Los autores desean agradecer al Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital de Niños del Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar culturas hNSPC y el Dr. Gary Bassell la Universidad de Emory para la instrucción inicial en la técnica de tinción de parafina.

Día 1: Preparación de las células Cubreobjetos de vidrio alemán y Siembra Nota: cubreobjetos de vidrio alemán son a menudo mejores para el cultivo de células madre neuronales primarias y las neuronas. Usamos el protocolo de limpieza siguientes para mejorar la adhesión celular y la difusión. Cubreobjetos posición en una parrilla pequeña que permitirá el acceso de líquido a ambos lados del cubreobjetos. En primer lugar, los cubreobjetos se incuban en el 1% Liquinox durante 10 minutos, seguido de 3 lavados con agua destilada. Asegúrese de que no quedan burbujas de jabón. A continuación, se desliza incubar en HCl 1 M durante 30 minutos, seguido de 3 lavados con agua destilada. Cubreobjetos seco a 65 ° C durante la noche. Transferencia de cubreobjetos para un plato de cristal y autoclave para esterilizar. <ol><li> En una campana de cultivo de tejidos, lugar cubreobjetos estéril en una placa y de tamaño adecuado. </li><li> Cubreobjetos capa con la laminina para la adhesión celular. Incubar cubreobjetos de 10 mg / ml poli-D-lisina (PDL) en agua destilada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Quitar los cubreobjetos PDL y se incuban en 20 mg / ml en EMEM laminina durante 4 horas, o durante la noche, en un 37 ° C tejidos incubadora de la cultura. <ol><li> Nota: Consulte la pases Humanos troncales nerviosas artículo células ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) y el conteo Humanos troncales nerviosas artículo células ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) para aprender a volver a suspender y contar hNSPCs. </li></ol></li><li> Enjuague laminina recubierto cubreobjetos con PBS y las células de las semillas en cada cubreobjetos que contienen y en una cierta densidad (que a menudo utilizan una densidad inicial de placas de 100.000-300.000 células / ml para las células que están jugando por inmunotinción). </li><li> Colocar la placa en 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos y permiten que las células se adhieran a cubreobjetos (por lo general un mínimo de 4 horas es necesario). </li></ol> Día 2: Fijación, permeabilizante, bloqueo, y añadir el anticuerpo primario de las células Nota: Usamos los siguientes fijador de paraformaldehído al 4% para preservar la morfología celular. La receta incluye una transición para permitir que el pH de paraformaldehído para ir a la solución. Nosotros preferimos este método en lugar del uso de calor para disolver paraformaldehído, ya temperaturas más altas pueden conducir a la generación de ácido fórmico, lo que puede aumentar la tinción de fondo cuando se utiliza la fluorescencia. Algunos componentes de la ayuda fijador para preservar la estructura del citoesqueleto (MgCl2 y EGTA), mientras que otros ayudan a mantener la morfología general (sacarosa). 4% de paraformaldehído fijador de células <table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Reactivos y pasos: </td><td> Cantidad de 100 ml de fijador: </td></tr><tr><td> MilliQ agua </td><td> 75 ml </td></tr><tr><td> Paraformaldehído (peso en la campana extractora de humos) </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> NaOH 10N, agitar y añadir gota a gota hasta que la solución limpia </td><td> según sea necesario </td></tr><tr><td> PBS 10 veces </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> MgCl2 1M </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EGTA </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> HCl 6N, se valorarán a pH 7,4 </td><td> según sea necesario </td></tr><tr><td> MilliQ agua </td><td> llevar a 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 semana. Calentar a 37 ° C antes de su uso </td></tr></tbody></table><ol><li> En el banco, sacar el papel y agregar fijador precalentado. Se incuba durante 5-15 minutos (dependiendo del antígeno a detectar, por lo general el uso de 10 minutos). Realice este y los siguientes pasos a temperatura ambiente. </li><li> Deseche el fijador en un recipiente adecuado, ya que muchas instituciones manejan paraformaldehído como residuos peligrosos. Lavar las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez. Cuando la eliminación de las soluciones de las células, tenga cuidado de que la succión no se seque las células. Además, siempre tiene la siguiente solución a mano para añadir a las células antes de retirar la solución que cubre las células que no se dejan secar. </li><li> Si el antígeno de interés dentro de la célula, la membrana de la célula debe ser permeable para permitir la entrada de los anticuerpos. Para permeabilizar las células, utilice un nuevo 0,3% Triton X-100 en PBS solución. Pipeta lentamente debido a Triton es viscoso, y asegúrese de que el detergente se disuelva por completo en PBS antes de añadir a las células. Permeabilizar las células durante 5 minutos, seguido por el lavado de las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez. </li><li> Las células deben ser tratadas con un agente de bloqueo para evitar la unión no específica del anticuerpo. Usamos albúmina de suero bovino (BSA) como un agente de bloqueo. La solución de bloqueo se realiza mediante la disolución de 5% de BSA en PBS (en un agitador rotatorio o porque se necesita tiempo para disolver) y luego filtrar el sollución con un filtro de jeringa de 0,45 micras. Bloquear las células de BSA / PBS solución al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. </li></ol> Diluir el anticuerpo primario (que es de esperar específicos para la proteína de interés) a una concentración pre-determinado en el 1% BSA / PBS (preparado por dilución de un 5% BSA / PBS). Lugar diluye el anticuerpo primario (30 l por cubreobjetos de 25 mm, 20 l por cubreobjetos de 18 mm, 15 l por cubreobjetos de 12 mm) sobre una placa de vidrio cubierta con parafilm. Levante el cubreobjetos con células fijadas, invertir de tal manera que las células boca abajo, y lo pondré sobre la solución de anticuerpos de manera que las células están en contacto con el anticuerpo. Coloque una tira de Parafilm segundos sobre toda la estructura. Incubar a 4 ° C durante la noche. Día 3: Lavado, incubación del anticuerpo secundario, las manchas nucleares y de montaje <ol><li> Retire con cuidado la tira de Parafilm superior y recoger el cubreobjetos, invertirlo, y vuelva a colocarlo en la placa con PBS en cada pozo de lava para que las células están mirando hacia arriba. </li><li> Lavar las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada vez. </li><li> Elegir un anticuerpo secundario que detectan el anticuerpo primario, por ejemplo, si el anticuerpo primario se realizó en un conejo, la secundaria de anticuerpos IgG de conejo deben reconocer. Tenga cuidado para que coincida también el isotipo de anticuerpos (IgG, IgM, etc.) Si el uso de múltiples anticuerpos primarios, asegúrese de que sean de diferentes especies o isotipos, y un plan para detectar con diferentes marcadores adjunta a la secundaria de anticuerpos. Por ejemplo, podría usar un acoplamiento secundario anti-conejo de un fluoróforo rojo junto con un anti-ratón secundaria a un fluoróforo verde. Se incuban las células en la solución de anticuerpo secundario diluido a una concentración adecuada en el 1% BSA durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente, utilizando la misma técnica que para la primaria (medidas que no aparecen en el video). El volumen de secundaria de anticuerpos necesarios para la incubación puede ser ligeramente mayor que para el anticuerpo primario al secundario, si se almacena como una solución de glicerol (40 l por cubreobjetos de 25 mm, 30 l por cubreobjetos de 18 mm, 25 l por cubreobjetos de 12 mm) . <ul><li> Nota: Si utiliza moléculas fluorescentes para visualizar la secundaria de anticuerpos, la muestra debe ser protegido de la luz una vez que el anticuerpo secundario se ha añadido. Incubar en la oscuridad, o en una placa de aluminio cubiertos. </li></ul></li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos de la parafina como se ha descrito para el anticuerpo primario. Lavar las células dos veces con PBS, 5 minutos cada vez, seguida de una incubación de 1 minuto en 2 mg / ml Hoechst tinción nuclear diluido en PBS (si contratinción nuclear se prefiere). Si la mancha es antigua Hoechst y la señal es demasiado débil, puede aumentar el tiempo de incubación y / o la concentración. Después de la incubación con Hoechst, lavar una vez con PBS durante 5 minutos. </li><li> Los cubreobjetos se debe montar en un portaobjetos con medio de montaje para su visualización en el microscopio. En los casos en que se utiliza una molécula fluorescente para la visualización de la secundaria de anticuerpos, los medios de comunicación de montaje debe contener agentes para reducir al mínimo photobleaching. Usamos Vectashield como medio de montaje para fluorescencia. Coloque una gota de tamaño apropiado de Vectashield sobre un portaobjetos de microscopio (12 l por cubreobjetos de 25 mm, 6 l por cubreobjetos de 18 mm, 3 l por cubreobjetos de 12 mm). </li><li> Recoja cuidadosamente el portaobjetos y enjuagar la parte posterior con agua destilada para eliminar las sales (de la PBS). Frote el exceso de agua en un Kimwipe o toalla de papel, y se echó en la caída de Vectashield con células hacia abajo. Coloque el cubreobjetos en un ángulo y dejar descender lentamente para evitar burbujas de aire atrapado. Etiqueta de la diapositiva con la fecha y cualquier otra información de la muestra. </li><li> Permita que se desliza con cubreobjetos para secar (en la oscuridad) de succión después de Vectashield exceso de alrededor del borde cubreobjetos. Los bordes cubreobjetos ahora se pueden sellar con esmalte de uñas, si lo desea (especialmente útil si cubreobjetos se pueden ver en un microscopio invertido). Por lo general, nuestra tienda de diapositivas en un congelador a -20 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A,+the+Arp2/3+complex,+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells.">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins.">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li><li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells.">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+Human+Neural+Stem+Cells.">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+Human+Neural+Stem+Cells.">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li></ol>

Este protocolo describe un procedimiento de inmunotinción para hNSPCs que minimiza el volumen de los anticuerpos necesarios y da la tinción de células confiable. El procedimiento descrito es el mejor de los antígenos intracelulares, pero puede ser modificado para teñir las moléculas de la superficie celular o para mejorar la tinción del citoesqueleto.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips</td>
<td>Tool</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>WW-63-3029</td>
<td>12,15,18, 22, 25 mm coverslips available</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquinox phosphate-free detergent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z273279</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, natural mouse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EMEM (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>MT-10-010-CV</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151-500</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin, IgG-free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immunoresearch</td>
<td>001-000-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>H-1399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>viscous</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

immunocytochemistry: human neural stem cells

Inmunocitoquímica es un método muy eficaz y sencillo modo leal, para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés, por lo general una proteína, en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitirá a los investigadores para conservar anticuerpos primarios y secundarios al obtener alta calidad, de calidad reproducible y datos cuantitativos de sus manchas. Hay dos aspectos de este protocolo que ayuda a conservar el volumen de los anticuerpos necesarios para la tinción. Por un lado, las células se cultivaron en cubreobjetos pequeños y circulares que se colocan en pocillos de una placa de cultivo de tejidos. Después de la fijación, las células en cubreobjetos se puede quitar de los pozos de la placa. Para la tinción de anticuerpos, el cubreobjetos con las células se invierte en una pequeña gota de solución de anticuerpos en parafina y se cubre con una segunda pieza de parafilm para evitar que se sequen. El uso de este método, sólo aproximadamente 25 l de solución de anticuerpos que se necesita para cada cubreobjetos (o muestra) a teñir. Este protocolo describe la inmunotinción de los derechos humanos madre neurales / células precursoras (hNSPCs), pero se puede utilizar para muchos tipos de células.

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Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Inmunocitoquímica es un poderoso método para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitan una para conservar los anticuerpos y sacar el máximo provecho de su coloración.

Inmunocitoquímica: células madre neurales humanas

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

27.2K vistas.  University of California, Irvine (UCI). Inmunocitoquímica es un poderoso método para determinar la presencia, localización subcelular, y la abundancia relativa de un antígeno de interés en células cultivadas. Este protocolo presenta una forma fácil de seguir una serie de medidas que permitan una para conservar los anticuerpos y sacar el máximo provecho de su coloración.

Video: Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Investigación

Biología

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfección de células madre neurales humanas con el Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Conteo de células madre neurales humanas

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Pases células madre neurales humanas

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Ratón epidérmico de la cresta neural de células madre (EPI-NCSC) Culturas

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generación de humanos CD40 activado por células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelación y descongelación células estaminales embrionarias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...