Queremos agradecer a Paquette Rebecca de asistencia con la preparación de reactivos. MPM es apoyado por una beca Ruth L. Kirchstein predoctoral de los Institutos Nacionales de Salud y el apoyo de subvenciones GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48.071 (IP), también de los Institutos Nacionales de Salud.

1. La transferencia adoptiva de células: Vena de la cola o la inyección intraocular son métodos adecuados para la introducción de la célula de seguimiento con etiqueta fluorescente o que expresa la proteína de los linfocitos. En este vídeo. hemos demostrado la transferencia adoptiva de células por inyección vena de la cola. a. Materiales Células T CD4 + están marcadas con CFSE M 1,4 durante 30 minutos a 37 º C, se lavaron dos veces, y volvió a suspender en 100 L de RPMI-1640. Las células se cargan en una jeringa de insulina estéril calibre 28 para inyección. El número de células utilizadas depende del experimento se está realizando. Por lo general, 5 millones de células T son suficientes para una visualización sencilla de células T. Un limitador de roedores para el ratón es necesario para evitar lesiones en el animal y para ti mismo. b. Asegurar que el animal El ratón es seguro para la transferencia adoptiva de respaldo lentamente al animal en la inmovilización de los roedores (ver video) y cerrar el extremo abierto del tubo suavemente el émbolo. ¡No te sueltes de la cola del ratón durante este proceso, ya que algunos animales más pequeños pueden dar la vuelta dentro de la inmovilización. Este método evita que el animal se dañe a sí mismo y que se mueva durante la inyección. Al configurar el limitador de roedores, no empujar el émbolo más allá de lo necesario para mantener los animales de saltar hacia adelante. Además, no empujar el émbolo contra el animal, y no dejar al animal en el que lo detiene por un período prolongado de tiempo. c. Visualización de la vena de la cola Tire suavemente de la cola hacia usted para que sea ligeramente envuelta en su dedo índice y se mantiene en la parte interna de los dedos por el pulgar. Identificar las venas de la cola se encuentra en ambos lados de la cola en posición vertical. La visualización es facilitado por el calentamiento de la cola con agua tibia, luego lavarlo con etanol. d. La inyección de células Cuando la vena ha sido localizado, inserte la jeringa bisel hacia arriba en un ángulo paralelo a la vena superficial. Una vez en la vena, con suavidad el émbolo, si usted está en la vena no debe haber resistencia a la inyección. Si hay alguna resistencia, retire la jeringa y vuelva a intentarlo en un lugar diferente. Si usted está en la vena, presione lentamente el émbolo hasta que la inyección se ha completado. La cola no debe dilatarse durante la inyección. Si es así, esto significaría que la aguja no está en la vena. Es posible &quot;perder&quot; la vena durante la inyección. Si esto sucede, retire la aguja e intentar la inyección en un lugar diferente. Si usted necesita para tratar más de una inyección, lo mejor es mover la cola hacia el cuerpo del ratón desde el sitio de la inyección original. Planee con anticipación para esta posibilidad, a partir distal de la cola que tiene el espacio para otro intento en la transferencia adoptiva. e. Después de la inyección consideraciones Después de la inyección se ha completado, un pequeño reflujo de la sangre de la vena se producirá. Presione suavemente el sitio de la inyección con una limpieza de limpiar hasta que el sangrado se detenga. Retire el émbolo y dejar que el animal camina hacia adelante, fuera de la inmovilización, mientras que suavemente aferrarse a la cola. Siempre consulte con su comité de cuidado de los animales y los protocolos de utilización de animales para asegurarse de que están de acuerdo. Es importante practicar esta técnica varias veces antes de intentar el experimento real. 2. El aislamiento del nodo linfático El aislamiento de los ganglios linfáticos de dos fotones de imágenes requiere la eliminación cuidadosa de los ganglios linfáticos correcta de los tejidos circundantes. a. Selección y ubicación de los ganglios linfáticos periféricos Selección de los ganglios linfáticos de imágenes dependerá de los objetivos experimentales. Sea consciente de infección local o por inyección ganglios linfáticos de drenaje, y seleccione el nodo apropiado para la imagen. El artículo de Van den Broeck et al., Describe la ubicación y la morfología de los nódulos linfáticos murino en detalle 3. En este video, se demuestra la escisión de los seis nodos linfáticos grandes periféricos que son adecuados para el aislamiento de células o de imagen. b. Extirpación de los ganglios linfáticos: Tenga en cuenta la integridad de los tejidos, mientras que la eliminación de los ganglios linfáticos. Tenga cuidado de no romper la cápsula o de cualquier forma puedan dañar la estructura de los ganglios linfáticos. Pérdida de la integridad estructural de los ganglios linfáticos pondrá en peligro el experimento. Si es necesario, eliminar la grasa de la superficie de los ganglios linfáticos con finas pinzas de disección (# 5 Dumont) bajo un microscopio de disección. Los ganglios linfáticos no debe tener nada de grasa que queda en la superficie del nodo, ya que esto oscura imagen por la dispersión de la luz. La extirpación de los ganglios linfáticos adecuada es también una técnica importante para la práctica antes de que el experimento real en primer lugar. 3. Linfáticos Node imágenes de la instalación y consideraciones El ganglio linfático debe ser asegurado a la etapa de formación de imágenes, que en este caso consiste en una cámara empotrada. Calentado, el oxígeno-perfusión medios de comunicación se bombea a la cámara de un lado mediante una bomba peristáltica y el calentador de línea, y que sale a través de un canal a la baja-clasificados en una cámara de recolección con un tubo de vacío en un matraz de recogida de residuos. En nuestro sistema, el ganglio linfático se sumerge en 37 ° C y los medios de comunicación super-perfundidos con médicos carbogen grado (5% CO2, 95% O 2). La temperatura de los medios de perfusión debe registrarse como cerca de los ganglios linfáticos de lo posible. Su sistema en particular puede requerir variaciones en el caudal de los medios de comunicación y el diseño del escenario para dar cabida a la platina del microscopio y el objetivo. a. Los ganglios linfáticos de imagen de configuración: Como se muestra en el video, seguro que el ganglio linfático por primera fijación, medular hacia abajo (a la imagen de T o de las zonas de células B con un microscopio vertical) a un cubreobjetos de plástico, cortado al tamaño adecuado. Es importante usar un adhesivo tisular no tóxico (se utiliza VetBond ™ de 3M Corporation). El cubreobjetos se asegura en los medios de comunicación que fluye por la colocación de una cantidad muy pequeña de grasa de silicona en la parte inferior de la hoja de la cubierta, y luego adherirse a esta la base de cristal de la cámara de imágenes. b. 2-Photon imágenes consideraciones: Varios factores pueden causar que los linfocitos a dejar de moverse: la temperatura es demasiado alta o demasiado baja, el exceso de potencia del láser, la compresión u otros daños a los ganglios linfáticos, y la falta de oxígeno. Daños debidos a la potencia del láser excesiva o temperaturas&gt; ~ 39 ° C es irreversible. Si las células son escasas, a menudo es mejor para aumentar la ganancia del detector o el protocolo de células etiquetado en lugar de utilizar un láser de potencia superior para visualizar las células. Optimización de etiquetado o la expresión de proteínas fluorescentes puede ser necesaria para que la fluorescencia por encima del nivel de la autofluorescencia de fondo. Con una ganancia razonable y los ajustes de la potencia del láser, un cambio de dos registros de la fluorescencia por encima del valor (medido por citometría de flujo) es razonable para la visualización de la célula. Con ajustable de dos fotones láser, la longitud de onda de excitación debe ser un poco menos del doble del máximo de excitación de un solo fotón del fluoróforo se va a examinar. En dos fotones experimentos con más de una etiqueta o proteína fluorescente puede ser necesario experimentar con la longitud de onda de excitación utilizada para encontrar los ajustes óptimos para ambas etiquetas. Excitación de dos fotones también se puede utilizar para imágenes de las estructuras de colágeno endógeno mediante el aprovechamiento de las propiedades intrínsecas azul generación de segundo armónico. Generación de segundo armónico (SHG) se produce cuando dos fotones se combinan dentro de un material y emitir un fotón de la doble de la frecuencia de los fotones originales. En el tejido, de dos fotones de excitación se produce cuando la luz del láser incidente es perpendicular a la estructura de una proteína muy ordenado, como el colágeno. Cuestiones prácticas relativas a dos fotones imágenes fueron discutidos en cuatro revisiones de vista previa, 5.

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	<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol.">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+tissue+imaging:+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light.">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li></ol>

En este protocolo de vídeo se muestran los procedimientos para la transferencia de células adoptivas y el aislamiento de ganglios linfáticos y la preparación requerida para la motilidad de linfocitos de imágenes en un ganglio linfático periférico. De dos fotones de imagen tiene varias ventajas sobre la imagen confocal en ambos tejidos explantados (en la foto) y en los preparativos intravital. En particular, el uso de infrarrojos excitación minimiza la dispersión de luz y permite obtener imágenes ~ 300 micras por debajo de la cápsula del ganglio linfático y más profundo en los tejidos alrededor de 4. Por otra parte, multi-fotón de excitación se limita hasta el punto focal del objetivo, minimizando foto decoloración y daños en los tejidos a los lados del plano focal. Como con cualquier nueva técnica, sin embargo, de dos fotones de imagen no es una panacea y sus limitaciones y peligros potenciales deben tener en cuenta 5. Entre ellas se encuentra la exigencia de que - a excepción de las señales intrínsecas, tales como la generación de segundo armónico por el colágeno de las células de interés deberán ser marcados con fluorescencia mediante sondas extrínsecas o por la expresión de proteínas fluorescentes. La impresión de este modo se crea que estas células marcadas están nadando en un vacío negro, mientras que en la verdad que estamos inmersos, e interactuar con un entorno complejo de elementos estructurales y una miríada de otras células sin etiqueta, invisible. En los seis años desde la introducción de dos fotones de imágenes a la inmunología, esta técnica ha permitido a los investigadores para hacer frente a viejas cuestiones de visualizar de manera directa en los tejidos vivos intactos los procesos incluyendo las interacciones célula-célula, la motilidad celular y la localización, vías de señalización celular y células citotóxicas matando a los acontecimientos. El campo ha evolucionado rápidamente más allá de las descripciones fenomenológicas inicial, y análisis cuantitativos, junto con el modelado y simulación por computadora ahora están comenzando a tener sentido de cómo los movimientos celulares aparentemente caótica y las interacciones dentro de los nódulos linfáticos conducen a una respuesta inmune eficiente. Este avance es un nuevo examen en una publicación reciente 1, que enumera más de 100 artículos que describen la aplicación de la microscopía de dos fotones de immunoimaging.

dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice

De dos fotones de imágenes ha revelado una coreografía elegante de la motilidad y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y en el inicio de una respuesta inmune 1. En este sentido, los actuales métodos para la transferencia adoptiva de células T etiquetados, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados como describió por primera vez en 2002 2. Imágenes de dos fotones de las células inmunes requiere que las células están marcados con fluorescencia, ya sea mediante la tinción con un colorante de la célula de seguimiento o por expresar una proteína fluorescente. Demostramos el procedimiento de transferencia adoptiva de células derivadas de ratones inyección de donantes en la vena de la cola de un animal receptor, donde el hogar de los órganos linfoides en aproximadamente 15-30 min. Se ilustra el aislamiento de un ganglio linfático y se describen los métodos para asegurar el montaje correcto de los ganglios linfáticos extirpados. Otras consideraciones, como la oxigenación adecuada de los medios de perfusión, la temperatura y la potencia del láser se discuten. Finalmente, se presentan las imágenes de vídeo en 3D de las células CD4 + células T ingenuas exhibiendo la motilidad estado de equilibrio a 37 ° C.

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Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

De dos fotones de imágenes ha descubierto la motilidad de linfocitos y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y durante una respuesta inmune 1. En este caso, se demuestra la transferencia adoptiva de células T, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados.

La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

46.1K vistas.  University of California, Irvine (UCI).  De dos fotones de imágenes ha descubierto la motilidad de linfocitos y las interacciones celulares en el ganglio linfático en condiciones basales y durante una respuesta inmune 1. En este caso, se demuestra la transferencia adoptiva de células T, el aislamiento de los ganglios linfáticos, y la motilidad de imágenes de células CD4 + T en los ganglios linfáticos explantados. 

Video: Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Investigación

Biología

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

En imágenes in situ del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopía

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Un método para el 2-Photon imágenes del flujo sanguíneo en la neocorteza a través de una ventana craneal

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

Generación de médula ósea procedentes de células murinas dendríticas para su uso en dos fotones de imágenes

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imagen funcional de grasa marrón en ratones con FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La disección de la Auditivo Bulla en ratones postnatales: Aislamiento de los huesos del oído medio y el análisis histológico

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

Micropuncture of Bowman&#039;s Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropunción del espacio de Bowman en ratones por 2 fotones microscopía

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Disección y tinción de gotas de lípidos de los ovenocitos en larvas de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Disección del saco endolinfático de ratones

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Disección del saco endolinfático de ratones

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

Methods Article

La disección y 2-Photon imagen de los ganglios linfáticos periféricos en ratones