Ce travail a été soutenu par l&#39;Agence slovène pour la recherche (projet J2-9764 et le programme P2-0249). Cette vidéo présente le matériel supplémentaire pour les &quot;électroporation basée sur les technologies et traitements&quot; atelier scientifique et cours de troisième cycle, organisé par la Faculté de génie électrique à l&#39;Université de Ljubljana, en Slovénie.

I. Chargement des cellules avec les cellules et les trackers CMFDA SACSM <ol><li> Des expériences ont été réalisées sur des cellules préalablement préparé de la lignée cellulaire de souris mélanome (B16-F1). Les cellules sont cultivées dans deux flacons séparés 25 cm de la culture 2 (PPT, ZDA) à 70-80% de confluence dans un milieu de culture DMEM (milieu de Dulbecco modifié Eagle) complété avec 10% de sérum de veau fœtal, 0,15 mg / ml de L-glutamine, 16 mg / ml de gentamicine (tous de Sigma-Aldrich, Allemagne), 200 unités / ml crystacillin (Pliva, Croatie), et incubés dans 5% de CO 2 à 37 ° C. </li><li> Préparer deux solutions mères 10 mM de trackers cellulaire (Invitrogen, USA) en ajoutant 10,76 ul ul et 9 (pour le vert et le CMFDA pour Orange SACSM, respectivement) de DMSO (Sigma-Aldrich, Allemagne) à 50 pg du colorant dans l&#39;original flacon Invitrogen. La solution stock peut être stockée dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant quelques mois. Avant de commencer les expériences, de réchauffer la solution jusqu&#39;à ce que les cristaux se dissolvent de DMSO. </li><li> Préparer le bicarbonate sans tampon Krebs-HEPES (130 mM NaCl, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-glucose, 1,3 mM de CaCl2, 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,4). Dans deux tubes de 15 ml Eppendorf séparément mélange de 2,1 l de chaque solution mère (10 mM CMFDA ou CMRA, respectivement) dans 3 ml de bicarbonate sans tampon Krebs-HEPES. Cela donne une «solution de chargement&quot; contenant environ 7 uM (ou SACSM) CMFDA. </li><li> Rincer les cellules deux fois avec du bicarbonate sans tampon Krebs-HEPES, puis insérez le chargement des solutions dans les flacons. Incuber les cellules pendant 30 minutes dans 5% de CO 2 à 37 ° C. Durant cette première incubation réactifs passer librement à travers les membranes cellulaires, mais une fois dans la cellule, les réactifs sont transformés en cellules imperméants produits de la réaction fluorescente. </li><li> Après une incubation d&#39;abord, rincez et incuber les cellules avec un milieu de culture pendant deux heures dans 5% de CO 2 à 37 ° C. </li><li> Trypsiniser cellules dans les deux flacons (chargé avec CMFDA et SACSM) et mélanger les globules rouges et verts ainsi que dans un rapport 1:1 dans un tube à centrifuger de 50 ml (PPT, ZDA). Ajuster la concentration de cellules de 5 x 10 6 cellules / ml par dilution avec du milieu DMEM ou par concentration avec la centrifugeuse. Déposer une goutte 20 pl de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque 24 multipuits (PPT, ZDA). Incuber les cellules dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 20 min pour leur permettre de peu s&#39;attachent à la surface du puits et établir des contacts cellulaires. </li></ol> II. Électrofusion <ol><li> Préparer isoosomolar tampon phosphate de potassium (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl2, 250 mM de saccharose) et hypoosmolaire tampon phosphate de potassium (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM de MgCl2, 75 mM de saccharose) . </li><li> Placez le multipuits avec des cellules sur la platine du microscope, la position des électrodes au fond du puits et les connecter au générateur d&#39;impulsions. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de tampon phosphate de potassium isoosomolar. Ajouter 350 ul de tampon phosphate de potassium hypoosmolaire afin d&#39;induire un gonflement cellulaire. Le tampon devrait couvrir les électrodes. </li><li> Laisser les cellules dans un tampon de hypoosmolaire pendant 2 minutes avant d&#39;appliquer des impulsions électriques. Durant cet afflux de temps des molécules d&#39;eau dans les cellules en raison d&#39;un déséquilibre osmotique entre l&#39;intérieur et l&#39;extérieur des cellules provoque une augmentation du volume cellulaire. Impulsions électriques doivent être appliqués lorsque les cellules sont proches de leurs volumes maximum, avant le début diminuer le volume de la réglementation. </li><li> Pour atteindre et maintenir électrofusion optimale la viabilité des cellules, les paramètres optimaux d&#39;impulsions électriques doivent être utilisés. Celles-ci dépendent lignée cellulaire utilisée [1]. Dans cette expérience, un train de 8 impulsions rectangulaires (chacune avec une durée de 100 ms à 1 Hz) est appliquée à chaque échantillon, en utilisant un dispositif d&#39;électroporation (dans notre cas, Cliniporator, IGEA, Italie). Les impulsions sont délivrées à deux électrodes parallèles de fil de Pt / Ir de 0,8 mm de diamètre et 5 mm de distance entre eux, créant un champ électrique d&#39;environ 1200 V / cm entre les électrodes dans chaque puits, sauf pour le contrôle du puits. </li><li> Laisser les cellules au repos pendant 10 minutes après la livraison du pouls. Déterminer le rendement de fusion par le biais de la microscopie fluorescente et de contraste de phase. </li></ol> III. L&#39;acquisition d&#39;images et de la détermination du rendement de la fusion <ol><li> Les cellules sont observées en utilisant un microscope à fluorescence (dans notre cas Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Allemagne) équipé d&#39;un objectif (x20) et une caméra CCD refroidie (VisiCam 1280, Visitron, Allemagne). Les images sont acquises en MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), mais d&#39;autres logiciels d&#39;acquisition similaire peut également être utilisé. CMFDA est excité par un monochromateur (Polychrome IV, Visitron, Allemagne) à 492 nm et 548 nm au SACSM. La fluorescence de CMFDA et SACSM est acquise au moyen de deux filtres d&#39;émission, l&#39;un centré à 535 nm (HQ535/30m, pour CMFDA) et l&#39;autre centrée à 510 nm (D605/55m, pour CARM, tant Chroma, USA). L&#39;utilisation de miroir dichroïque (Q515LP) a empêché la diaphonie de canal. </li><li> L&#39;acquisition de trois images (contraste de phase, la fluorescence rouge et verte) pour cinq champs choisis au hasard dans chaque puits. Créer trois images de canal de chaque triplet d&#39;images. Dans l&#39;image telle cytoplasme fluorescent peut être vu avec les membranes cellulaires. Les cellules fusionnées peuvent ainsi être facilement déterminée [Figure 1]. </li><li> Compter toutes les trois types de cellules (rouge, vert et doublement fluorescents) dans chaque image à trois canaux. Déterminer le pourcentage de cellules fluorescentes doublement en divisant le nombre de cellules fluorescentes doublement du nombre de toutes les cellules de chaque image. Fusion de rendement est défini comme le pourcentage de cellules fluorescentes doublement multiplié par 2 puisque la moitié des cellules fusionnées ne sont pas détectés (lorsque les cellules du fusible de même couleur). </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 Trois images de microscopie canal de cellules B16F1 après électrofusion:. Contraste de phase, SACSM de fluorescence (excitation à 548 nm) et CMFDA fluorescence (excitation à 492 nm), grossissement de l&#39;objectif 20x

<ol>
	<li>&#268;emazar, M., Jarm, T., Miklav&#269;i&#269;, D., Ma&#269;ek-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Ser&#353;a, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro.">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li><li>Trontelj, K., Reber&#353;ek, M., Kandu&#353;er, M., &#269;urin &#353;erbec, V., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells.">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li><li>Rols, M. -. P., Teissi&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure.">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li><li>Neil, G., Zimmermann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrofusion.">Electrofusion.</a> Methods in Enzymology. 220, 174-196 .</li><li>Abidor, I. G., Li, L. -. H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+cell+pellets:+II.+Osmotic+properties,+electroporation,+and+related+phenomena:+Membrane+interactions.">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li><li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion.">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li><li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissi&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters.">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li><li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip.">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li><li>U&#353;aj, M., Trontelj, M., Kandu&#353;er, M., Miklav&#269;i&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization.">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li><li>Teissi&#233;, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes.">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li></ol>

La capacité des membranes cellulaires de fusionner de manière non spécifique, par exemple, par des champs électriques extérieurs, est important pour les biotechnologies, la médecine et la recherche en biologie. Ces non-spécifique de fusion permet de produire des cellules hybrides très précieux et leurs produits, tels que les anticorps monoclonaux, et fournit des informations sur les mécanismes fondamentaux de la fusion [2]. Électrofusion est une méthode potentiellement très efficace, car elle peut être correctement ajusté pour différents types de cellules. Électrofusion est atteint lorsque les cellules en contact physique étroit sont amenés dans leur état fusogène (sujettes à la fusion) au moyen d&#39;impulsions à haute tension électrique. L&#39;efficacité de l&#39;électrofusion dépend de divers paramètres qui affectent les deux parties du processus d&#39;électrofusion. Première partie du processus de électrofusion est d&#39;obtenir la contact physique étroit entre les cellules, qui peuvent être obtenues avec différentes méthodes [3-8]. Méthode de l&#39;adhésion (cellules en croissance jusqu&#39;à la confluence) peuvent être utilisés efficacement en raison de contacts cellulaires spontanément établies dans les zones de grandes entre les cellules, mais il produit de très grandes cellules fusionnées avec de nombreux noyaux. Nous utilisons la méthode de l&#39;adhésion modifiés, où des cellules plus petites (de 2 à 5 noyaux), qui sont plus susceptibles de survivre et de proliférer, sont obtenus (figure 1). Le contact entre les cellules bénéficient également d&#39;un gonflement osmotique des cellules, due à un traitement osmotique utilisé dans l&#39;expérience [9]. Deuxième partie du processus de électrofusion est la réalisation de l&#39;état fusogène des membranes cellulaires. Etat fusogène corrèle bien avec l&#39;état electropermeabilized de la membrane (cellules ne sont pas spécifiquement perméabilisées à des molécules qui normalement ne peuvent pas traverser la membrane intacte) et est régie par les mêmes paramètres des impulsions électriques (amplitude, durée, nombre et fréquence) [10] . Les valeurs des paramètres électriques nécessaires pour l&#39;électroporation optimale [1] et électrofusion diffèrent entre les différentes cellules et dépendent de la taille des cellules et leurs propriétés biologiques. Les paramètres électriques ont donc besoin d&#39;être optimisé pour différentes lignées cellulaires, qui sont utilisés en tant que partenaires de fusion, pour obtenir la fusion.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CMRA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C34551</td>
<td>Cytosolic fluorescent dye</td>
</tr>
<tr>
<td>CMFDA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C7025</td>
<td>Cytosolic fluorescent dye</td>
</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>D5671</td>
<td>Dulbecco's modified Eagle's medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal calf serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>crystacillin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pliva</td>
<td>625110</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G1397</td>
<td>antibiotic</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H0887</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Merck </td>
<td>A124873 927</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>4248</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M-8266</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>71382</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Merck</td>
<td>A154336 908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M2643</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C4901</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>sucrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>16104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electric pulse generator</td>
<td>Tool</td>
<td>Igea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cliniporator VITAE</td>
</tr>
<tr>
<td>Multiwell plate</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>92424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tube</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>91050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tube</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 cm2 culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>TPP</td>
<td>90026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>Tool</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pt/Ir</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cell electrofusion visualized with fluorescence microscopy

Électrofusion cellulaire est une méthode sûre et non-viraux et non-chimiques qui peuvent être utilisés pour la préparation de cellules hybrides pour la thérapie humaine. Électrofusion implique l&#39;application de courtes impulsions à haute tension électrique aux cellules qui sont en contact étroit. Application de courtes impulsions électriques de haute tension provoque la déstabilisation de la membrane plasmique des cellules. Déstabilisé membranes sont plus perméables aux molécules différentes et également sujettes à la fusion avec toute membranes voisins déstabilisés. Électrofusion est donc une méthode pratique pour réaliser une fusion non-spécifique de cellules très différentes<em&gt; In vitro</em&gt;. Afin d&#39;obtenir des membranes de fusion cellulaire, déstabilisé par un champ électrique, doit être en contact étroit pour permettre la fusion de leurs bicouches lipidiques et par conséquent leur cytoplasme. Dans cette vidéo, nous démontrons électrofusion efficace des cellules<em&gt; In vitro</em&gt; Par le biais de la méthode de l&#39;adhésion modifiés. Dans cette méthode, les cellules sont autorisés à joindre que légèrement à la surface du puits, de sorte que le milieu peut être échangé et les cellules conservent encore leur forme sphérique. Fusion de visualisation est évalué par le pré-étiquetage du cytoplasme des cellules avec différents colorants fluorescents Tracker cellule; la moitié des cellules sont marquées à l&#39;orange SACSM et l&#39;autre moitié avec du vert CMFDA. Fusion de rendement est déterminé comme étant le nombre de cellules fluorescentes doublement divisée par le nombre de toutes les cellules multipliées par deux.

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Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Dans cette vidéo, nous démontrons électrofusion efficace des cellules<em&gt; In vitro</em&gt; Par le biais de la méthode de l&#39;adhésion modifié en utilisant l&#39;électroporation et la détection ultérieure de la visualisation des cellules fusionnées avec la microscopie à fluorescence.

Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

cell-electrofusion-visualized-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K vues.  University of Ljubljana. Dans cette vidéo, nous démontrons électrofusion efficace des cellules In vitro Par le biais de la méthode de l'adhésion modifié en utilisant l'électroporation et la détection ultérieure de la visualisation des cellules fusionnées avec la microscopie à fluorescence.

Vidéo: Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Recherche

Biologie

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

La libération de dopamine au niveau individuel terminaisons présynaptiques visualisées avec FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Fiche Fluorescence Microscopy Lumière de racines de plante qui pousse sur la surface d&#39;un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Électrofusion cellulaire visualisé par microscopie à fluorescence

Résumé

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Visualisation de la réplication d'ADN molécule unique par microscopie à fluorescence