Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen an der Kinderklinik, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen und Dr. Gary Bassell an der Emory University für den Anfangsunterricht in der Parafilm Maltechnik anzuerkennen.

Tag 1: Vorbereiten deutschen Deckgläser und Seeding Cells Hinweis: Deutsch Deckgläser sind oft besser zur Kultivierung von primären neuralen Stammzellen und Neuronen. Wir verwenden die folgenden Reinigungs-Protokoll, um die Zelladhäsion und Verbreitung zu verbessern. Position Deckgläser in einem kleinen Gestell, das flüssige Zugang zu beiden Seiten des Deckglases ermöglicht. Zunächst inkubieren Deckgläser in 1% Liquinox für 10 Minuten, gefolgt von 3 Waschschritten mit deionisiertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass keine Seifenblasen bleiben. Als nächstes inkubieren rutscht in 1M HCl für 30 Minuten, gefolgt von 3 Waschschritten mit deionisiertem Wasser. Dry Deckgläschen bei 65 ° C über Nacht. Transfer Deckgläschen in eine Glasschale und Autoklaven zu sterilisieren. <ol><li> In einer Gewebekultur Kapuze, Ort, sterile Deckgläschen in ein entsprechend großes Loch-Platte. </li><li> Coat Deckgläser mit Laminin für die Zelladhäsion. Inkubieren Deckgläschen in 10 pg / ml Poly-D-Lysin (PDL) in sterilem Wasser für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen PDL und inkubieren Deckgläschen in 20 ug / ml Laminin in EMEM für 4 Stunden oder über Nacht in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator. <ol><li> Hinweis: Beachten Sie die Passagierung Nervenstammzellen Artikel ( <a href="/index/Details.stp?ID=263">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> ) und die Counting Nervenstammzellen Artikel ( <a href="/index/Details.stp?ID=262">https://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262</a> ) zu lernen, wie resuspendieren und zählen hNSPCs. </li></ol></li><li> Spülen Laminin-beschichtete Deckgläser mit PBS-und Samenzellen in jedes Deckglas-haltige auch bei einer bestimmten Dichte (wir verwenden oft eine erste Plattierungsdichte von 100.000-300.000 Zellen / ml für Zellen, die wir für Immunfärbung plating). </li><li> Legen Sie Platte in 37 ° C Gewebekultur-Inkubator und erlauben Zellen auf Deckgläser (in der Regel ein Minimum von 4 Stunden ist erforderlich) einzuhalten. </li></ol> Tag 2: Befestigung, permeabilisierenden, Blocking und Hinzufügen von primären Antikörpers an Cells Hinweis: Wir verwenden die folgenden 4% Paraformaldehyd Fixativ zu Zellmorphologie zu bewahren. Das Rezept enthält eine pH Übergang zu ermöglichen Paraformaldehyd in Lösung zu gehen. Wir bevorzugen diese Methode anstelle der Nutzung von Wärme zu Paraformaldehyd auflösen, weil höhere Temperaturen zur Bildung von Ameisensäure, die Hintergrundfärbung erhöhen kann, wenn mittels Fluoreszenz führen kann. Einige Komponenten des Fixativ zur Bewahrung des Zytoskeletts Struktur (MgCl 2 und EGTA), während andere helfen, die allgemeine Morphologie (Saccharose) zu halten. 4% Paraformaldehyd-Fixativ für Zellen <table style="border-collapse: collapse; border: medium none" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Reagenzien und Schritte aus: </td><td> Betrag für 100 ml Fixativ: </td></tr><tr><td> MilliQ Wasser </td><td> 75 ml </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd (abwiegen im Abzug) </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> 10N NaOH, umrühren und tropfenweise, bis die Lösung löscht </td><td> nach Bedarf </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 0,5 M EGTA </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> 6N HCl, titriert auf pH 7,4 </td><td> nach Bedarf </td></tr><tr><td> MilliQ Wasser </td><td> bringen, um 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Lagerung bei 4 ° C für bis zu 1 Woche. Warm bis 37 ° C vor dem Einsatz </td></tr></tbody></table><ol><li> Auf der Bank, entfernen Sie die Medien und fügen vorgewärmt Fixativ. Inkubieren für 5-15 Minuten (je nach Antigen nachgewiesen werden soll, verwenden wir im allgemeinen 10 Minuten). Führen Sie dieses und die folgenden Schritte bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Sie die Fixierlösung in einen geeigneten Behälter, wie viele Institutionen Paraformaldehyd Griff als gefährlicher Abfall. Wash Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit. Beim Entfernen von Lösungen aus den Zellen, darauf achten, dass Saug-trocknet nicht aus den Zellen. Auch immer die nächste Lösung zur Hand, um die Zellen vor dem Entfernen der Lösung, die Mäntel ihnen so Zellen nicht trocknen gelassen hinzuzufügen. </li><li> Wenn das Antigen von Interesse ist im Inneren der Zelle, muss die Zellmembran durchlässig gemacht Eingabe des Antikörpers zu ermöglichen. Um permeabilisieren Zellen, mit einem frischen 0,3% Triton X-100-Lösung in PBS. Pipette langsam, weil Triton ist zähflüssig, und vergewissern Sie sich das Waschmittel vollständig in PBS, bevor Sie die Zellen aufgelöst. Permeabilisieren Zellen für 5 Minuten, durch Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit gefolgt. </li><li> Die Zellen müssen mit einem Blockierungsmittel, um unspezifische Bindung des Antikörpers zu verhindern behandelt werden. Wir verwenden Rinderserumalbumin (BSA) als Blockierungsmittel. Die Sperrung wird durch Lösen von 5% BSA in PBS hergestellt (auf einer Wippe oder Rotator, weil es an der Zeit zu lösen hat), dann Filterung der Solution mit 0,45 um Spritzenfilter. Block-Zellen in 5% BSA / PBS Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li></ol> Verdünnen Sie den Primärantikörper (was hoffentlich die spezifisch für das Protein von Interesse) zu einem vorher festgelegten Konzentration in 1% BSA / PBS (hergestellt durch Verdünnung von 5% BSA / PBS). Legen Sie verdünnten primären Antikörper (30 ul pro 25 mm Deckglas, 20 ul pro 18 mm Deckglas, 15 ul pro 12 mm Deckglas) auf einer Glasplatte mit Parafilm abgedeckt. Nehmen Sie den Deckglas mit fixierten Zellen, invertieren, so dass die Zellen nach unten zeigen, und legen Sie es über die Antikörper-Lösung, so dass die Zellen in Kontakt mit dem Antikörper sind. Legen Sie einen zweiten Parafilm Streifen über die gesamte Konstruktion. Inkubation bei 4 ° C über Nacht. Tag 3: Wasch-, Sekundär-Antikörper Inkubation, Kernfärbung und Montage <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig die obere Parafilm-Streifen und abholen Deckglas, Invertzucker, und setzen Sie ihn wieder in die Platte mit PBS in jede Vertiefung für wäscht, so dass die Zellen nach oben. </li><li> Wash Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit. </li><li> Wählen Sie einen sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennen wird, zum Beispiel, wenn der primäre Antikörper in Kaninchen hergestellt wurde, der sekundäre Antikörper sollten Kaninchen IgG erkennen. Achten Sie darauf, auch mit den Antikörper-Isotypen (IgG, IgM, etc). Bei Verwendung mehrerer primärer Antikörper, sicherzustellen, dass sie aus verschiedenen Arten oder Isotypen, und planen Sie mit verschiedenen Markern an den sekundären Antikörper nachzuweisen. Zum Beispiel könnten Sie eine Anti-Kaninchen sekundären gekoppelt mit einem roten Fluorophors mit einem Anti-Maus-sekundären gekoppelt mit einem grünen Fluorophor verwenden. Inkubieren Zellen in den sekundären Antikörper-Lösung verdünnt, um eine geeignete Konzentration in 1% BSA für 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur mit der gleichen Technik wie für die primäre (Schritte nicht im Video gezeigt). Das Volumen des sekundären Antikörpers für die Inkubation benötigt werden etwas größer als die für den primären Antikörper, wenn die sekundäre als Glycerin-Lösung (40 ul pro 25 mm Deckglas, 30 ul pro 18 mm Deckglas, 25 ul pro 12 mm Deckglas) gespeichert ist . <ul><li> Hinweis: Wenn Sie unter Verwendung von fluoreszierenden Moleküle werden an den sekundären Antikörper sichtbar zu machen, muss die Probe vor Licht geschützt werden, wenn der sekundäre Antikörper zugegeben wurde. Inkubieren im Dunkeln oder in einer Folie abgedeckt Platte. </li></ul></li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckgläschen aus der Parafilm wie für den primären Antikörper beschrieben. Wash-Zellen 2 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit, eine 1-minütige Inkubation in 2 pg / ml Hoechst nuklearen in PBS verdünnt Fleck (wenn eine nukleare Gegenfärbung bevorzugt wird) gefolgt. Wenn der Hoechst-Färbung ist alt und das Signal zu schwach ist, können Sie erhöhen die Inkubationszeit und / oder die Konzentration. Nach der Inkubation mit Hoechst, waschen 1 Mal mit PBS für 5 Minuten. </li><li> Die Deckgläser sollten auf einer Folie mit Montage Medien zur Visualisierung auf einem Mikroskop montiert werden. In Fällen, in denen ein fluoreszierendes Molekül für die Visualisierung des sekundären Antikörpers verwendet wird, sollte die Montage Medien enthalten Wirkstoffe zur Minimierung Bleichen. Wir verwenden Vectashield als Montage-Medien für die Fluoreszenz. Legen Sie eine geeignete Größe Tropfen Vectashield auf einen Objektträger (12 ul pro 25 mm Deckglas, 6 ul pro 18 mm Deckglas, 3 ul pro 12 mm Deckglas). </li><li> Sorgfältig nehmen die Deckglas und spülen Sie den Rücken mit VE-Wasser, Salze (aus dem PBS) zu entfernen. Abtupfen überschüssige Wasser auf einem Kimwipe oder Papiertuch, und lag auf dem Tropfen Vectashield mit Zellen nach unten. Legen Sie das Deckglas auf einen Winkel und lassen Sie sie langsam hinab, um Luftblasen zu vermeiden. Beschriften Sie die Folie mit dem Datum und einer Probe Informationen. </li><li> Lassen Sie die Objektträger mit Deckgläsern, um zu trocknen (im Dunkeln), dann Absaugen überschüssigen Vectashield aus der ganzen Deckglas Rand. Das Deckglas Kanten können nun mit Nagellack versiegelt werden, wenn gewünscht (besonders nützlich, wenn Deckgläser auf einem inversen Mikroskop wird eingesehen werden). Wir in der Regel speichern unsere Folien in einer -20 ° C Gefrierschrank. </li></ol>

<ol>
	<li>Flanagan, L. A., Chou, J., Falet, H., Neujahr, R., Hartwig, J. H., Stossel, T. P., Filamin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+A,+the+Arp2/3+complex,+and+the+morphology+and+function+of+cortical+actin+filaments+in+human+melanoma+cells.">Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells.</a> J. Cell Biol. 155, 511-518 (2001).</li><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins.">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li><li>Flanagan, L. A., Ziaeian, B., Palmer, T., Schwartz, P. H., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+stem+cells.">Immunocytochemical analysis of stem cells.</a> In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. , (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+Human+Neural+Stem+Cells.">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+Human+Neural+Stem+Cells.">Counting Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, (2007).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine Immunfärbung Verfahren für hNSPCs dass das Volumen des Antikörpers notwendig minimiert und verleiht zuverlässige Zellfärbung. Das beschriebene Verfahren ist am besten für die intrazelluläre Antigene, kann aber geändert werden, um Zelloberflächenmoleküle Flecken oder Verfärbungen des Zytoskeletts zu verbessern.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips</td>
<td>Tool</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>WW-63-3029</td>
<td>12,15,18, 22, 25 mm coverslips available</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquinox phosphate-free detergent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z273279</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, natural mouse</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EMEM (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>MT-10-010-CV</td>
<td>Distributed by Fisher under the indicated catalog #</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151-500</td>
<td>very viscous</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin, IgG-free</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immunoresearch</td>
<td>001-000-161</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>H-1399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>viscous</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
					</div>

immunocytochemistry: human neural stem cells

Immunzytochemie ist eine sehr mächtige und ziemlich einfache Methode zur Bestimmung der Gegenwart, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse, am häufigsten ein Protein, in kultivierten Zellen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, ermöglichen es Forschern, primäre und sekundäre Antikörper zu erhalten, während sich hohe Qualität, reproduzierbare qualitative und quantitative Daten aus ihrer Färbung wird. Es gibt zwei Aspekte dieses Protokoll, um die Lautstärke des Antikörpers notwendig für die Färbung sparen helfen. Zum einen werden die Zellen auf kleine, runde Deckgläser, dass in Vertiefungen einer Gewebekultur Platte gelegt angebaut werden. Nach der Fixierung können die Zellen auf Deckgläsern aus den Vertiefungen der Platte entfernt werden. Für Antikörper-Färbung wird das Deckglas mit Zellen auf einen kleinen Tropfen Antikörperlösung auf Parafilm invertiert und ist mit einem zweiten Stück Parafilm Austrocknen zu verhindern abgedeckt. Mit dieser Methode ist nur ~ 25 ul Antikörper-Lösung für jedes Deckglas (oder Muster) zu gebeizt werden musste. Dieses Protokoll beschreibt Immunfärbung der menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), kann aber auch für viele andere Zelltypen verwendet werden.

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Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunzytochemie ist eine leistungsfähige Methode, um die Präsenz, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse in kultivierten Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, mit denen man Antikörper zu schonen und das Beste aus der eigenen Färbung wird.

Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

immunocytochemistry-human-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

27.3K Aufrufe.  University of California, Irvine (UCI). Immunzytochemie ist eine leistungsfähige Methode, um die Präsenz, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse in kultivierten Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, mit denen man Antikörper zu schonen und das Beste aus der eigenen Färbung wird.

Serie: Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfektion humaner neuraler Stammzellen mit dem Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Counting Nervenstammzellen

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...