للبدء ، قم بزرع 200 ميكرولتر من 10،000 خلية سرطانية كبدية في صفيحة بئر 96 مع DMEM و 10٪ FBS. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استبدل وسائط الثقافة وعالج الخلايا بتركيزات متفاوتة من بيروكسيد الهيدروجين والميناديون.
حل خمسة ملليغرام من DHE في ملليلتر واحد من DMSO. بالنسبة لحل العمل ، قم بتخفيف حصة 100 ميكرومول مع وسائط DMEM الدافئة مسبقا إلى تركيز 10 ميكرومول. دوامة محلول صبغة العمل لمدة 5 إلى 10 ثوان لضمان الخلط المناسب.
الآن قم بإزالة وسائط الاختبار من كل بئر قبل الوقوف على خلايا السرطان. ثم اغسل كل بئر برفق باستخدام برنامج تلفزيوني. ماصة 100 ميكرولتر من محلول صبغة العمل في كل بئر.
احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على DHE من كل بئر. استخدم ماصة متعددة القنوات لغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
الآن ، ماصة 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على صبغة تلطيخ نووية Hoechst 33342 في كل بئر. بعد الحضانة ، انقل اللوحة إلى منصة فحص عالية المحتوى. قم بتشغيل برنامج فحص المحتوى العالي Cellomics CX7.
معايرة منصة التصوير وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. افتح معلمات النظام الخاصة بالعلامة التجارية للوحة في قاعدة بيانات الجهاز. بعد ذلك ، ضع اللوحة بعناية مع العينات على المرحلة الساخنة من نظام التصوير.
تأكد من وضع اللوحة بإحكام وفي الاتجاه الصحيح. ثم اضغط برفق على الصفيحة الدقيقة للتأكد من استقرارها بشكل مسطح على المسرح. بمجرد وضع اللوحة بشكل صحيح ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح التحكم.
ثم انقر فوق التحكم و OK لفتح مربع حوار تحميل / تفريغ اللوحة. لتحديد معلمات التصوير ، افتح وضع التنشيط المستهدف في واجهة Cellomics Bioapplications. إنشاء بروتوكول جديد للحصول على البيانات ثنائية القناة متوافق مع التلوين النووي ومسبار DHE الفلوري.
بعد ذلك ، حدد الأهداف المطلوبة للحصول على الصورة ، ثم اختر التكبير المناسب. الآن حدد وقت التعرض وثني الكاميرا والفاصل الزمني لمكدس z. بمجرد تعيين معلمات التصوير ، حدد كائن التتبع الأساسي محل الاهتمام باستخدام الخوارزميات المختلفة في الجهاز.
بعد تقسيم الكائن المحدد، تحقق من صحة الكائن الأساسي استنادا إلى معلمات الحجم والشكل والشدة المحددة الفريدة لكل نوع خلية. حدد منطقة الاهتمام حول الكائن واضبط دائرة 20 ميكرومتر حوله. انقر فوق علامة التبويب توصيف السكان ، ثم اضبط حد الفحص على 1000 خلية لكل بئر بحد أدنى 10 كائنات لكل حقل.
انقر الآن على Launch View لمسح كل لوحة بئر. ثم قم بتشغيل برنامج تحليل العرض وتصدير معلمات البيانات الكمية بتنسيق CSV لإجراء تحليل إضافي. أدى التعرض للبيروكسيد إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في التألق الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية عبر جميع خطوط الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة.
مع menadione ، أظهرت خلايا JHH-4 زيادة تعتمد على الجرعة في شدة الفلورسنت. ومع ذلك ، لوحظ الفرق الكبير في التألق فقط عند تركيزات أعلى في خطي الخلية الآخرين.
