لذلك باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا تصور السيتونيمات في أنسجة الفئران الثابتة في جميع أنحاء الجنين بأكمله باستخدام المجهر الضوئي القياسي. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا البحث عن بروتينات الإشارات الداخلية التي تنتقل على طول السيتونيم ، بدلا من الاعتماد على نماذج الفئران التي يتم التلاعب بها وراثيا والتي تستخدم البروتينات الموسومة بالفلورسنت. أثناء محاولة هذا البروتوكول ، من المهم التعامل بلطف مع أقسام الأنسجة للحفاظ الأمثل على السيتونيم.
ستوضح هذه العملية ميريام ديلارد ، الباحثة الرئيسية في مجموعتي ، وكريستينا دالي ، طالبة الدراسات العليا في سانت جود. للبدء ، استخدم مقص تشريح وملقط لإجراء شق Y إلى التجويف البريتوني. استئصال الرحم الذي يحتوي على جنين E 9.5.
تشريح الأجنة في وسط نمو DMEM كامل. استخدم الملقط لإزالة صفار البيض SAC والمشيمة والأغشية المحيطة. شطف الأجنة المعزولة في HBSS لإزالة أي أنسجة السلى المتبقية والدم.
بعد ذلك ، قم بإعداد المثبت عن طريق إضافة بارافورمالديهايد إلى HBSS لتركيز عمل 4٪ بارافورمالديهايد. أضف ملليلتر واحد من هذا المحلول إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا. ضع الأجنة في آبار فردية.
احتضن الأجنة لمدة 45 دقيقة مع إثارة لطيفة على الروك. بعد الحضانة ، قم بإزالة المثبت واغسل الأجنة ثلاث مرات ، لمدة 30 دقيقة في PBS مع إضافة الكالسيوم والمغنيسيوم و 0.1٪ Triton. ثم احتضن الأجنة في محلول مانع مع إثارة لطيفة مرتين ، لمدة ساعة واحدة لكل منهما.
بعد الحضانة الثانية ، اشطف الأجنة باستخدام محلول حجب جديد. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي عن طريق تخفيف الأجسام المضادة في PBS المكملة. بعد اكتمال الشطف ، قم بإزالة محلول الحجب وأضف ملليلتر واحد من محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى كل بئر.
احتضن اللوحة عند أربع درجات مئوية مع دوران لطيف لمدة ثلاثة أيام. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، اغسل الأجنة ب PBS المكمل خمس مرات لمدة ساعة واحدة على الروك عند 20 دورة في الدقيقة. ثم أضف ملليلتر واحد من محلول الأجسام المضادة الثانوي إلى كل بئر.
احتضن الطبق بهزاز لطيف عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة ثلاثة أيام. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل الأجنة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في PBS المكملة. تحضير محلول 4٪ بوزن الأغاروز منخفض درجة الانصهار في PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم.
في الوقت نفسه ، ضع صفيحة من 12 بئرا في حمام الخرزة 55 درجة مئوية وأضف ثلاثة ملليلتر من الأغاروز إلى كل بئر. بعد ذلك ، ضع الطبق على سطح مقعد وانقل الأجنة إلى آبار فردية باستخدام ملعقة مثقوبة. استخدم أطراف الماصة لتضمين الجنين وتوجيهه بلطف بحيث يتمركز داخل المحلول.
بمجرد توجيه الأجنة ، ضع الطبق عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق للتصلب. ثم باستخدام مشرط ، قم بإزالة كتلة الأغاروز بأكملها من البئر. قطع كتلة مستطيلة حول الجنين ، وترك ما يقرب من 0.3 سم من الكتلة على كل جانب.
اترك طولا إضافيا للكتلة على طول النهاية الذيلية للجنين. لتركيب الجنين على الاهتزاز ، ضع أولا شريطا من الشريط على حامل العينة. قم بتوجيه الجنين في وضع مستقيم في القسم العلوي من الكتلة وقم بلصق كتلة الأغاروز على الشريط ، بحيث تولد الشفرة مقاطع محورية في تسلسل أمامي إلى خلفي.
بعد ذلك ، املأ غرفة الاهتزاز ب HBSS البارد لغمر العينة بالكامل ثم أحاط الغرفة بالثلج. تعيين المعلمات على الاهتزاز وإجراء التقسيم المحوري التسلسلي للجنين. استخدم الملقط لنقل الأقسام الفردية إلى طبق منفصل مملوء ب HBSS.
تذكر استخدام الملقط لحمل الأغاروز فقط لتجنب تلف الأنسجة وتدمير السيتونيم. لإجراء تلطيخ F-actin ، قم بإزالة HBSS واحتضان الأقسام لمدة 40 دقيقة باستخدام محلول ActinRed و DAPI في PBS المكملة. بعد الحضانة ، اغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في PBS المكملة.
باستخدام قلم تحديد مسعور ، ارسم حاجزا حول حواف شريحة المجهر المشحونة وأضف كمية صغيرة من HBSS إلى منطقة التعبئة. ثم استخدم الملقط لنقل المقاطع إلى الشريحة. إزالة الأغاروز الزائد باستخدام الملقط.
بمجرد نقل جميع الأقسام إلى الشريحة ، قم بإزالة السائل الزائد عن طريق السحب واستخدام زاوية منشفة ماصة. ثم أضف عدة قطرات من وسط التركيب إلى الشريحة. قم بتركيب الغطاء عن طريق وضعه برفق على الشريحة.
للتحليل، قم بإجراء تصوير لأقسام الأنسجة لما لا يقل عن ثلاثة أجنة لكل نمط وراثي على مجهر بؤري أو أي مجهر عالي الدقة. يتم عرض الأقسام الموجهة بشكل صحيح والتي تم إعدادها باستخدام هذا البروتوكول هنا. بالمقارنة مع تقسيم الاهتزاز ، فإن تقسيم cryostat للأنسجة لم يحافظ على الامتدادات الخلوية.
تم الكشف عن عدد قليل من شظايا الغشاء الإيجابية GFP بين خلايا notochord والأنبوب العصبي ، وبين خلايا الأنبوب العصبي المجاورة في أقسام cryostat. ومع ذلك ، فإن تلطيخ F-actin للامتدادات الخلوية في الخلايا الوسيطة المحيطة بالأنبوب العصبي كان ضعيفا في أقسام cryostat. يضمن تقسيم الاهتزاز الحد الأدنى من تعطيل أقسام الجنين والأنسجة الفردية بأكملها.
سمحت الأقسام التي تم التعامل معها على النحو الأمثل بالكشف عن ctyonemes بين الخلايا الظهارية العصبية ذات الصفائح الأرضية الموضعية المجاورة والخلايا الوسيطة. كانت المقاطع المطوية أو المشبكة واضحة من خلال فصل كبير بين notochord ولوحة الأرضية البطنية للأنبوب العصبي. وفقدان امتدادات الأغشية الخلوية المهاجرة بين الخلايا الظهارية.
كان للأقسام الملطخة بالأكتين و DAPI تباعد ثابت بين الخلايا الوسيطة و ctyonemes المحيطة بالأنبوب العصبي و notochord. وقد تكون التشوهات الطفيفة في الأقسام قد تسببت في تفتيت الامتدادات القائمة على الأكتين وتشكل فجوات كبيرة بين الخلايا، مما يؤكد الحاجة إلى معالجة دقيقة. بعد تقسيم الجنين، من الضروري تقليل أي انحناء أو طي لأقسام الأنسجة.
لمنع كسر السيتونيم. باستخدام هذه التقنية، يمكننا أن نتصور مباشرة كيف تنتشر جزيئات الإشارة، مثل المورفوجينات، عبر الأنسجة. هذا يعطينا رؤى جديدة حول كيفية نمط الأنسجة والأعضاء.
