هذا البروتوكول هو أسلوبنا القائم على الخلايا لإنهاء الكوليسترول في ارتجاع الكوليسترول في البلازما ceramal. خاصة في العروض. ويمكن تطبيق هذا لتشخيص مخاطر القلب والأوعية الدموية، وتحديد أو تقييم نسبة الكولسترول في الدم انخفاض الصيانة.
هذه التقنية يتجنب المخاطر والأعباء والسلامة مع التعامل مع المواد المشعة من خلال توفير النتائج مع مستويات جودة مماثلة، لتلك التي ارتجاع الكوليسترول وقد أفيد أن المنتسبين مع وهكذا، يمكن مقارنة البلازما أو ارتجاع الكوليسترول ceramal من المقبولة، إلى التحكم المرجعي لدينا، وربما توفر خطر أن تعاني من هذه الطريقة سيتم تطبيقها أيضا على خطوط الخلية ، مثل خطوط الخلايا البشرية الأخرى أو حتى مراحل الماكرو الأولية. مراحل الماكرو أو الإنسان الناجم رذاذ زر الخلايا الجذعية. لبدء هذا الإجراء، حل الكولسترول NPD في الإيثانول النقي للحصول على حل الأسهم مع تركيز نهائي من اثنين من المايكرومولار.
تخفيف 25 ميكرولترات من مخزون الكوليسترول في بنك دبي الوطني في AR 10 المتوسطة للوصول إلى تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار. الخلايا 1-1 في الثقافة 10 المتوسطة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. كل ثلاثة أيام ضبط كثافة الخلية إلى 300000 خلية لكل ملليلتر.
ثم الحصول على لوحة 96-جيدا مع أسفل مسطحة واضحة. لتحسين التجانس، وإعداد 10 ملليلتر من الخلايا thp-1 في أنبوب 15 ملليلتر، وإضافة 200 ميكرولترات من المخزون PMA. مزيج بلطف والبذور 100 ميكرولترات من الخليط في آبار لوحة في 200، 000 خلية في البئر.
واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 إلى 72 ساعة للتمييز بين الخلايا thp-1 في خلايا DM thp-1. أول تخفيف الجليسين في 10٪ برنامج تلفزيوني مع الماء المعقم، إلى تركيز 200 ميكرومولار في درجة الH 7.4. إضافة 40 ملليلتر من الجليسين المخفف إلى 10 غراما من ربط 8000 لإعداد حل ربط 20٪، ومزيج بقوة لتجانس.
التالي تطبيق أربعة أجزاء من 20٪ لكل 10 أجزاء من العينة إلى كل عينة مصل أو البلازما في أنبوب 1.5 مل. يترك الخليط على الجليد لمدة 25 دقيقة. عجّلت الطرد المركزي ربط apolipoprotein B في 13000 مرات G، وعلى أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
تجاهل العجل، ونقل المابير إلى أنبوب جديد. استرداد لوحة تحتوي على الخلايا 1-1 hp متمايزة. إزالة وتجاهل الثقافة المتوسطة، ومن ثم غسل الخلايا مرتين مع 1X PBS.
إضافة 100 ميكرولترات من 5 micromolar MVD الكوليسترول في AR-10 المتوسطة لكل بئر. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي تجاهل، تجاهل الوسيطة.
غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 100 ميكرولترات عبدز، أو متقبل الدهون النقية المخفف في دورة في الدقيقة 1630 متوسطة إلى التركيز المطلوب إلى كل بئر. وتشمل السيطرة السلبية التي لا تحتوي على المقبولين الكوليسترول في السيطرة الإيجابية، كما هو مبين في بروتوكول النص، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى ست ساعات. وفي الوقت نفسه، إعداد مخزون 200 ملليلتر من حل تحلل الخلية واحد كما هو مبين في النص.
اخلط هذا الحل مع الإيثانول، بنسبة حجمية واحدة إلى واحدة للحصول على حل التحلل أيضًا. لوسائل الإعلام والكشف عن الكوليسترول BD، وإزالة المتوسطة الخلية من لوحات في جمعها في لوحة بيضاء جديدة 96-well مع قاع مسطحة معتمة. إضافة 100 ميكرولترات من الإيثانول النقي إلى 100 ميكرولترات من كل عينة متوسطة للحصول على نسبة واحد إلى واحد في لوحة جديدة.
باستخدام مقياس الإضاءة، وقياس شدة الفلورسنت في استثارة من 463 نانومتر، وانبعاثات من 536 نانومتر. للكشف عن الكوليسترول في بنك دبي الوطني داخل الخلايا، قم بغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. إضافة 100 ميكرولترات من محلول التحلل أيضا إلى كل بئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة، في حين تهتز لمدة 25 دقيقة.
بعد ذلك، قم بقياس شدة الفلورسنت مع ضبط معلمة الحساسية إلى 50 في البرنامج. ثم تحديد معدل الكولسترول efflux في التدبير النهائي للكوليسترول efflux كما هو مبين في بروتوكول النص. يخفف الكولسترول في الايثانول النقي ينتج أعلى قيم كثافة الفلورسنت بينما محتوى عال في محلول مائي، يقلل من الكثافة.
وهذا يشير إلى أن انبعاث الفلورسنت من هذا الجزيء يعتمد اعتمادا كبيرا على الوسط، الذي يتم احتواؤه. عند استخدام مزيج من وسائل الإعلام والإيثانول بنسبة واحد إلى واحد، كثافة الفلورسنت ويبدو أن زيادة تناسبيا، مع تركيز التناظرية الكوليسترول، مما يشير إلى أن التحقيق يتصرف المناسبة في ظل هذه الظروف. لتحديد مقدار الوقت اللازم لاحتضان الخلايا المحملة مع المقبولين الكوليسترول، يتم حصاد وسائط الخلية في نقاط زمنية مختلفة.
تطور الكولسترول efflux خطيا من صفر إلى ست ساعات، مع التقاط الإشارة القصوى بعد ست ساعات من إضافة عبدز إلى الخلايا. يتم اختبار عتبة التشبع والنطاق الديناميكي من خلال قياس efflux الكوليسترول في نسب مختلفة من HDL التي تحتوي على وسائل الإعلام. في الأصول الإنتاجية العالية ، تتطور efflux خطيا من واحد إلى 7 ٪ ABDS ، لتصل إلى ذروة قدرة efflux الكوليسترول بنسبة 7 ٪ عند تركيزات أعلى من 7 ٪ كثافة fluroescent يقلل في علاقة عكسية مع نسبة ABDS.
ثم يتم تقييم أداء الأسلوب القائم على الفلوريسنس بمقارنته بالتقنية الراديوية القياسية التي تحمل علامة. وكلتا التقنيتين مترابطتان ترابطاً شديداً عند استخدام تركيزات مختلفة من الـ ABDS. الطريقة الموصوفة حساسة لزيادة تركيزات المقبول داخل قيم الكولسترول efflux بين خمسة و 15٪ من المهم التأكد من أن celluarizer يحتوي على أي مجاميع.
النقطة الحرجة هي لتصنيف الإيثانول الكلي الذي يحتوي على بيئة، لقياس الفلوريسنس في الوزن المتجانس، والأمثل. بعد هذا الإجراء، يمكن قياس اسم الكوليسترول التقني، ويمكن تحديد تأثير الأدوية في مسار الكولسترول efflux. أيضا المدرسة في نهاية المطاف أن تستخدم كتشخيص لمخاطر القلب والأوعية الدموية.
ونحن نعتقد أن هذه الطريقة أسهل بكثير وأكثر أمانا من الطريقة القياسية المشعة. ومع ذلك لا يزال تابعاً للخلية. يرجى تذكر أن الإيثانول قابل للاشتعال ويجب تخزينه والتعامل معه وفقا لذلك.
