
Autoclave sterilizer	Zealway	GF-120DR	It was used to sterilize solid and liquid materials at every stage of the study.
Binocular microscope	Leica DM750		For use in morphological diagnosis.
Biological safety cabinet	HFsafe Class II A2		To ensure the safety of the work area, the user, the environment and the operation.
Centrifugal	DLAB DM1424	LB.DL.903001124	Used to separate particles in a sample based on their shape, size and density
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	220551	Was used as an antibiotic in studies.
Cork-borer set	Sigma-Aldrich	Z165220	It was used to take samples from fungus culture in petri dishes.
Cover glass and slide	ISOLAB	075.01.006 / 075.02.005	Was used in the preparation process for microscope studies.
D(+)-glucose monohydrate	Merck	108342	For use in making fungal media.
DFC450 with digital camera	Leica		Digital microscope camera with c-mount interface and with a 5 megapixel ccd sensor.
Dm750 binocular microscope	Leica	MIC5246	Was used for morphological identification of fungi.
DNA gel electrophoresis	thermo fisher scientific	B2-UVT
Dna gel loading dye (6x)	Thermo Scientific	R0611	For use in molecular diagnostics.
dNTP mix	Thermo Scientific	R0192	Used in molecular studies.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)	Thermo Scientific	K1082	For use in molecular diagnostics.
Drigalski spatule	ISOLAB	082.03.001	It was used to scrape and spread fungal cultures grown in petri dishes.
Edta	Thermo Scientific	17892	For use in molecular diagnostics.
Ethanol	Merck	100983	Used in molecular studies and surface disinfection studies.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Used to stain dna in gels during gel electrophoresis.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758	Used in molecular studies.
Filter paper	ISOLAB	107.58.158	Used in stock culture studies.
Forced air drying cabinet	ZHICHENG ZXDS-A-1090		For use in incubation processes.
Fume hood	Elektromag EM1201	LB.EM.EM1201	It was used to control harmful chemical vapors, gases and dust.
Gel imaging system	Syngene G:BOX Chemi XX6		For use in molecular diagnostics.
Generuler 50 bp dna ladder	Thermo Scientific	SM0372	For use in molecular diagnostics.
Glacial acetic acid	Merck	1005706	Used in molecular studies.
Glycerol	Merck	104094	For use in stock culture of fungi.
Lancet	ISOLAB	048.50.002	Used to remove diseased tissue from plant samples.
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	814733	Used in molecular studies.
Measuring tape	ISOLAB	016.07.500	Used to measure liquid volumes.
Microcentrifuge tubes	ISOLAB	0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003	Used to store different volumes of liquids.
PCR tube	ISOLAB	123.01.002	It was used to put dna mix in pcr studies.
Petri dishes	ISOLAB	120.13.090	For use in growing fungus culture.
Pipette tips	ISOLAB	005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004	To transfer liquid volumes used in analyses.
Plastic bag	ISOLAB	039.30.005	Was used to transport samples to the laboratory.
Plastic pot	ToXA		Was used for growing plants.
Pliers, clamps	ISOLAB	048.08.130	It was used to put filter papers into envelopes after the fungus grew in the petri dish.
Porcelain mortar	ISOLAB	038.02.150	Was used to crush fungal mycelia.
Potato dextrose agar	Condalab	1022	For the identification and cultivation and of fungi.
Pure water system	human CORPORATION	LT.HC.NHP009	Was used in solution preparation and analysis throughout the studies.
Refrigerator (+4 °C / -20 °C)	Vestel		For use in the storage of stock materials.
Rifampicin	Sigma-Aldrich	557303	Was used as an antibiotic in studies.
Sodium acetate	Merck	106268	Used in molecular studies.
Sodium chloride	Merck	1064041000	Used in molecular studies.
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143	Used in molecular studies.
Sodium hypochlorite solution	Merck	105614	Used for surface disinfection.
Spatula	ISOLAB	047.33.210	It was used to scrape the fungus culture growing in petri dishes.
Streptomyc?n sulfate	BioShop Canada	STP101	To prevent contamination in fungal culture cultivation.
Teksoll extra pure	Tekkim	TK.200650	For use as a disinfectant in all stages of work.
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T3258	Was used as an antibiotic in studies.
Thermal cycler PCR	Bio?Rad T100		For use in genomic analyses.
Thoma lam	ISOLAB	075.03.002	For use in spore counting.
Tris HCL	Roche	10812846001	Used in molecular studies.
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Used in molecular studies.
Tween 80	Merck	822187	For use in spore solution in pathogenicity testing.
Vortex mixer vorteks	Velp WIZARD	LB.VLP.F202A0175	Used to mix substances in liquid volumes.
Water baths	Memmert WNB 22	1018-5702	It was used during incubation in dna extraction studies.