ارتفاع نسبة الكوليسترول في الدم هو عامل خطر رئيسي لمرض القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية. توفر بروتوكولاتنا أدوات قيمة لدراسة كل من العواقب الفسيولوجية والميكانيكية لفرط الكوليسترول. يمكن تنفيذ هذه الإجراءات باستخدام معدات المختبر الأساسية، وهي قابلة للتطبيق على الخلايا والأنسجة والبويضات Xenopus.
الكولسترول هو عنصر رئيسي من الأغشية الخلوية في جميع أنحاء الجسم. يمكن استخدام هذه التقنيات لدراسة تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في أي نوع من الخلايا. تشريح الشرايين هو الخطوة الأكثر صعوبة.
إزالة الشريان بعناية من الدماغ، دون تمديد أو إتلاف الأنسجة الوعائية. الدهون حساسة جدا، والعمل معهم هو أكثر من فن من العلم. مظاهرة الفيديو يوفر دليلا لتعلم كيفية التعامل مع الدهون بعناية.
لإعداد محلول ميثيل-بيتا-cyclodextrin المشبع بالكوليسترول، أضف أولاً 064 جراماً من الميثيل بيتا-سيكليكسسترين إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، مع تحريك الحل بعارضة مثيرة، لضمان أن يذوب الميثيل بيتا-سيكلويكسسترين بشكل كامل. بعد ذلك، أضف 0024 جرامًا من مسحوق الكوليسترول إلى القارورة، وحرك المحلول بقوة، باستخدام ملعقة لتفريق أكبر عدد ممكن من قطع الكوليسترول. عندما تم حل ما يقرب من كل الكوليسترول، وختم قارورة مع طبقتين على الأقل من فيلم البارافين.
وهز القارورة في حوالي 30 تذبذب في الدقيقة الواحدة في حمام مائي 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد ثماني إلى 16 ساعة، تبريد الحل لدرجة حرارة الغرفة، قبل تصفية الخليط من خلال 22 ميكرومتر البولي إيثرسولفون مرشاح حقنة في زجاجة فئة. لإثراء الشريان الدماغي الثدييات، حصاد الدماغ من 250 إلى 300 غرام Sprague داولي الفئران في منقار من برنامج تلفزيوني على الجليد، قبل نقل الدماغ إلى وعاء تشريح مشمع، تحت مجهر تشريح، تحتوي على ما يكفي من برنامج تلفزيوني لغمر الأنسجة.
تأمين الدماغ مع اثنين إلى ثلاثة دبابيس، والتأكد من أنها لا تخترق الأوعية الدموية. واستخدام ملقط حادة ومقص جراحي صغير لتشريح الشرايين الدماغية وأغصانها التي تشكل دائرة ويليس في قاعدة الدماغ بلطف. المقبل، شطف لفترة وجيزة تصل إلى شرائح الشريان سنتيمتر واحد طويلة في برنامج تلفزيوني، قبل احتضان شرائح مشطف في محلول ما يكفي من الكوليسترول إثراء لتغطية الأنسجة.
لتحديد أي تعديلات في مستوى الكوليسترول ، استخدم زجاجة جديدة من مسحوق Filipin لإعداد محلول مخزون 10 ملليغرام لكل ملليلتر من الصبغة في سلفوكسيد الديثييل ، وغسل الأنسجة الغنية بالكوليسترول مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS الطازجة. بعد الغسيل الأخير، قم بإصلاح شرائح الشرايين في 4٪ شبه شكلي للدهايد لمدة 15 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء، قبل أن يتم تحديد العينات في 5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الأنسجة بثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في PBS على شاكر ، قبل إضافة العينات إلى تركيز نهائي 25 ميكروغرامًا لكل ملليلتر من محلول صبغة الفيليبين ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة ، اغسل قطع الشريان ثلاث مرات كما هو موضح ، تليها شطف قصيرة مع الماء المقطر. بعد الغسيل الأخير، استخدم نسيجاً مختبرياً لامتصاص أي سائل زائد، واركب الشرايين على شريحة باستخدام وسيلة مناسبة للتركيب. تغطية بعناية الشرايين مع زلة الغطاء، مع الحرص على تجنب المتداول أو التواء من الأنسجة، والسماح للشريحة الجافة لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وحمايتها من الضوء.
عندما يكون متوسط التركيب جافًا، قم بختم حواف زلة الغطاء بتلميع الأظافر الواضح، والسماح للتلميع بالجفاف لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم، صورة الأنسجة مع إثارة من 340 إلى 380 نانومتر، وانبعاث من 385 إلى 470 نانومتر. لإعداد التشتت القائم على الفوسفاتية ، والجمع بين 200 ميكرولترات من 10 ملليغرام لكل ملليلتر محلول الدهون المذابة ، L-ألفا - فوسفاتيديلينولامين ، 1 - Palmitoyl -2 - أوليول - sn-glycero -3 -phosphocholine ، والكوليسترول في أنبوب زجاجي 12 ملليلتر.
يتبخر الكلوروفورم في غطاء محرك السيارة تحت تيار من النيتروجين، قبل تعليق الدهون في 800 ميكرولترات من كلوريد البوتاسيوم 150 ملليمولار ومخزنة 10 ملليمترات تريس هيبس الحل. ثم ختم أنبوب مع فيلم البارافين، و sonicate بلطف محتويات الأنبوب في 80 كيلوهيرتز لمدة 10 دقائق، حتى يتم تشكيل خليط حليبي. لإثراء الكوليسترول من البويضات Xenopus، استخدم ملقط حادة لتعطيل كيس المبيض من ضفدع Xenopus الإناث في مناطق متعددة، ووضع قطع المبيض في لوحة 60 ملليمتر مع خمسة ملليلتر من الكالسيوم ND96 مجانا تستكمل مع 5 ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجيناز.
هز النسيج على شاكر مداري في 60 تذبذب في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، استخدم ماصة نقل مع طرف واسع إلى ماصة بقوة البويضة التي تحتوي على حل خمس إلى 10 مرات لعزل البويضات الفردية، وشطف بسرعة حل البويضة الداكنة مع ND96 خال من الكالسيوم الطازج حتى يصبح الحل شفافا. بعد ذلك، نقل 90 ميكرولترات من تشتت الفوسفوروليبيد المخصب بالكولسترول إلى بئر واحد من 96 بئرا، وإضافة ما يصل إلى ستة بويضات إلى البئر مع أقل متوسطة قدر الإمكان.
ضع لوحة 96 بئرًا على جهاز تدوير منصة ثلاثي الأبعاد لمدة خمس إلى 10 دقائق. ثم إضافة قطرة من ND96 إلى البئر، ونقل البويضات المخصبة الكوليسترول إلى لوحة 35 ملليمتر تحتوي على ND96 لتحليلها على الفور. هنا، مثال على صورة الشريان الدماغي طبقة العضلات الملساء يوضح زيادة التركيز تعتمد في الفلورين المرتبطة filipin الحصول على على إثراء الأنسجة مع زيادة تركيزات الكوليسترول.
لا سيما ثلاث ساعات بعد العلاج مع عقدة الكولسترول ميثيل بيتا-سيكلوسيكسترين انخفضت مستويات الكوليسترول بنسبة 50٪ تقريبا مقارنة بمستوىها مباشرة بعد التخصيب. في حين أن وقت الحضانة ساعة واحدة يستخدم عادة لإثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول خلال هذا النهج, خمس دقائق من الحضانة عادة ما تكون كافية لتحقيق زيادة هامة إحصائيا في محتوى الكوليسترول في الدم الشرياني الدماغي كما يحددها الكولسترول أوكسيديز القائمة على الإحصاءات الكيميائية الحيوية. في حين لم يلاحظ أي تغيير كبير في مستويات الكوليسترول في البويضات Xenopus المخصب مع تشتت الفوسفاتية التحكم على أساس تفتقر إلى الكوليسترول، مستويات الكوليسترول زيادة كبيرة بعد خمس دقائق فقط من العلاج مع تشتت الفوسفاتية القائمة التي تشمل الكوليسترول، وتبقى عند هذا المستوى عندما يتم زيادة وقت الحضانة إلى 60 دقيقة.
كما أظهرت فعالية النهج القائم على السيكلوديكسترين لإثراء الخلايا في الخلايا العصبية المعزولة حديثا من منطقة CA1 من قرن آمون. في الواقع, احتضان الخلايا العصبية في ميثيل بيتا-سيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول لمدة 60 دقيقة النتائج في زيادة أكثر من مرتين في مستويات الكوليسترول, كما تم تقييمها من قبل الفلوري المرتبطة filipin. عموما، فإن أهم خطوتين لهذه الإجراءات هي إعداد خليط إثراء الكوليسترول وضمان سلامة الأنسجة الشريانية.
بعد التخصيب الكولسترول, يمكن للمرء أن دراسة وظيفة البروتينات التي تتأثر ارتفاع الكوليسترول. القدرة على إثراء الخلايا مع الكوليسترول في الدم سهل دراسة مستويات الكوليسترول المرتفعة في خلايا القلب والخلايا العصبية. استخدام البويضات سمح لنا للتحقيق في كيفية ربط الكوليسترول إلى قنوات الأيونات.
معطف المختبر والقفازات التي ترتديها دائما لهذا البروتوكول. وينبغي استخدام الكلوروفورم وشبه الشكل دهدهيد تحت غطاء أبخرة، والتخلص منها كنفايات خطرة.
