Rebecca Paquette reaktif hazırlanması ile yardım için teşekkür etmek istiyoruz. MPM Ruth L. Kirchstein predoctoral dostluk Sağlık ve hibe GM-41.514 (MDC), NS-48.252 (KGC), Ulusal Sağlık Enstitüleri de GM-48.071 (IP) desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1. Hücre evlatlık transferi: Kuyruk ven veya göziçi enjeksiyon uygun hücre izci etiketli ya da floresan protein ifade lenfositler tanıtımı için iki yöntem vardır. Bu videoda. biz kuyruk damar enjeksiyonu hücreleri evlatlık transfer göstermektedir. a. Malzemeler CD4 + T hücreleri 37 º C&#39;de 30 dakika süreyle 1.4 mcM KAKE ile etiketlenir, iki kez yıkanmış ve RPMI-1640 100 mcL yeniden askıya. Hücreler enjeksiyon için steril 28 gauge insülin enjektörü içine yüklenir. Kullanılan hücre sayısı deney yapılmaktadır bağlıdır. Tipik olarak, 5 milyon T hücreleri basit T hücre görünüm için yeterli değildir. Fare için bir kemirgen süzgeç, hayvan ve kendinize yaralanmayı önlemek için gereklidir. b. Hayvan güvenliğini sağlama Yavaş yavaş içine hayvan kemirgen süzgeç (video) destek ve pistonu hafifçe basılarak tüpün açık sonu kapanış fare tarafından evlat edinen transferi için güvence altına alınmıştır. Bu işlem sırasında bazı küçük hayvanlar süzgeç içinde dönüp gibi, fare kuyruğu gitmesine izin vermeyin. Bu yöntem, kendisi yaralandı ve enjeksiyon sırasında hareket hayvan önler. Kemirgen süzgeç kurarken, ileri atlama hayvan tutmak için gerekli daha ileri piston itmeyin. Ayrıca, uzun bir süre için süzgeç hayvan bırakmayın hayvana karşı piston itmeyin ve. c. Kuyruk ven görselleştirme Kuyruk parmağı üzerinden hafifçe sarılır ve baş parmağınızı parmak iç karşı düzenlenen böylece size doğru yavaşça çekin. Dik kuyruk iki tarafında bulunan kuyruk damarlar belirleyin. Görselleştirme sonra etanol ile silerek, ılık su ile kuyruk ısınmanın kolaylaştırılır. d. Hücre enjeksiyonu Ven yer olmuştur, sığ bir açı paralel damar şırınga konik tarafı yerleştirin. Ven, pistonu hafifçe bastırın; damar iseniz enjeksiyon NO direnç olmalıdır. HERHANGİ bir direniş var ise, şırınga kaldırmak ve farklı bir konuma içinde yeniden deneyin. Ven iseniz enjeksiyon tamamlanıncaya kadar, pistonu yavaşça bastırın. Enjeksiyon sırasında kuyruk şişmiş haline gelmemelidir. Eğer, bu iğne ven değildir anlamına gelir. Enjeksiyon sırasında damar &quot;kaybetmek&quot; için mümkündür. Bu durumda, iğne kaldırmak ve farklı bir noktaya enjeksiyon deneyin. Eğer birden fazla enjeksiyon denemesi gerekiyorsa, orijinal enjeksiyon yerinde farenin vücut doğru kuyruk yukarı taşımak için en iyisidir. Evlatlık transferi başka bir girişim için kendinizi odaya vermek için kuyruk distalde başlayarak bu olasılığı önceden planlayın. e. Post-enjeksiyon konuları Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, ven kan küçük bir geri akış meydana gelecektir. Kanama durana kadar temiz bir silme ile enjeksiyon yerinde hafifçe basın. Plenseri ve kuyruk üzerine hafifçe tutarak hayvan, süzgeç, ileri doğru yürümeye. Daima, hayvan bakımı komitesi ve hayvan kullanımını protokolleri ile uyum içinde olmasını sağlamak için kontrol edin. Gerçek deney denemeden önce bu tekniği birkaç kez uygulama için önemlidir. 2. Lenf Düğümü İzolasyon Iki foton görüntüleme için lenf nodu İzolasyonu dikkatli çevreleyen doku doğru lenf nodu çıkarılması gerektirir. a. Seçme ve periferik lenf nodu yeri Görüntüleme için lenf nodu Seçim deneysel hedeflerine bağlı olacaktır. Lokal enfeksiyon veya enjeksiyon drenaj lenf düğümleri farkında olun ve görüntüleme için uygun bir düğüm noktası seçin. Van den Broeck ve ark makale, detay 3 fare lenf nodu yeri ve morfolojisi açıklamaktadır. Bu video, hücre izolasyonu veya görüntüleme için uygun olan altı büyük periferik lenf nodu eksizyonu göstermektedir. b. Lenf nodu çıkarılması: Lenf düğümleri çıkarırken doku bütünlüğü göz önünde tutun. Rüptürü kapsül veya herhangi bir şekilde zarar lenf nodu yapısını değil dikkatli olun. Lenf nodu yapısal bütünlüğünü kaybı deneyi tehlikeye sokacaktır. Gerekirse, bir diseksiyon mikroskop altında ince diseksiyon (# 5 Dumont) forseps ile lenf nodu yüzeyindeki yağ çıkarın. Lenf düğümleri bu ışık saçılması görüntüleme belirsiz gibi, düğümün yüzeyinde kalan tüm yağ olmamalıdır. Uygun eksizyon lenf düğümleri de ilk gerçek deneyden önce uygulamaya önemli bir tekniktir. 3. Lenf Node Görüntüleme Kurulum ve Düşünceler Lenf nodu, bu durumda gömme odasının oluşan görüntüleme aşamasına kadar güvence altına alınmalıdır. Sıcaklaşır, oksijen-perfüze medya, peristaltik bir pompa ve inline ısıtıcı kullanılarak bir taraftan odasına pompalanır ve bir atık toplama şişesi bir vakum tüpü ile toplama odasına aşağı doğru kademeli bir kanal üzerinden çıkar. Sisteminde, lenf nodu, 37 batmış ° C medya ve medikal carbogen (% 5 CO 2,% 95 O 2) ile süper-perfüze . Perfüzyon medya sıcaklığı mümkün olduğu gibi, lenf nodu yakın olarak kayıt altına alınmalıdır. Belirli bir sistemi, medya akış hızı ve sahne tasarımı farklılıklar mikroskop sahne ve objektif karşılamak gerekebilir. a. Lenf nodu görüntüleme ayarları: Videoda görüldüğü gibi, biz ilk ekleyerek lenf nodu güvenli, uygun boyutta kesilmiş bir plastik lamel, aşağı medüller tarafı (image T veya B hücre bölgeleri dik bir mikroskop kullanılarak). Non-toksik bir doku yapıştırıcısı (3M Corporation&#39;ın VetBond ™) kullanmak önemlidir. Lamel sonra görüntüleme odasının cam tabanı bu kalarak, alt kapak kayma küçük bir silikon gres dab koyarak akan medya güvence altına alınmıştır. b. 2-Foton görüntüleme hususlar: Lenfositler hareketli durdurmak için çeşitli faktörler neden olabilir: çok yüksek veya çok düşük sıcaklık, aşırı lazer güç, sıkıştırma veya lenf nodu diğer hasar ve oksijen eksikliği. Aşırı lazer güç veya sıcaklıklara bağlı hasar&gt; ~ 39 ° C geri döndürülemez. Hücreler loş, dedektör kazanç ya da hücre-etiketleme protokolü yerine hücreleri görselleştirmek için daha yüksek bir lazer güç kullanarak daha artırmak için genellikle daha iyidir. Floresan proteinlerle etiketleme veya ifade optimizasyonu arka plan otofloresans seviyesinden floresan getirmek için gerekli olabilir. (Flow sitometri ile ölçülen) taban çizgisinin üstünde floresan bir iki günlük bir kayma konusunda makul bir kazanç ve lazer güç ayarları, hücre görünüm için makul. Uyarım için kullanılan dalga boyu ayarlanabilir iki foton lazerler ile görüntülü fluorofor çift tek foton uyarma maksimum biraz daha az olmalıdır. Birden fazla etiket veya floresan proteini kullanarak iki foton deneylerde, hem de etiketler için en iyi ayarları bulmak için kullanılan dalgaboyu deney için gerekli olabilir. İki foton uyarma aynı zamanda içsel mavi ikinci harmonik üretimi yararlanarak görüntü endojen kollajen yapılar için kullanılabilir. Ikinci harmonik üretimi (SHG) iki foton bir malzeme içinde kombine olduğu durumlarda meydana gelir ve orijinal fotonların iki kez frekans tek bir foton yayarlar. Doku, iki foton uyarma olay lazer ışığı gibi kollajen gibi bir çok sipariş edilen protein yapısında dik olduğu zaman oluşur. Önizleme yorum 4, 5 iki foton görüntüleme ile ilgili pratik konular tartışıldı .

<ol>
	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

Bu video protokol evlatlık hücre transferi ve periferik lenf nodu görüntüleme lenfosit motilite için gerekli lenf nodu yalıtım ve hazırlık işlemleri göstermektedir. İki foton görüntüleme hem eksplante dokular (burada görüldüğü gibi) ve intravital hazırlıklarında konfokal görüntüleme üzerinde birçok avantajı vardır. Özellikle, infra-kırmızı uyarma ışık dağılımını en aza indiren ve lenf nodu kapsül altında görüntüleme ~ 300 mikrometre sağlar ve bazı dokularda 4 derin kullanın. Ayrıca, çoklu foton uyarma beyazlatma fotoğraf ve odak düzlemi yan dışarı doku hasarı en aza indirmek amacı odak noktasına sınırlıdır. Ancak, herhangi bir yeni bir teknik olduğu gibi, iki-foton görüntüleme, her derde deva değildir ve kendi sınırları ve potansiyel tuzaklar, akılda 5 tutulmalıdır. Bunlardan ilgi kollajen-hücreleri tarafından ikinci harmonik oluşumu gibi içsel sinyalleri dışında floresan ekstrensek probları veya floresan proteinlerle ifade etiketli olmalıdır gerekliliğidir. Izlenim bu etiketli hücreleri böylece siyah bir boşluk yüzme oluşturulur; gerçeği dalmış, ve yapı elemanları ve sayısız diğer etiketsiz, görünmez hücreleri karmaşık bir çevre ile etkileşim oysa. Immünoloji iki foton görüntüleme sunulmasından bu yana altı yıl içinde, bu tekniğin, uzun süredir bozulmadan yaşayan dokuların süreç, hücre-hücre etkileşimleri, hücre hareketi ve lokalizasyonu, hücresel sinyal yollar ve sitotoksik hücre de dahil olmak üzere doğrudan görselleştirme soruları yanıtlamak için araştırmacılar izin verdi olaylar öldürüyor. Alanında ilk fenomenolojik açıklamaları ötesinde hızla evrim geçirdi ve bilgisayar modelleme ve simülasyon ile birlikte kantitatif analizleri, lenf düğümleri içinde görünüşte kaotik hücresel hareketler ve etkileşimleri etkin bir immün yanıt yol nasıl mantıklı başlıyor. Bu ilerleme immunoimaging iki foton mikroskopi uygulama açıklayan 100 kağıtları listeleyen yeni bir yayın 1, kapsamlı bir gözden geçirilir.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

İki foton görüntüleme bazal koşullar altında lenf nodu içinde ve bir immün yanıt 1 başlangıcında zarif bir koreografi motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkarmıştır. Burada, etiketli T hücreleri, lenf düğümleri izolasyonu, görüntüleme motilite ve CD4 + T hücreleri ilk kez 2002 2 açıklandığı gibi eksplante lenf nodu evlatlık transferi için yöntemler sunar. Bağışıklık hücrelerinin iki foton görüntüleme hücrelerinin bir hücre izci boya ile boyanarak floresan veya floresan proteini ifade ederek, ya etiketli olduğunu gerektirir. Biz bir alıcı hayvanın kuyruk ven, yaklaşık 15-30 dakika içinde lenfoid organlara evlerine içine donör farelerden elde edilen hücreler enjekte evlat edinen transfer prosedürü göstermektedir. Biz bir lenf nodu izolasyonu göstermek ve lenf düğümü eksize uygun montaj sağlamak için yöntemler tarif. Perfüze medya, sıcaklık ve lazer güç uygun oksijenasyon gibi diğer hususlar ele alınmıştır. Son olarak, naif CD4 3D video görüntüleri + T hücreleri mevcut 37 kararlı durum motilite sergileyen ° C

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice at JoVE.com

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

46.1K Görüntüleme.  University of California, Irvine (UCI).  İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir. 

Video: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biyoloji

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

FDG micro-PET/CT ile Fare Brown Fat Fonksiyonel Görüntüleme

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Doğum sonrası Farelerde İşitsel Bulla diseksiyonu: Orta Kulak Kemikler ve histolojik analiz izolasyonu

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

Micropuncture of Bowman&#039;s Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropuncture tarafından 2 foton mikroskobu kolaylaştırdı farelerde Bowman'ın alanı

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...