وقد وضعت التقنيات المعروضة هنا بتمويل من المنح المقدمة من وزارة الطاقة (علوم الطاقة الحيوية) ومؤسسة العلوم الوطنية.

الجزء 1 : زراعة وتخزين المواد النباتية المناسبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تجربتنا ، hypocotyls الشباب من شتلات الخيار etiolated بمثابة مصدرا مريحا للمواد الجدار الخلوي لهذه التجارب. وزرعت بذور الخيار على الورق الرطب في ضوء مربع واقية ، والتي تبقي في خزانة في غرفة مظلمة درجة حرارة ثابتة وضعت في 26 درجة مئوية. درجة الحرارة بالضبط ليست حرجة ، وعلى ما بين 22 درجة و 30 درجة مئوية وينبغي أن يكون على ما يرام ، ولكن درجة الحرارة سيحدد مدى سرعة الوصول الى مرحلة الشتلات المناسبة للتنمية. الأكثر دفئا وحرارة ، وأسرع وتطوير الشتلات. نحن عادة استخدام الشتلات عندما نمت إلى حوالي 5 سم في الطول ، الذي تم التوصل 3-4 أيام بعد البذر. فمن المهم أن تكون الشتلات نمت في الظلام ، وحتى كميات صغيرة من الضوء تؤثر على معدل التنمية الشتلات وخصائص جدار الخلية التي نقيس مع هذه التقنية. في يوم 3 يمكنك ملاعبة في المربع ، وذلك باستخدام الضوء الأخضر الباهت تصفيتها ، للاطمئنان على وضع الغرسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقطع الشتلات بسرعة ومعبأة في علب بلاستيكية صغيرة ، 100-150 شتلة في المربع ، وتخزينها في -80 ° C. عند هذه الدرجة التي لا تزال مفيدة لعدة اسابيع. </li></ol> الجزء 2 : تحضير عينات جدار الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل مجموعات صغيرة (8-10) من الشتلات خفض المجمدة من الفريزر إلى حاوية تحتوي على كتلة عازلة المجمد -80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير متآكل إهاب تغطي التحتفلقي مع السامور. يتم ذلك عن طريق الرسم مرارا التحتفلقي بين الإبهام والسبابة ، والتي هي المغلفة مع الطين سميكة من مسحوق السامور الرطب. فإنه يأخذ القليل الخبرة في معرفة المبلغ الصحيح من الضغط لاستخدام : الكثير من الضغط وطبقة البشرة يبدأ تكون تمزيقه وممزقة ، والضغط قليلا جدا ، ولن يكون permeabilized إهاب. واحد أيضا على العمل بسرعة لأنه كما يذوب في التحتفلقي المجمدة ، يصبح رخو ويصعب السيطرة عليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وانخفض التحتفلقي متآكل في الماء المثلج لإزالة معظم السامور التمسك ثم تخزينها على الماء المثلج بينما أعد hypocotyls المتبقية بطريقة مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع hypocotyls إلى الطول المطلوب ، وعادة 1،2 سم ، مع واحدة جديدة شفرة حلاقة وارتفع محاذاة ثم على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن نحن بحاجة إلى تسطيح الجدران لإزالة الخلايا والنسغ لتسهيل لقط. يتم وضع شريحة زجاجية الثاني على رأس مجموعة من عينات 80-10 ، وتشكيل لبيع الشطائر. يتم وضع الوزن (400-500 ز) على أعلى شريحة زجاجية لمدة 5 دقائق. لوزن نستخدمها بشكل روتيني دورق يحتوي على كمية مناسبة من الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة اختيارية : اعتمادا على هذه التجربة ، قد يكون المعطل لhypocotyls مع المعالجة الحرارية وجيزة عند هذه النقطة. للقيام بذلك ونحن ربط الشرائح الزجاجية مع زوج من الأربطة المطاطية ، وضعت في وعاء التجميع مع 100 مل من غير المتأينة المياه في درجة حرارة الغرفة ووضعه في فرن الميكروويف بكل طاقته. مع المايكرويف لدينا تبدأ المياه في الغليان بنحو 50 ق ونتوقف في الميكروويف 15 ق بعد الغليان يبدأ. يتم سكب الماء الساخن بسرعة خارج والاستعاضة بالماء البارد لوقف تمسخ. قد تضطر لتغيير هذه التوقيتات ، والميكروويف الخاص بك قد تكون مختلفة من بلدنا. التدفئة المفرطة مع العينات تصبح ضعيفة وكسر بسهولة. مع التدفئة كافية ليس المعطل في expansin الذاتية وعينات الجدار لا تزال تحتفظ ببعض القدرة على الاستجابة للدرجة الحموضة الحمضية. </li></ol> الجزء 3 : إعداد التمدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفرضت الآن عينات الجدار في قوة التمدد المستمر. هذا هو جهاز مخصص الصنع التي تتكون من كفيت زجاجي لعقد نهاية القاعدية من العينة الجدار والمشبك المنقولة تعلق على نهاية قمية من العينة. هي التي شنت المشبك المنقولة في نهاية قضيب الذي يمر عبر فتح ملفات من جهاز استشعار الموقف ، وهو LVDT أو &#39;التفاضلية الخطية محول متغير&quot; ، التي يكشف إلكترونيا الموقف من اسطوانة معدنية صغيرة ، أو &quot;الأساسية&quot; ، وهذا هو تعلق على قضيب. ويرتبط في نهاية العلوي من قضيب إلى ذراع مع موازن للتعديل. هذه الرافعة تمارس ضبط مبلغ القوة الصاعدة على عينة الجدار. يتم ضبط القوة عن طريق إضافة أو إزالة المعادن معايرة الأوزان إلى نهاية بكثير من ذراع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى نموذج الجدار -- يتم انتقاؤها نهاية القاعدية من العينة التحتفلقي مع ملقط غرامة ويوضع ~ 2-3 ملم من قمية في نهاية بين فكي المفتوحة للالمشبك المنقولة. هذا هو المشبك المشبك التمساح بنابض الذي المعدنية المغلفة بالبلاستيك الفكين لمنع الاتصال المباشر بين سطح المعدن وحل مؤقت أو العينة الجدار. في أيونات معدنية لدينا تجربة يمكن أن تتسرب من المشبك وتحول دون قدرة الجدار على أن تقدم ، وهكذا نحافظ على المعدن مغطاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد التجمع المشبك المنقولة في يد واحدة ، يتم الآن ناور نهاية القاعدية للعينة في الجدار بين القطع يتوقف اثنين من زجاجي كفيت وكفيت ويتم جلب القطع معا ومشدود ضيقة ، وبالتالي تأمين نهاية الجزء السفلي من الجدار في عينة كفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن التجميع المشبك المنقولة صدر بلطف ، والسماح بنقل القوة الكاملة للثقل العينة الجدار. نستخدم عادة ثقلا موازنا ما مجموعه 20 غراما للحصول على عينات من جدار المعدة hypocotyls الخيار. قد الجدار مواد أخرى أو تجارب تتطلب أوزان مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعبئة كفيت مع العازلة (200 UL) وموقف كفيت تحركت صعودا أو هبوطا مع المسمار التعديل ، بحيث يتم جلب المشبك المنقولة إلى انخفاض نهاية LVDT نطاق القياس. يرتبط LVDT لدينا إلى وحدة جمع البيانات من الحواسيب الصغيرة ، وهكذا نحن نراقب الموقف عن طريق الكمبيوتر LVDT. لدينا ثمانية مجالس LVDT متصلة بالتوازي مع جهاز كمبيوتر واحد ، مما يسمح لنا لتشغيل الجدار 8 عينات في وقت واحد. الكمبيوتر يسجل موقف كل من المجالس مرة واحدة كل ثانية. LVDT 30 </li></ol> الجزء 4 : قياس استجابة لتمديد حامضي أو expansin -- نتائج الممثل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف [التجربة الأولى] للحصول على قياس حمض بفعل التمديد ، ونحن نبدأ مع عينات الجدار الأصلي (الذي هو ، وليس المعطل مع الحرارة) ، وعازلة محايدة لكفيت. عينات الجدار تمتد لبضع دقائق ، وذلك استجابة للتوتر وأضاف ، ولكن التمديد يضمحل إلى انخفاض معدل بعد بضع دقائق. جهاز الكمبيوتر لدينا يتيح لنا مراقبة إما التغيير في طول العينة (أي تغيير في موقف الشبك المنقولة ، بعد بدء التجربة) أو يمكننا رصد المشتقة الوقت للموقف ، وبعبارة أخرى فإن معدل التمديد . معدل التمديد لتستقر قيمة منخفضة مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 20 دقيقة ~ ، تتم إزالة عازلة محايدة. نستخدم أنابيب معدنية رقيقة ، مصنوعة من إبرة الحقن قياس كبير ، متصلا مضخة فراغ لإزالة العازلة بسرعة ، مع الحد الأدنى من الإزعاج للجدار أو التجميع الميكانيكية. ثم يتم إضافة الحمضية العازلة ، وأحيانا مع 1-2 التبادل السريع لتأمين تبادل كاملة لالعازلة الحمضية. ثم علينا الجلوس ومشاهدة استجابة من الجدار. عادة لا يمكننا الكشف عن معدل أسرع من التمديد في بضع دقائق. بعد 60 دقيقة لدينا عادة ما يكفي من المعلومات لتقييم مدى استجابة التمديد ، رغم أنه في بعض الحالات القياسات قد تمتد إلى فترات أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف [التجربة الثانية] للحصول على قياس expansin التي يسببها جدار الخلية التمديد ، ونحن نبدأ مع عينات الجدار المعطل للحرارة وعازلة للكفيت الحمضية. كما في التجربة الأولى ، فإن معدل تمديد جدار الخلية يستقر تدريجيا إلى قيمة منخفضة بسبب عدم وجود expansin الوظيفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 20 دقيقة ~ ، إضافة إلى البروتين expansin كفيت ل &#39;التشويك&#39; مع العازلة في 10-20 ماي كفيت مع التوصل إلى حل expansin. وexpansin تخترق بسرعة العينة وجدار الخلية في غضون بضع دقائق ونحن نرى أن معدل التمديد قد ازداد. يمكن أن يتبع هذا الرد تمديد لمدة ساعة أو أكثر. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1263/fig1.png" alt="" width="600" height="469" /> الشكل 1 : مخطط لإعداد إجراءات لتقييم جدران الخلايا التي يسببها أو حمض expansin بفعل امتداد الجدار.

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+long-term+extension+of+isolated+cell+walls+from+growing+cucumber+hypocotyls.">Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls.</a> Planta. 177, 121-130 (1989).</li><li>Rayle, D. L., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acid+Growth+Theory+of+auxin-induced+cell+elongation+is+alive+and+well.">The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well.</a> Plant Physiol. 99, 1271-1274 (1992).</li><li>Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-induced+growth+of+Avena+coleoptiles+involves+two+mechanisms+with+different+pH+optima.">Auxin-induced growth of Avena coleoptiles involves two mechanisms with different pH optima.</a> Plant Physiol. 99, 1556-1561 (1992).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins.">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407, 321-326 (2000).</li><li>McQueen-Mason, S., Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+endogenous+proteins+that+induce+cell+wall+expansion+in+plants.">Two endogenous proteins that induce cell wall expansion in plants.</a> Plant Cell. 4, 1425-1433 (1992).</li></ol>

لهذه المظاهرة كنا جدران الخلايا من hypocotyls الخيار لأنها أثبتت أن تكون مصدرا موثوقا للعينات الجدار التي يسهل التعامل معها والتي تستجيب مع حساسية جيدة. كان لدينا أيضا نجاحا جيدا مع جدران من الشتلات الأخرى ، فضلا عن بعض المواد من السوبر ماركت ، مثل أوراق السبانخ الشباب وس...

measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic ph and by alpha-expansin

تزايد جدران الخلايا النباتية المعرض بشكل مميز خاصية تعرف باسم &quot;النمو حامض ، ونعني أنها أكثر الموسعة في انخفاض الرقم الهيدروجيني (&lt;5) 1. وأوكسين هرمون يحفز النبات بسرعة استطالة خلية في ينبع الشباب والأنسجة مماثلة على الأقل في جزء من آلية النمو حمض 2 ، 3. أوكسين ينشط H + مضخة في غشاء البلازما ، مما يسبب تحمض الخلية حل الجدار. الجدار تحمض ينشط expansins ، والتي هي الخلية الذاتية الجدار تخفيف البروتينات 4 ، مما تسبب في جدار الخلية الاستسلام لالتوترات الناجمة عن ضغوط الجدار تورم الخلية. ونتيجة لذلك ، تبدأ لتكبير الخلية بسرعة. يقاس بسهولة هذه الظاهرة &quot;النمو حمض&quot; في عزلة (غير الحية) العينات جدار الخلية. قدرة على الخضوع لجدران الخلايا الحمضية الناجمة عن تمديد ليست مجرد نتيجة لهذا الترتيب الهيكلي للجدار الخلية السكريات (مثل pectins) ، ولكنها تعتمد على نشاط expansins 5. Expansins لم يكن لديك أي نشاط معروف الأنزيمية والطريقة الوحيدة لفحص لنشاط expansin هو قياس الحث على تمديد جدار الخلية. هذا التقرير تفاصيل الفيديو مصادر وتقنيات التحضير للحصول على مواد الجدار مناسبة لفحوصات expansin ويمضي لتظهر حمض بفعل التمديد وexpansin بفعل التمديد لعينات من جدار المعدة من خيار hypocotyls المتنامية. للحصول على عينات مناسبة جدار الخلية ، وتزرع شتلات الخيار في الظلام ، وقطع hypocotyls والمجمدة في -80 درجة مئوية. ومتآكل hypocotyls المجمدة ، بالارض ، وفرضت بعد ذلك في توتر دائم في كفيت خاص لقياس التمدد. لقياس حمض بفعل التمديد ، يتم تخزينها في البداية على الجدران محايد الرقم الهيدروجيني ، مما أدى إلى انخفاض في النشاط expansins التي تشكل عناصر من جدران الخلايا الأصلية. عند تبادل عازلة لدرجة الحموضة الحمضية ، ويتم تنشيط expansins وجدران الخلايا تمتد بسرعة. نظهر أيضا نشاط expansin في إعادة فحص. لهذا الجزء ، ونحن استخدام المعالجة الحرارية قصيرة لتفسد expansins الأصلي في عينات من جدار الخلية. هذه الجدران الخلية المعطل لا تمتد حتى في المخزن الحمضية ، ولكن إضافة إلى expansins جدران الخلايا بسرعة استعادة قدرتها على توسيع نطاق.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin at JoVE.com

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

ندلل على استخدام القوة التمدد المستمر لقياس المدى الطويل التمديد (الزحف) من العينات النباتية جدار الخلية الناجم عن مخازن الحمضية والبروتين expansin.

قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

measuring-plant-cell-wall-extension-creep-induced-acidic-ph-alpha

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

13.9K Views.  Penn State University. ندلل على استخدام القوة التمدد المستمر لقياس المدى الطويل التمديد (الزحف) من العينات النباتية جدار الخلية الناجم عن مخازن الحمضية والبروتين expansin.

Video: Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Title Cell Encapsulation by Droplets

عنوان تغليف الخلية عن طريق الرذاذ

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

فيروس من صنع جين إسكات (VIGS) في نيكوتيانا benthamiana والطماطم

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

آغار بلوك عوالم مصغرة لتحليل الأنسجة النباتية الخاضعة للرقابة من قبل الفطريات الهوائية

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

صب وتشغيل جل البروتين عن طريق إعادة استخدام شرائط التجاري

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...