Nous tenons à remercier Rebecca Paquette de l&#39;aide pour la préparation des réactifs. MPM est soutenu par une bourse de Ruth L. Kirchstein prédoctoral de la National Institutes of Health et le soutien de subventions GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP) aussi de la National Institutes of Health.

1. Le transfert adoptif de cellules: Veine de la queue ou par injection intra-oculaire sont à la fois des méthodes appropriées pour l&#39;introduction de cellules tracker-étiquetés ou exprimant la protéine fluorescente-lymphocytes. Dans cette vidéo. nous démontrons transfert adoptif de cellules par injection dans la veine de la queue. a. Matériaux Lymphocytes T CD4 + sont étiquetés avec 1,4 uM CFSE pendant 30 minutes à 37 º C, lavées deux fois, et re-suspendues dans 100 ul de RPMI-1640. Les cellules sont chargées dans une solution stérile de calibre 28 seringue à insuline pour l&#39;injection. Le nombre de cellules utilisées dépend de l&#39;expérience en cours. Généralement, 5 millions de cellules T sont suffisants pour la visualisation des cellules T simples. Un dispositif de retenue des rongeurs pour la souris est nécessaire pour prévenir les blessures à l&#39;animal et à vous-même. b. Sécurisation de l&#39;animal La souris est sécurisé pour le transfert adoptif par lentement soutien de l&#39;animal dans le dispositif de retenue des rongeurs (voir vidéo) et la fermeture à la fin ouverte du tube en appuyant délicatement sur le piston. Ne pas laisser aller de la queue de la souris lors de ce processus, comme certains petits animaux peuvent tourner autour à l&#39;intérieur du dispositif de retenue. Cette méthode empêche l&#39;animal de se blesser et de se déplacer pendant l&#39;injection. Lorsque la mise en place du dispositif de retenue des rongeurs, ne pas pousser le piston dans plus que nécessaire pour garder l&#39;animal de sauter vers l&#39;avant. Aussi, ne pas pousser le piston contre l&#39;animal, et ne pas laisser l&#39;animal dans le dispositif de retenue pour une période de temps prolongée. C. Visualiser le veine de la queue Tirez doucement la queue vers vous afin qu&#39;il soit légèrement enroulée sur votre index et maintenu contre l&#39;intérieur du doigt par votre pouce. Identifier les veines caudales situées de chaque côté de la queue verticale. La visualisation est facilitée par le réchauffement de la queue à l&#39;eau tiède, puis essuyer avec de l&#39;éthanol. d. L&#39;injection de cellules Lorsque la veine a été localisé, insérez la seringue en biseau vers le haut à un angle parallèle à la veine superficielle. Une fois dans la veine, doucement appuyer sur le piston, si vous êtes dans la veine il devrait y avoir aucune résistance à l&#39;injection. S&#39;il ya une résistance, retirez la seringue et essayez de nouveau dans un endroit différent. Si vous êtes dans la veine, lentement appuyer sur le piston jusqu&#39;à ce que l&#39;injection est terminée. La queue ne doit pas devenir distendu pendant l&#39;injection. Si c&#39;est le cas, cela voudrait dire que l&#39;aiguille n&#39;est pas dans la veine. Il est possible de «perdre» la veine lors de l&#39;injection. Si cela se produit, retirez l&#39;aiguille et essayez votre injection à un endroit différent. Si vous avez besoin d&#39;essayer plus d&#39;une injection, il est préférable de déplacer la queue vers le corps de la souris à partir du site d&#39;injection d&#39;origine. Planifiez à l&#39;avance de cette possibilité en commençant distalement sur la queue pour vous donner la place pour une autre tentative de transfert adoptif. e. Post-injection considérations Après l&#39;injection est terminée, un petit reflux du sang de la veine va se produire. Appuyez doucement sur le site d&#39;injection avec un nettoyage essuyez jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. Retirer le piston et laissez l&#39;animal marche en avant, hors de la de contention, tout doucement en tenant la queue. Toujours vérifier auprès de votre comité de protection des animaux et des protocoles d&#39;utilisation d&#39;animaux pour vous assurer de la conformité. Il est important de pratiquer cette technique plusieurs fois avant de tenter l&#39;expérience réelle. 2. Isolement des ganglions lymphatiques Isolement des ganglions lymphatiques pour deux d&#39;imagerie photonique exige l&#39;élimination soigneuse du ganglion correcte du tissu environnant. a. Sélection et localisation des ganglions lymphatiques périphériques Sélection des ganglions lymphatiques pour l&#39;imagerie dépendra des objectifs expérimentaux. Soyez conscient de l&#39;infection locale ou par injection ganglions lymphatiques, et sélectionnez le nœud approprié pour l&#39;imagerie. L&#39;article de Van den Broeck et al., Décrit l&#39;emplacement et la morphologie des ganglions lymphatiques murins en détail 3. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;excision des six grandes ganglions lymphatiques périphériques qui sont appropriées pour l&#39;isolement cellulaire ou d&#39;imagerie. b. Ablation des ganglions lymphatiques: Gardez à l&#39;esprit de l&#39;intégrité des tissus tout en retirant les ganglions lymphatiques. Attention à ne pas rompre la capsule ou dans tout autre manière d&#39;endommager la structure des ganglions lymphatiques. La perte d&#39;intégrité structurale des ganglions lymphatiques de compromettre l&#39;expérience. Si nécessaire, retirez la graisse de la surface des ganglions lymphatiques avec de fines pinces à disséquer (# 5 Dumont), sous un microscope à dissection. Les ganglions lymphatiques ne devrait pas avoir de graisse restant sur la surface du noeud, car cela va obscurcir l&#39;imagerie par diffusion de la lumière. Une bonne excision des ganglions lymphatiques est aussi une technique importante à la pratique avant la première expérience réelle. 3. Nod lymphatiquese Imaging configuration et considérations Le ganglion lymphatique doit être fixé au stade de l&#39;imagerie, qui dans ce cas constitué d&#39;une chambre de retrait. Réchauffé, oxygène perfusé médias est pompé dans la chambre d&#39;un côté à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique et radiateur en ligne, et il sort par un canal vers le bas classés dans une chambre de collecte avec un tube à vide dans un ballon à la collecte des déchets. Dans notre système, le ganglion lymphatique est immergé dans 37 ° C des médias et de super-perfusés avec qualité médicale carbogène (5% de CO 2, 95% d&#39;O 2). La température du support de perfusion doivent être enregistrées au plus près des ganglions lymphatiques que possible. Votre système particulier peut exiger des variations dans le débit des médias et de la scénographie pour accueillir la platine du microscope et objective. a. Configuration lymphatiques imagerie noeud: Comme le montre la vidéo, nous avons sécurisé les ganglions lymphatiques en commençant par l&#39;attacher, médullaires vers le bas (à l&#39;image de T ou des zones de cellules B en utilisant un microscope droit) pour une lamelle en plastique, coupées à la taille appropriée. Il est important d&#39;utiliser une colle tissulaire non toxique (que nous utilisons Vetbond ™ de 3M Corporation). La lamelle est garanti dans les médias qui coule en plaçant une mince couche de graisse silicone sur la face inférieure de la lamelle, puis adhère à la base de ce verre de la chambre de l&#39;imagerie. b. 2-Photon considérations d&#39;imagerie: Plusieurs facteurs peuvent causer des lymphocytes à arrêter de bouger: la température est trop élevée ou trop basse; excès de puissance du laser, la compression ou d&#39;autres dommages à des ganglions lymphatiques et le manque d&#39;oxygène. Les dommages dus à la puissance du laser excessive ou à des températures&gt; ~ 39 ° C est irréversible. Si les cellules sont faibles, il est souvent préférable d&#39;augmenter le gain du détecteur ou le protocole de cellules-étiquetage plutôt que d&#39;utiliser une puissance supérieure au laser pour visualiser les cellules. Optimisation de l&#39;étiquetage ou l&#39;expression de protéines fluorescentes peut être nécessaire d&#39;apporter de la fluorescence au-dessus du niveau de l&#39;autofluorescence de fond. Avec un gain raisonnable et des réglages de puissance laser, sur un décalage de deux journaux de la fluorescence-dessus de référence (mesuré par cytométrie en flux) est raisonnable pour la visualisation des cellules. Avec accordable à deux photons des lasers, la longueur d&#39;onde utilisée pour l&#39;excitation devrait être un peu moins que le double du maximum d&#39;excitation monophotonique du fluorophore étant imagé. En deux photons expériences en utilisant plus d&#39;une étiquette ou d&#39;une protéine fluorescente, il peut être nécessaire d&#39;expérimenter avec la longueur d&#39;onde d&#39;excitation utilisée pour trouver les réglages optimaux pour les deux labels. D&#39;excitation à deux photons peuvent aussi être utilisés pour des structures d&#39;image collagène endogène en prenant avantage de la valeur intrinsèque de génération de second harmonique bleue. Deuxième génération d&#39;harmoniques (SHG) se produit lorsque deux photons sont combinés au sein d&#39;un matériau et émettent un photon unique de deux fois la fréquence des photons d&#39;origine. Dans les tissus, excitation à deux photons se produit lorsque la lumière laser incidente est perpendiculaire à une structure de protéine hautement ordonnés tels que le collagène. Questions pratiques concernant l&#39;imagerie à deux photons ont été discutés en 4 critiques aperçu, 5.

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	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

Dans ce protocole vidéo, nous montrons les procédures de transfert de cellules adoptifs et l&#39;isolement des ganglions lymphatiques et la préparation nécessaire pour la motilité des lymphocytes imagerie dans un ganglion lymphatique périphérique. Deux photons d&#39;imagerie a plusieurs avantages sur l&#39;imagerie confocale dans les deux tissus explantés (illustré ici) et dans les préparations intravitale. Notamment, l&#39;utilisation des infra-rouge d&#39;excitation minimise diffusion de la lumière et permet à l&#39;imagerie ~ 300 micromètres dessous de la capsule du ganglion lymphatique et plus profondes dans certains tissus 4. Par ailleurs, multi-photons d&#39;excitation est limitée au point focal de l&#39;objectif, en minimisant photoblanchiment et les lésions tissulaires à côté du plan focal. Comme avec toute nouvelle technique, cependant, à deux photons d&#39;imagerie n&#39;est pas une panacée et ses limites et ses pièges potentiels doivent garder à l&#39;esprit 5. Parmi eux se trouve l&#39;exigence que - sauf signaux intrinsèques telles que seconde génération de l&#39;harmonique par le collagène des cellules d&#39;intérêt doivent être marqués par fluorescence par des sondes extrinsèques ou par expression de protéines fluorescentes. L&#39;impression est donc créé que ces cellules marquées sont la natation dans un vide noir, tandis que dans la vérité, ils sont immergés dans, et d&#39;interagir avec un environnement complexe d&#39;éléments structurels et une myriade d&#39;autres non étiquetés, les cellules invisibles. Au cours des six années écoulées depuis l&#39;introduction de deux photons d&#39;imagerie pour l&#39;immunologie, cette technique a permis aux chercheurs d&#39;examiner des questions de longue date par les visualisant directement dans les tissus vivants intacts processus, y compris interactions cellule-cellule, la motilité cellulaire et la localisation, voies de signalisation cellulaire et les cellules cytotoxiques tuant des événements. Le champ a évolué rapidement au-delà des premières descriptions phénoménologiques, et des analyses quantitatives avec modélisation et simulation informatiques commencent maintenant à faire comprendre comment les mouvements apparemment chaotique cellulaire et les interactions au sein des ganglions lymphatiques conduire à une réponse immunitaire efficace. Ce progrès est examiné en détail dans une publication récente 1, qui recense plus de 100 documents décrivant l&#39;application de la microscopie à deux photons pour immunoimaging.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

Deux photons d&#39;imagerie a révélé une chorégraphie élégante de la motilité et les interactions cellulaires dans le ganglion dans des conditions basales et à l&#39;initiation d&#39;une réponse immunitaire 1. Ici, nous présentons les méthodes pour le transfert adoptif de cellules T étiqueté, l&#39;isolement des ganglions lymphatiques, et la motilité imagerie des cellules T CD4 + dans le ganglion lymphatique explantés que décrite pour la première en 2002 2. L&#39;imagerie à deux photons de cellules immunitaires nécessite que les cellules sont marquées par fluorescence, soit par coloration avec un colorant Tracker cellulaire ou en exprimant une protéine fluorescente. Nous démontrons la procédure de transfert adoptif de cellules dérivées de l&#39;injection de souris donneuses dans la veine caudale d&#39;un animal receveur, où ils abritent les organes lymphoïdes dans environ 15-30 min. Nous illustrons l&#39;isolement d&#39;un ganglion lymphatique et de décrire des méthodes pour assurer une fixation correcte du ganglion excisé. D&#39;autres considérations telles que l&#39;oxygénation correcte des médias perfusé, la température et la puissance du laser sont discutées. Enfin, nous présentons des images vidéo en 3D de cellules CD4 + naïves T présentant motilité état stationnaire à 37 ° C.

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Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Deux photons d&#39;imagerie a permis de découvrir la motilité des lymphocytes et les interactions cellulaires dans le ganglion dans des conditions basales et pendant une réponse immunitaire 1. Ici, nous démontrons le transfert adoptif de lymphocytes T, l&#39;isolement des ganglions lymphatiques, et la motilité imagerie des cellules T CD4 + dans les ganglions lymphatiques retirés.

Dissection et 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques chez les souris

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

46.0K vues.  University of California, Irvine (UCI).  Deux photons d'imagerie a permis de découvrir la motilité des lymphocytes et les interactions cellulaires dans le ganglion dans des conditions basales et pendant une réponse immunitaire 1. Ici, nous démontrons le transfert adoptif de lymphocytes T, l'isolement des ganglions lymphatiques, et la motilité imagerie des cellules T CD4 + dans les ganglions lymphatiques retirés. 

Vidéo: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolement des cellules T CD4 + des ganglions lymphatiques de souris en utilisant Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Recherche

Biologie

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

Dans l&#39;imagerie in situ de la souris en utilisant deux Thymus microscopie biphotonique

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Une méthode pour le 2-Photon Imaging du flux sanguin dans le néocortex travers une fenêtre crânienne

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagerie fonctionnelle de la graisse brune chez les souris avec FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopie intravitale pour l&#39;imagerie Subcellular ouvrages chez des souris vivantes exprimant des protéines fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissection de l&#39;Auditory Bulla chez les souris postnatale: Isolation des os de l&#39;oreille moyenne et l&#39;analyse histologique

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

Micropuncture of Bowman&#039;s Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Microponction de l’espace de Bowman chez les souris facilitée par 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...