우리는 비디오 편집에서 자신의 도움을 야곱이 솔리스 감사드립니다. 이 작품은 MJ Levene에 NSF 경력 수상 DBI-0953902이 부분에 자금을 지원했다.

1. 동물 재관류 5 전체 마우스 뇌 정산 <ol><li> 프로 시저의 전체 길이는 탈수 단계 당 사용 시간의 길이에 따라 달라질 수 있지만, 총 전체 과정은 두 개의 일 실시 할 수 있습니다. </li><li> YFP 마우스 무게 그리고 깊이 케타민 / xylazine (100 밀리그램 / kg : 10 밀리그램 / kg)의 intraperitoneal 주사로 마취. </li><li> 수술하기 전에 깊은 마취의 수술 비행기를 확인합니다. 동물에게이 회사의 발가락이나 꼬리 핀치에 반응하는지 확인하기 위해 매 5 분을 확인합니다. 동물이 반응하면 케타민 / xylazine의 보충 복용 (원본 용량의 1 / 3)가 필요합니다. </li><li> 일단 깊이 anesthetized, 마우스가 수술의 가슴 노출, 위로 향한 위치 (등쪽 recumbancy)에 있도록 실험실 테이프를 사용하여 수술 침대에 각 다리를 준수하여 마우스를 억제. 수술 침대는 보통 금속이나 플라스틱 메쉬 만든 및 세면대로 또는 입술 - 팬의 상단에 배치됩니다 있도록 혈액 및 정착액폐기물은 쉽게 수집 할 수 있습니다. </li><li> 시작하려면 xyphoid 과정 아래 절개를합니다. 가위와 핀셋을 사용하여 갈비의 기본을 따라 잘라 컷이 완료로 피부를 뒤로 빼는거야. 마우스 가슴의 양쪽 두명 인하 (갈비까지) 심장이 노출 떠날 hemostat를 사용하여 흉강에서 떨어져 개최되는 조직의 플랩을 만들 할 수 있습니다. </li><li> 심장의 왼쪽 심실에 23g 바늘을 삽입하고 혈액이 탈출 할 수 있도록 오른쪽 심방의 근육 벽의 작은 절개를합니다. 이 절차의 동영상 기사 2497을 주피터를 참조하십시오 5. </li><li> 오른쪽 심방이 절단 후 즉시, 4 재관류를 시작 ° C 피가 더 이상 심장의 우심방 (30에서 에너지가 관찰되지 때까지 인산염은 PBS (산도 7.2) 생리 버퍼 - 약 5의 비율로 40 ML ML / 분). </li><li> 일단 모든 혈액 (오른쪽 아트리움을 종료 유체가 분명하다) 배수되었습니다 차가운 4 % 재관류 매체를 전환PFA 솔루션입니다. 마우스의 몸 터치 (- 5 ML / 분의 속도로 40 ML 약 30)에 띄게 강성과 차가운 될 때까지 Perfuse. (농축 16% PFA 솔루션은 제조업체의 지침 및 산도 7.2에 도달 할 때까지 NaOH를 추가에 따라 희석된다. 장갑과 실험실 코트를 입고 연기 후드 내부의 화학 물질을 처리하고 섞는다.) </li><li> 재관류 후 수술 침대에서 마우스를 제거하고 뇌의 절단을 시작하는 목을 베다. </li><li> 포셉 및 홍채 가위 사용하여 두개골의 뒷면에서 시작하여 앞으로 이동 작은 섹션에 두개골을 제거합니다. 조심스럽게 작은 부분에 뇌에서 떨어져 뼈를 뽑아 포셉를 사용하는 동안 머리에서 가위로 4mm - 작은 상처 매 2을 만듭니다. 뇌의 전체 상단 표면이 노출 될 때까지이 작업을 수행합니다. </li><li> 소비세 유리관에 5 폭 mm, 평면 주걱과 장소를 사용하여 두개골에서 뇌. 포스트 고정 4 6 시간에 4% PFA ° C에서 잠수. </li><li> 게시 한 후고정, 유리 약병의 PFA를 주입하고 PBS로 교체하여 방 온도 PBS에 두 번 뇌를 씻어. 쏟아 및 제 세척을 위해 PBS로 교체하기 전에 PBS 솔루션의 소용돌이 뇌합니다. </li><li> 등급 부화 당 2 시간의 에탄올 incubations의 시리즈 (한 번에 50 %, 70 %, 95 %, 그리고 두 번이나 100 %), 후 두 번째 100 % 에탄올 보육 12 시간으로 실온에서 뇌를 탈수,에 고정 조직에서 물을 압축을 풉니 다. 각 부화를 들어, 유리관에서 이전 에탄올 솔루션을 쏟아과 뇌가 완전히 침수 될 때까지 이후의 솔루션으로 대체. </li><li> 100 % 에탄올에서 두 번째로 부화 후 솔루션을 쏟아과 같은 부품 에탄올과 벤질 알코올 및 벤질 벤조산을 (1시 2분 권 : 권 비율)이 포함 된 개간 솔루션으로 교체하십시오. 부화, 가만히 따르다이 솔루션의 2 시간 후와 벤질 알코올 및 벤질 벤조산 (1시 2분 권 : 권 비율)의 100 % 솔루션으로 교체하십시오. refra개간 솔루션의 ctive 인덱스는 N = 1.54입니다. </li><li> 일단 BABB에, 뇌는 4 안에 현저하게 투명한 될 것입니다 - 5 시간. 가장 소요되는 결과를 얻으려면 밝은 빛으로부터 차폐하는 동안 뇌는 실온에서 6 일간을 취소 둡니다. </li></ol> 2. 현미경 설정 <ol><li> 뇌 이미징을 허가 준비되면, 페트리 접시의 바닥에 부착은 시아 노 아세틸렌 사용합니다. 접착제 계속하기 전에 건조하도록 허용합니다. </li><li> 건조 후, 잠수함 BABB의 뇌를 및 이미징을위한 현미경 대물 아래의 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> 우리는 990 나노 미터 여기 파장에 대한 710 nm의 사이에 조절 마이 타이 티타늄 사파이어 레이저를 통합 multiphoton 현미경을 사용합니다. 우리가 YFP 신호를 생성 할 때 사용하는 여기 파장은 886 nm의 것입니다. 레이저 전력은 30 일부터 다릅니다 - 100 MW는 영상의 깊이에 따라 다릅니다. </li><li> 대형을 허용 니콘 5 배 목표 (NA, 0.5)를 사용하여 반사 형광 신호를 캡처뷰 필드 영상 (2 X 2mm). </li><li> 50분의 535 대역 통과 필터를 사용하여 반사 형광 신호를 필터링하고 GaAsP PMT (H7422PA-40, 하마 마츠, 브리지 워터, 뉴저지)를 사용하여 수집합니다. </li><li> 높은 해상도, YFP 이미지를 생성하는 2 밀리 초 당 라인의 스캔 속도를 사용하여 2048 X 2048 픽셀의 해상도로 ScanImage 소프트웨어 6을 사용하여 프로세스 이미지를 표시합니다. </li><li> 일단 이미지가 완료되면 미래의 이미징을위한 빛으로부터 차폐 포셉 및 BABB에 저장을 사용하여 페트리 접시에서 뇌를 제거합니다. 접착 샘플의 경우, 30도보다 더 큰 각도로 접착제와 페트리 접시 사이에 면도날을 실행하여 조직을 제거합니다. 우리는 눈에 띄는 저하와 함께 1 년에 BABB에서 샘플을 저장합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 여기에 표시 대표 이미지 및 동영상은 광학 삭제하여 가능하게 고해상도 multiphoton 이미징 기능을 보여줍니다. 전체 뇌 영상이 있습니다YFP - 표시 해마와 피질의 다른 레이어의 뉴런이 조직 표면 아래 2mm로 깊이로 명확하게 볼 수 있습니다. 그림 1의 해마의 해부학 적 기능에 해당하는 코로나보기의 대표 이미지 꼬리 2.92 mm에서 보여줍니다 bregma 7. 예제에서 이미지의 깊이가 1.94 mm이었다. 이 차이의 일부는 뇌의 꼬리 끝에있는 소뇌의 제거로 인해이고 잔액은 탈수 과정에서 수축으로 인해했다. 스택에서 다른 이미지는 조직 표면 (그림 2) 아래에 YFP 2mm을 표현 네크로의 레이어 V / VI 피라미드 뉴런을 보여줍니다. 모든 이미지는 니콘 5 배 객관적이고 배율이 ScanImage 소프트웨어에서 이미지 수집을 위해 디지털 줌 기능을 사용하여 이루어졌다 이용하여 획득 하였다. 네크로의 확대함으로써, 네크로의 레이어 V의 피라미드 뉴런의 개별 axons과 신경 세포 기관은 명확하다지적인 조직의 표면 아래에 1.02 mm (그림 3)까지 구별. 그림 3에서 이미지 스택을 사용하여 뉴런 지역의 3D 복원이 ImageJ 소프트웨어 8 (그림 4)를 사용하여 만들어졌습니다. MPM의 고해상도 기능은 우리 전체, 개별 뉴런의 이미지를 제공 할 수 있습니다. 여기 개별 수지상 프로세스가 명확하게 볼 수 있습니다하는 네크로 (그림 5)의 레이어 V 피라미드의 신경 세포의 재건을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" /> 그림 1 1.2 mm 이미지 스택에서 대표 이미지 (0.8 - 조직의 표면 아래 2mm). 네크로와 해마의 다른 층을 보여주는 전체 마우스 뇌의. 해마의 특징은 조직의 표면 아래에 1.1 mm 볼 수 있으며 후속를 사용하여 라벨이되었습니다ING 번호 :. DG = 이가있는 이랑, DG의 = 세분화 된 계층을 GrDG, Lmol = lacunosum moleculare 층, 몰 = 분자 층 DG, 또는 = oriens 층, PoDG = polymorph 층 DG, 평 = 피라미드 세포 층, RAD = 지층 radiatum 7 이미지가 1.8 X 1.8 mm의 크기, 규모 바 = 200 μm이다. 뇌의 뱃 부리 장식이있는 끝은 목표를 향해까지 직면하고있는 꼬리 끝 페트리 접시에 부착되었다. 이 코로나 비행기에 이미지를 촉진. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" /> 그림 2 1.2 mm 이미지 스택에서 대표 프레임 (0.8 - 조직의 표면 아래 2mm). 네크로을 강조 전체 마우스 뇌의. 피질의 레이어 V / VI에 YFP을 표현 피라미드 세포와 프로세스는 조직의 표면 아래에 보이는 2mm 있습니다. 라벨의 정도는 네크로의 희박한 라벨의 이전 보고서와 일치한다. 삽입 9 (오른쪽) B에서 확대됩니다<html> 왼쪽에 oxed 공간이 마련되어 있습니다. 이미지 크기가 1.8 X 1.8 mm이며, 규모의 바 = 200 μm (50 μm 삽입). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" /> 그림 3. 대표 프레임 뇌의 네크로의 레이어 V 피라미드 뉴런의 이미지 스택에서 조직의 표면 아래에 774 μm를 취. 스택 700 μm에서 조직의 표면 아래 1,020 μm로 이동합니다. 8X 디지털 줌은 이러한 고급 프로세스와 같은 세부 정보를 캡처하는 데 사용되었다. 이미지의 크기는 225 x 225 크기 μm, 스케일 바 = 20 μm이다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" /> 그림 4. 그림 3에서 이미지 스택의 3D 재건의 대표 이미지 (225 x 225 크기 X 320 μm). 이미지의 크기는 225 x 225 크기 μm, 스케일 바 = 28 μm이다. S &quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" /> 그림 5. 10X 디지털 줌을 사용하여 네크로의 레이어 V 피라미드의 신경 세포의 고해상도 복원 이미지입니다. 뉴런의 길이, 스케일 바 = 25 μm에서 485 μm를 측정합니다. 각 이미지 타일에 대한 시야는 180 μm X 180 μm이다. 각 타일은 서로 다른 깊이 (Z-레벨)에 있습니다. 대뇌 피질의 꼭대기 수석이 일반적으로 명시 적 YFP뿐만 아니라 소마에서하지 않습니다. 여기에 도시 된 바와 같이, 전원이 소마의 채도를 최소화하기 위해었다,보기 같은 분야에서 모두가한다이 미세 공정 모양의 주차를합니다. 여기에 우리의 강조보다는 세부 사항보다 뷰 필드를 시연 있었다. 미세한 세부 정보를 공개하려면, 소마없이 지역에 초점을, 디지털 줌을 사용하고, 레이저 파워를 향상시킬 수 있습니다.

<ol>
	<li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs.">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).</li><li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+fluorescence,+second+harmonic+generation,+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs.">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy:+Morphology+and+apoptosis.">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li><li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography:+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing.">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li><li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging.">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP.">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li></ol>

동물 실험은 예일 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

표준 유기 염료는 유기 용제의 범위와 호환되는, 따라서 프로토콜을 삭제하기위한 특정 과제를 포즈를하지 않는 반면, 형광 단백질은 용매에 자주 변화를 덜 관대합니다. 현재 작업의 4 목표는의 심각한 한계를 극복하는 것이 었습니다 XFPs의 형광이 분실 또는 심각하게 저하 된 이전 광학 소요되는 프로토콜. 여기에 표시되는 이미지가 YFP의 형광을 보존되었다고 보여줍니다. 여기에 설명 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 인산염은 식염 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> D8537 </td><td> 500 ML, pH를 7.2 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td> 10 × 10 ML, 16 %의 paraformaldehyde </td></tr><tr><td> 에틸 알코올 </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB00515-00500 </td><td> 500 ML, 200 증명 </td></tr><tr><td> 에틸 알코올 </td><td> Pharmco 제품, 주식회사 </td><td> 111000190 </td><td> 한 여자., 190 증명 </td></tr><tr><td> 벤질 알코올 </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> 402834 </td><td> 500 ML 99 + % </td></tr><tr><td> 벤질 벤조산 </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> B6630-IL </td><td> 500 ML, ≥ 99% </td></tr><tr><td> 5X/0.5 NA 목표 </td><td> 니콘 </td><td> 5 배 AZ 계획 밀가루 </td><td> 15 WD </td></tr></tbody></table>

multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing yfp

전체 마우스 기관의 고유 형광와 두 번째 고조파 세대 (SHG)의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하여 가능하게됩니다. 1,2 그러나, GFP 및 YFP 등의 형광 단백질을 포함 기관, 메탄올을 사용하는 광학 소요되는 프로토콜 벤질 알코올 사용 탈수와 투명 : 빛 3에서 보호하면서 벤질 벤조산 (BABB)는 형광 신호를 보존하지 않습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 뉴런으로 표현 YFP의 형광 신호를 유지하면서 마우스 뇌에 전체 기관이 광학 개간을 수행 할 수있는 새로운 방법입니다. 기관은 형광 단백질에 손상을 줄이고 multiphoton 이미징 대한 형광 신호를 보존하는 것으로 확인되었습니다 에탄올 등급 시리즈를 사용하여 건조하다고 등의 광학 소요되는 프로토콜을 변경. 4 에탄올 기반의 탈수와 광학 소요의 최적화 방법을 사용하고 BABB에 의해 삭제빛으로부터 차폐하는 동안, 우리는 조직의 표면 아래 2mm 이상 마우스 뇌의 뉴런에 노란색 형광 단백질 (YFP) 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

Watch this Scientific Journal Video about Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP at JoVE.com

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K 조회수.  Yale University. 전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

비디오: Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

연구

신경과학

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

초점을 맞춘 이온 빔은 밀링 및 뇌 조직의 전자 현미경을 스캐닝

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...