ويمكن استخدام هذا البروتوكول لقياس عدد المواقع المضادة للضداد على مستقبلات الخلوية من الفائدة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج نتائج قوية، حتى بالنسبة للمستقبلات التي يعبر عنها بكثافة منخفضة. هذه الطريقة تمكن من تقييم الحد من CR1 التعبير الكريات الكرسيه وهذا هو مثل مرض الزهايمر, الذئبة الحمامية الجهازية, الإيدز, والملاريا.
هذا البروتوكول مفيد لأي تحليل كثافة مستقبلات الخلايا ويمكن أيضا أن تطبق على دراسة تعبير مستقبلات الخلايا عن طريق المجهر fluorescence. نوصي بتباعد الأنابيب أثناء توزيع الخلايا والأجسام المضادة، وأن يكون مصحوبًا بأخصائي قياس الخلايا أثناء التحليل الأول إن أمكن. إن البرهان المرئي على القياس الكمي للمناعة والكثافة حسب قياس التدفق هو أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية تعيين معلمات التحليل بشكل صحيح.
قبل البدء في التحليل، إضافة 250 ميكرولترات من الصوديوم EDTA تخثر الدم كله من أنابيب تخزين الدم في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على 20 ملليلتر من أربع درجات مئوية PBS-BSA. اخلط محتويات الأنبوب عن طريق انعكاس لطيف وتدور الخلايا عن طريق الطرد المركزي. استخدام ماصة 10 ملليلتر لتجاهل عظمى وإعادة تعليق بعناية بيليه في حجم المتبقية من الحل.
إضافة 20 ملليلتر من PBS-BSA الباردة والطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. في نهاية الطرد المركزي، ضع الأنبوب في رف، يوضع على الجليد وينقل ثمانية ميكرولترات من كريات الدم الحمراء المغسولة إلى أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلترات من PBS-BSA. ثم اخلط كريات الدم الحمراء بلطف عن طريق الغزل للحصول على تعليق الخلية المتجانسة.
بالنسبة لمعالجة مناعة كريات الدم الحمراء، قم بنقل 100 ميكرولترات من كريات الدم الحمراء المخففة بعناية إلى أنابيب فردية 1.5 ملليلتر وجمع خلايا الدم الحمراء عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من المواد الخارقة ، قم بإضافة 20 ميكرولترات بعناية من 0.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر تركيز من الأجسام المضادة للـ CR1 J3D3 في PBS-BSA ، مباشرة إلى كل بيليه. إضافة 20 ميكرولترات من PBS-BSA العازلة وحدها إلى خلايا التحكم السلبية مع خلط لطيف واحتضان العينات لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية.
في نهاية الحضانة، وغسل العينات مرتين مع 750 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد-BSA لكل أنبوب، في غسل. بعد الغسيل الثاني، إضافة 20 ميكرولترات من واحد إلى 10 تخفيف من streptavidin فيكويريثيرين في PBS-BSA إلى كل أنبوب مع خلط لطيف، واحتضان العينات لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، وغسل العينات مرتين ، كما هو موضح.
بعد الغسيل الثاني، قم بإصلاح كل بيليه عينة خلية مع 450 ميكرولترات من عازل التثبيت أثناء الدوامة، قبل نقل كل عينة إلى أنابيب أسفل مستديرة خمس ملليلتر فردية لمدة تصل إلى 48 ساعة من التخزين عند أربع درجات مئوية. لتحليل كريات الدم الحمراء المثبطة للانسياب، انقر زر التجربة الجديد في مقياس التدفق، ثم أعد تسمية التجربة الجديدة. حدد التشتت الأمامي، والتشتت الجانبي، والـPE في نافذة إعدادات مقياس المقاييس.
في التجربة المفتوحة، حدد إعدادات إعدادات مقياس البيانات cytometer إعدادات التطبيق وإنشاء ورقة عمل عمومية، وذلك باستخدام مربعات رمادية وتقاطع الشعر لتوجيه التحسين. عندما تم تعيين كل من المعلمات، تحميل أنبوب التحكم غير المطّط على مقياس السيتومي وتشغيل عملية الاقتناء، وتحسين الفولتية إلى الأمام والجانب مبعثر للقضاء على الحطام وضمان أن السكان من الفائدة على نطاق واسع. المقبل، رسم بوابة حول خلايا الدم الحمراء على المؤامرة إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر وعرض السكان خلايا الدم الحمراء في مؤامرة نقطة من الفلورس PE.
إذا كانت السكان إيجابية على نطاق، تحميل أنبوب التحكم الملون على مقياس السيمتر وتشغيل عملية الاستحواذ. لتسجيل العينات وتحليلها، قم بتفريغ العينة الملطخة وإنشاء مخطط مبعثر أمامي مقابل جانبي ومرسم مدرج تكراري للفلوروس PE على ورقة عمل عالمية جديدة. تحميل العينة الأولى على مقياس الخلايا، تشغيل اقتناء ورسم بوابة خلايا الدم الحمراء حول كريات الدم الحمراء في مؤامرة إلى الأمام مقابل الجانب مبعثر.
عرض مجموعة خلايا الدم الحمراء في الرسم البياني للفلورس PE وتحت علامة تبويب الإحصاءات، حدد المتوسط لمعلمات الفلورس في PE على مجموعات خلايا الدم الحمراء. في لوحة معلومات الامتلاك، حدد كافة الأحداث في بوابة الإيقاف و 10,000 حدث لتسجيلها، ثم انقر فوق تسجيل البيانات. عندما يتم تسجيل الحدث، قم بإزالة الأنبوب من مقياس الصوت.
يجب أن تبدو مخططات ورقة العمل العمومية كما هو موضح. تحليل تدفق الخلايا cytometric من الدمى الحمراء المثبطة للمناعة من ثلاثة مواضيع من الكثافة CR1 المعروفة يسمح قياس شدة الفلورس المتوسطة للتسمية لكل موضوع. يسمح رسم منحنى باستخدام قيم الموضوع مع الكثافة المعروفة للCR1 الكريت الكرسيه الكريت هذه البيانات أن يتم الإبلاغ عنها كدالة من شدة الفلورسيه المتوسط.
مقارنة خط الانحدار الناتج عن هذا المنحنى إلى قيم متوسط كثافة الفلورانس من المواضيع الأخرى تسمح بتحديد كثافة الكرسى CR1 الخاصة بهم. يجب الحرص على أن يتم توزيع كريات الدم الحمراء والأجسام المضادة بشكل صحيح، وبالتالي فإن منحنيات المعايرة للعينات المجربة على التحكم السلبي تقع ضمن نطاق إعدادات مقياس الخلايا. من الممكن تكييف هذا الإجراء لقياس المستقبلات الخلوية الأخرى الكثافة ، ببساطة عن طريق تغيير الأجسام المضادة الأولية و / أو تكييف طبقات التضخيم.
كلما كنت التعامل مع الدم، وهناك خطر التلوث المسببة للأمراض. لذلك، تأكد من استخدام الممارسات المختبرية الجيدة وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
