La publication de cet article a été soutenu par une subvention du Bureau de la recherche à l&#39;Université du Tennessee. Les auteurs remercient la génération précédente d&#39;étudiants et de chercheurs qui ont travaillé à affiner ces procédures. La recherche a été soutenue par des subventions de la National Science Foundation (NSF-0851113, 0825405 et NSF NSF-0550485).

1. L&#39;ultrafiltration d&#39;eau de mer pour générer des «virus-free&quot; Eau (Wilhelm &amp; Poorvin 2001) <ol><li> Environ 20L d&#39;eau de mer / eau de lac est recueilli comme aseptiquement que possible. </li><li> L&#39;eau est en série préfiltrée par 142 mm de diamètre en polycarbonate 0,8 um filtres qui peuvent être conservés à -20 ° C pour l&#39;analyse de la communauté. Agrandir la taille des pores des filtres peuvent être utilisés avant cette étape pour les systèmes très productifs. </li><li> Pour obtenir de l&#39;eau ultra filtrée à partir d&#39;un système de Amicon M12 (Millipore) une cartouche 30 kDa spirale de coupure est utilisé pour exclure tous les virus, même de petits virus à ARN. </li><li> Les échantillons sont traités et concentrés à la vitesse ~ ~ 25% avec 15 à 16 kPa de contre-pression. </li><li> Le reste de l&#39;échantillon de ~ 500 mL d&#39;eau contiennent une communauté virus concentré (qui peuvent être sauvegardées pour d&#39;autres expériences) alors que les autres 19,5 L de virus sans eau sera utilisée pour des essais de production virale. </li><li> Après chaque journée d&#39;utilisation, le M12 Amicon système doit être nettoyé pour éviter d&#39;endommager la membrane de la cartouche filtrante. </li><li> Si vous travaillez avec l&#39;eau de mer, rincer la membrane avec moins de 6L eau Milli-Q suivie d&#39;un lavage avec une solution de NaOH 0,1 N pendant 30-45 minutes. </li><li> Encore une fois rincer la cartouche avec au moins 6L d&#39;eau Milli-Q. </li><li> Lorsque vous avez terminé l&#39;utilisation du système M12, la cartouche en spirale doit être stocké dans un 0.05MH 3 PO 4 à 4 ° C. </li></ol> 2. Méthode de réduction des virus pour la production virale (Wilhelm et al. 2002) <ol><li> Jusqu&#39;à 500 mL de l&#39;échantillon d&#39;eau de mer / eau de lac à la fois avec l&#39;hôte et les virus est obtenue et placée dans une unité de sterifilter avec un 0,2-um nominale des pores de taille faible liaison aux protéines de filtre (par exemple, Durapore) placée sur elle. </li><li> L&#39;échantillon est délicatement à vide sous pression à &lt;200 mmHg tout en continuant à remettre en suspension l&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert stérile pour inhiber les cellules bactériennes de se concentrer sur le filtre. </li><li> Lentement trois volumes d&#39;ultrafiltrat sont ajoutés à la suspension bactérienne de réduire significativement le nombre de virus libre dans l&#39;échantillon. </li><li> La fraction bactérienne est diluée à 500 mL de retour avec le virus sans eau et divisée en trois répétitions de 150 ml chacun et sont placés dans des bouteilles en polycarbonate 250ml. </li></ol> 3. Tangentielle filtration à courant (FFT) Méthode pour la production virale (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005) FFT représente une approche alternative à la méthode de réduction virale. <ol><li> Environ 500 ml d&#39;échantillon naturel est recueilli comme décrit ci-dessus. </li><li> Cet échantillon est concentrée en utilisant un 0,2-um nominale des pores de taille du système de filtration tangentielle débit. </li><li> Lorsque la fraction bactérienne est réduite à environ 10-15 ml, ultrafiltré, sans virus, l&#39;eau est ajoutée et distribués comme ci-dessus. </li><li> Les bouteilles sont incubées à reproduire les conditions in situ en utilisant des chambres de l&#39;environnement. <ol><li> Les niveaux d&#39;éclairage sont modifiés pour les conditions de surface en utilisant l&#39;acrylique bleuté clair avec acrylique ou de dépistage nette pour diminuer l&#39;intensité lumineuse. </li><li> Températures de surface ambiantes sont souvent obtenus en utilisant une eau de mer coule le pont d&#39;incubateur. </li></ol></li><li> Les échantillons pour les estimations de l&#39;abondance bactérienne et virale sont prises à l&#39;instant 0 avec une concentration finale de glutaraldéhyde stériles 2,0-2,5% ajoutés dans des cryotubes. Ces échantillons sont immédiatement surgelés à l&#39;azote liquide et conservés congelés jusqu&#39;à leur transformation. <ol><li> Si l&#39;azote liquide n&#39;est pas disponible, lames de microscopie peuvent être préparées et traitées immédiatement (voir la procédure ci-dessous) </li></ol></li><li> Des sous-échantillons sont prélevés toutes les 2,5 heures pendant au moins 10 heures par la méthode décrite ci-dessus. <ol><li> A ce moment l&#39;eau peuvent être prélevés pour l&#39;analyse PCR quantitative. Jusqu&#39;à 5 mL de l&#39;échantillon peut être ajouté à un cryovial sans agent fixateur avec la congélation instantanée immédiate dans l&#39;azote liquide. </li></ol></li></ol> 4. Microscopie production virale (Noble &amp; Fuhrman 1998, Wen et al. 2004) <ol><li> Les échantillons congelés à 0,02 um-filtrés pour la microscopie doivent être décongelées sur glace. </li><li> Préparer une solution stock de SYBR Green en diluant la solution stock 1:10 avec de l&#39;eau stérile. Ensuite, à partir de la solution mère, préparer une solution de travail en ajoutant 1 mL de la solution stock à 39 mL d&#39;eau stérile. Un glycérol 50%, 50% de phosphate solutions salines tamponnées (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% de NaCl, pH 7,5) et une nouvelle solution stock de 2,5% de la p-phénylènediamine devrait également être préparée avant de commencer. Gardez la solution à 50% glycerol/50% de PBS à 4 ° C et le p-phenylenediamStock ine à -20 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce départ. Juste avant de filtrage ajouter la p-phénylènediamine de la PBS 50% glycerol/50% à une concentration finale de 0,1% à être utilisé comme solution Antifade. </li><li> Placez un filtre 25 mm Anodisc 0,02 um sur le sommet d&#39;une MicronStep 0,45 um, filtre soutien cellulosique. Ajouter 850 uL de l&#39;échantillon fixé sur le haut de la Anodisc et vide à 20 pKa jusqu&#39;au séchage complet. Placer 100 ul de solution de travail SYBR Green à une boîte de Pétri stérile et, avec le vide encore, retirer délicatement le Anodisc de la tour de filtre et le placer sur le vert de SYBR. Incuber les échantillons dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Retirer soigneusement le filtre de la solution de SYBR Green et la mèche à l&#39;arrière du filtre avec un Kimwipe pour supprimer tous les résidus de colorant. Si désiré, le retour du filtre à la tour et de passer jusqu&#39;à 800 uL d&#39;eau filtrée 0,02 um ou des médias à travers le filtre stérile à rincer excès de colorant. </li><li> Ajouter une petite goutte de solution Antifade une lame de microscope et placer une lamelle sur le dessus. Retirer la lamelle et ajouter le filtre séché à la lame de microscope humides avec la solution Antifade. Encore une fois, ajoutez une petite quantité de solution à l&#39;Antifade lamelle et lentement le placer sur le dessus du filtre, en veillant à se débarrasser de toutes les bulles qui peuvent se former. </li><li> Geler immédiatement les diapositives à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire (elles devraient être utilisées dans quelques mois pour éviter la décoloration et abaissé compte virus) </li><li> Les virus sont dénombrés à l&#39;aide de microscopie par fluorescence (dans notre cas un microscope Leica DMRXA) avec un large éventail de filtre bleu (λ ex = 450 à 490 nm, λ em = 510 nm avec un filtre de suppression à λ = 510 nm). Chaque filtre aura au moins 20 champs de vue compté, en veillant à quantifier virus total de chaque grille de champ pour assurer une distribution de virus à travers la membrane du filtre. </li><li> Taux en moyenne de réapparition du virus de l&#39;indépendance trois répétitions sont alors calculées et un écart-type est déterminé à partir des taux de production. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Les données brutes recueillies par le chercheur requiert un minimum de traitement mathématique pour générer des taux de réapparition de l&#39;abondance du virus. L&#39;ensemble de données primaires issues de cette étude est le taux de réapparition de l&#39;abondance du virus dans les sous-échantillons à partir des incubations. Ces résultats sous forme de régressions indépendante du temps vs virus de l&#39;abondance pour chacun des échantillons. Pour chaque échantillon, les incubations individuelles agissent comme un traitement, afin d&#39;achever trois répliquent-incubations le chercheur peut calculer les taux ainsi que l&#39;estimation de la variation (par exemple, l&#39;écart-type) (voir figure 1). Une mise en garde de ce processus est que la réduction de l&#39;abondance du virus invariables conduit à une réduction dans les cellules hôtes dans l&#39;échantillon qui ont la charge virale. Pour compenser cette perte, l&#39;énumération de l&#39;abondance bactérienne à la fois de la source (eau de mer non filtrée ou de l&#39;eau du lac) et l&#39;échantillon T = 0 d&#39;incubation sont nécessaires. Cette information peut être utilisée pour comptabiliser le pourcentage de cellules perdues: en supposant que le processus de réduction de l&#39;abondance du virus n&#39;est pas sélectif pour ou contre des membres de la communauté microbienne, ce facteur peut alors être utilisée pour estimer le taux de production in situ de virus . <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La production d&#39;échantillons de virus-like particles sur une incubation de 10 heures à des conditions in situ en utilisant la microscopie à épifluorescence. Ont été recueillies lors d&#39;un bloom phytoplanctonique au large des côtes de la Nouvelle-Zélande en Septembre 2008. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma du processus de flux de travail pour le dosage de la production de virus. Le processus commence par l&#39;ultrafiltration de l&#39;eau pour générer de l&#39;échantillon sans virus eau. Ceci est complété en utilisant un système d&#39;ultrafiltration. Dans les échantillons d&#39;eau parallèles sont collectées à partir du même site et les virus sans passé par un filtre alors que la communauté microbienne (contenant un mélange de cellules infectées et non infectées) est conservée. Cette communauté est alors remis en suspension dans l&#39;eau contient aucun virus et incubés dans des conditions in situ. Le taux de réapparition de virus est ensuite contrôlée pour les 10 prochaines heures pour déterminer les taux de production du virus.

<ol>
	<li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean.">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li><li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria:+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter.">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems.">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li><li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+release+of+Fe+and+its+bioavailability+to+marine+plankton.">Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton.</a> Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 .</li><li>Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constraints+on+virus+production+in+the+Sargasso+Sea+and+North+Atlantic.">Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic.</a> Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+prokaryotic+viruses.">Ecology of prokaryotic viruses.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).</li><li>Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency,+size+and+distribution+of+bacteriophages+in+different+marine+morphotypes.">Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes.</a> Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).</li><li>Weinbauer, M. G., Winter, C., H&amp;ouml, f. l. e., G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities.">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li><li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy.">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li><li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dilution+technique+for+the+direct+measurement+of+viral+production:+a+comparison+in+stratified+and+tidally+mixed+coastal+waters.">A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters.</a> Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).</li><li>Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freshwater+and+marine+virioplankton:+a+brief+overview+of+commonalities+and+differences.">Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences.</a> Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).</li><li>Wilhelm, S. W., Poorvin, L., Paul, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantification of algal viruses in marine samples. , 53-66 (2001).</li><li>Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+and+nutrient+cycles+in+the+sea.">Viruses and nutrient cycles in the sea.</a> Bioscience. 49, 781-788 (1999).</li><li>Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sunlight+in+the+removal+and+repair+of+viruses+in+the+sea.">The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea.</a> Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).</li><li>Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+flow+diafiltration:+an+improved+technique+for+estimation+of+virioplankton+production.">Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).</li></ol>

Un élément essentiel dans l&#39;influence de comprendre comment les virus communautés microbiennes marines est de déterminer la vitesse à laquelle particule virale sont produites. Étant donné que les abondances sont (plus ou moins) dans la plupart des systèmes statiques (Wilhelm &amp; Suttle 1999, Weinbauer 2004), et que les virus sont supprimés ou rendus non infectieux plus rapidement dans les systèmes aquatiques (Wilhelm et al. 1998), puis les taux de production doit être relativement rapide pour remplacer les particules perdues. L&#39;estimation de la mortalité des virus cause à la communauté microbienne nécessite une connaissance de la façon dont de nombreux virus sont produits à chaque fois un virus lyse d&#39;une cellule (la &quot;taille de rafale&quot;). Tailles irruption du virus dans des échantillons naturels peuvent varier considérablement. Tailles Burst peut être déterminée directement par microscopie électronique en transmission (par exemple, Weinbauer &amp; Peduzzi 1994), mais cela est souvent au-delà des capacités d&#39;un laboratoire donné ou pas toujours pratique. Dans les situations où ils ne peuvent pas être déterminée empiriquement, valeurs de la littérature de 24 virus par événement lytique peut être utilisé pour les systèmes marins et 34 pour les systèmes d&#39;eau douce (Parada et al. 2006). Si le taux de production de virus est divisé par ce nombre, le résultat est l&#39;abondance de cellules par volume détruit par un virus sur une base quotidienne. Les microbes lysées valeur peut alors être divisée par le stock permanent de l&#39;abondance bactérienne résultant de la mortalité du virus induit pour le système en question: en vigueur les estimations vont de quelques pour cent à près de toute la population et sont souvent dépendants d&#39;autres facteurs dans le système en question (Wilhelm &amp; Matteson 2008). Pour déterminer le pourcentage de la mortalité totale ce nombre est souvent multiplié par deux (de travail de l&#39;hypothèse que 50% des cellules passer à reproduire et à 50% des cellules sont perdues, Weinbauer 2004). Étant donné que la biodisponibilité des nutriments et oligo-éléments (par exemple, N, P, Fe) peut limiter le taux de productivité primaire, et en tant que flux de carbone, par l&#39;intermédiaire de systèmes aquatiques, et la compréhension du rôle de la mortalité microbienne virus conduit dans ce processus est devenu d&#39;intérêt pour les géochimistes marins. Plusieurs estimations existent actuellement, qui suggèrent virus libérer une forte concentration d&#39;éléments nutritifs vers la colonne d&#39;eau sur une base quotidienne (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) et que ces éléments sont rapidement assimilés par la communauté microbienne (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Le taux de flux de nutriments dans l&#39;environnement peut être déterminé en multipliant le nombre de cellules détruites par la quantité de nutriments par cellule (notée «quotas»). Cette information peut fournir un élément essentiel à notre compréhension de la façon dont les réseaux trophiques microbiens fonctionner à travers les systèmes aquatiques. Les évolutions en cours: Les efforts actuels par une série de groupes de recherche concernent l&#39;adaptation de la stratégie ci-dessus pour énumérer les virus spécifiques à l&#39;intérieur de la communauté et, comme tels, afin de déterminer comment les organismes spécifiques sont influencées par l&#39;activité des virus. Pour ce faire les chercheurs utilisent la réaction en chaîne polymérase quantitative (qPCR) pour estimer l&#39;abondance des groupes de virus spécifiques ou des familles en parallèle pour les estimations de la communauté de virus total. Les résultats sont ensuite directement appliquées à fournir des estimations de la mortalité du virus, renouvellement des nutriments, etc pour les groupes planctoniques spécifiques. Cette approche nouvelle et puissante permettra aux chercheurs dans les prochaines années pour creuser plus profondément dans les processus liés à l&#39;écologie du virus et, pour la première fois, de quantifier les interactions spécifiques du virus-hôte des communautés au-delà des contraintes des systèmes de laboratoire.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2.5% p-phenylenediamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>130575000</td>
<td>Stock for Antifade</td>
</tr>
<tr>
<td>Amicon Proflux M12 system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>N/A</td>
<td>Any ultrafiltration device may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>SYBR Green I nucleic acid gel stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helicon S10 30kDa Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>CDUF010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pelicon XL filters 0.22 &mu;m</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>PXGVPPC50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE 0.2 &mu;m PCTE membrane filters (47mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-732-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>XX42LSS11</td>
<td>Other TFF systems may be used for this step</td>
</tr>
<tr>
<td>0.45 &mu;m Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>E04WP02500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GE Whatman 0.02 &mu;m Anodisc filters (25mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>68-09-6002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leica DMRXA microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>20L polycarbonate carboys</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP229-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS (0.05 M Na2HPO4, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP329-500, S640-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>G151-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-71</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>09-761-74</td>
<td>Any cryovials may be used</td>
</tr>
<tr>
<td> 85% H3PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A242-212</td>
<td>Spiral Membrane storage</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOH pellets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>S318-3</td>
<td>M12 cleaning</td>
</tr>
<tr>
<td>Graduated Cylinders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isopore 0.8-&mu;m pore-size membrane filter (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ATTP14250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>YY30 090 00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

estimating virus production rates in aquatic systems

Les virus sont des éléments omniprésents des systèmes marins et d&#39;eau douce, et sont connus pour être des agents significative de la mortalité microbienne. Développer des estimations quantitatives de ce processus est essentiel que nous pouvons alors développer de meilleurs modèles de la structure des communautés microbiennes et la fonction ainsi que progresser notre compréhension de comment les virus de travail pour modifier les cycles biogéochimiques aquatiques. La technique de réduction des virus permet aux chercheurs d&#39;estimer la vitesse à laquelle les particules virales sont libérées de la communauté microbienne endémique. En bref, l&#39;abondance de la libre (extracellulaire) virus est réduite dans un échantillon alors que la communauté microbienne est maintenue à la concentration ambiante proche. La communauté microbienne est ensuite incubée en l&#39;absence de virus libre et la vitesse à laquelle virus se reproduisent dans l&#39;échantillon (par le biais de la lyse des membres qui sont déjà infectés de la communauté) peut être quantifiée par microscopie à épifluorescence ou, dans le cas des virus spécifiques, quantitatifs PCR. Ces taux peuvent ensuite être utilisés pour estimer le taux de mortalité microbienne due à la lyse cellulaire médiée par le virus.

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Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Le taux de rotation du virus dans les systèmes marins et d&#39;eau douce peut être estimée par une réduction et la technique ne se reproduise. Les données permettent aux chercheurs de déduire les taux de mortalité microbienne virus de médiation dans les systèmes aquatiques.

Estimation des taux de production de virus dans les systèmes aquatiques

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K vues.  University of Tennessee. Le taux de rotation du virus dans les systèmes marins et d'eau douce peut être estimée par une réduction et la technique ne se reproduise. Les données permettent aux chercheurs de déduire les taux de mortalité microbienne virus de médiation dans les systèmes aquatiques.

Vidéo: Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Recherche

Immunologie et infection

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l&#39;aide d&#39;adénovirus dérivés Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Détection d&#39;un neuro-invasive virus encéphalitique

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Mesure de taux de Détraduction mycobactériens spécifiques avec des systèmes de reporter à gain de fonction

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, investigations of interactions between endobiotics (e.g., drugs and prebiotics) and gut microbiota have become an important research topic. However, in vivo experiments with human volunteers are not ideal for such studies due to bioethics and economic constraints. As a result, animal models have been used to evaluate these interactions in vivo. Nevertheless, animal model studies are still limited by bioethics considerations, in addition to differing compositions and diversities of microbiota in animals vs. humans. An alternative research strategy is the use of batch fermentation experiments that allow evaluation of the interactions between endobiotics and gut microbiota in vitro. To evaluate this strategy, bifidobacterial (Bif) exopolysaccharides (EPS) were used as a representative xenobiotic. Then, the interactions between Bif EPS and human gut microbiota were investigated using several methods such as thin-layer chromatography (TLC), bacterial community compositional analysis with 16S rRNA gene high-throughput sequencing, and gas chromatography of short-chain fatty acids (SCFAs). Presented here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems. Importantly, this protocol can also be modified to investigate general interactions between other endobiotics and gut microbiota.

Described here is a protocol to investigate the interactions between endobiotics and human gut microbiota using in vitro batch fermentation systems.

Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...