الكتاب أشكر NIH (AI074224 وGM085323) وجبهة الخلاص الوطني (0712019 0924699 و) للحصول على تمويل لدعم مشاريع مخصصة لغيري الحيوي.

النص أدناه هو محددة لالاريثروميسين مضاد حيوي، ولكنها مصممة على خطوات لتكون قابلة للتطبيق عموما لمنتجات الطبيعية الأخرى كمرشحين لغيري الحيوي. 1. الاريثروميسين A نقل الكتلة الوراثية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم الاشعال لتضخيم PCR كل من الجينات المرتبطة الاريثروميسين كتلة داخل S. قنطريون أحمر كروموسوم. هذه الخطوة هي محددة لهؤلاء المرشحين الذين نتاج طبيعي الوراثية وقد تم تحديد متواليات. بدلا من ذلك، يمكن توليفها الجينات المطلوبة (من خلال عدة خيارات بائع التجارية) مع ميزة أن تصميم جينات مركبة جديدة للاستخدام الأمثل كودون داخل E. جديدة القولونية المضيفة. إذا اتبعت توليف الحمض النووي، والتحدي الحالي هو توليد الجينات التي قد تتجاوز megasynthase 10 كيلو بايت في الطول. من الناحية الفنية، ويمكن تحقيق التوليف، لكنه يمثل تحديا ومكلفة. من المتوقع أن استمرار improvemوالوالدان في تكنولوجيا الجينات معالجة السلبيات التوليف الحالية والتحقق من صحة هذا النهج كذلك لتوفير المادة الوراثية مغاير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء PCR باستخدام S. الطازجة قنطريون أحمر الحمض النووي الجيني كقالب. قد تكون مستعدة للDNA الكروموسومات من ثقافات S. قنطريون أحمر أو من المخزونات المجمدة للبكتيريا (الشكل 3) 25. قد تستفيد من ردود الفعل PCR إضافة DMSO (4 ميكرولتر في 50 ميكرولتر ردود الفعل) لحساب نسبة عالية من C G+ في الهدف S. الجينات قنطريون أحمر. يجب أن تكون متسلسلة كل الجينات تضخيم لتأكيد أنه تم استرجاع الجين الكاملة والتي أدخلت الطفرات لا أثناء عملية PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من خلال تقييد وربط هضم، إدراج كل من الجينات المعزولة في التعبير ناقلات مصممة لE. القولونية (الشكل 3). يبدأ هذا من خلال تصميم مواقع داخل تقييد الاشعال PCR للسماح الهضم وربط في السابق مناسبةناقلات pression (أدرج مثالا في الشكل 3). وقد استخدمنا كل pET21 وناقلات pET28. الناقل pET28 يسمح بإدراج تسلسل زعيم 5 &#39;الذي ساعد في التعبير الجيني الاريثروميسين A القضية. تأكيد الفردية التعبير الجيني من خلال RT-PCR، SDS-PAGE تحليل (باستخدام الكسور البروتين للذوبان)، أو المقايسات المظهري مريحة (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء على أساس الجينات operons أعرب بنجاح من البلازميدات التعبير الفردي (الشكل 3). وقد استخدمنا تقليديا مجموعات من الإنزيمات قيود متوافق مع متماسكة (مثل Xba الأول وجمعية مهندسي البترول I) 24 بشكل تسلسلي لتحويل الجينات إلى operons، إلا أن المواقع المختارة لتقييد البناء OPERON يجب ألا تتواجد داخل (أو يجب إزالة من) معزولة تسلسل الجينات (وهي القضية التي يمكن تجنبها إذا تم استخدام توليف الجينات). هذه الخطوة يعزز الاريثروميسين 20 A الجينات قبل E. القولونية transformation. حاليا، وقد استخدمنا هذا الأسلوب لتشمل ما يصل إلى 20 كيلو بايت من الحمض النووي الأجنبية إلى ناقل الحيوانات الأليفة القياسية (من اثنين من الجينات KB 10 ~ لكل منهما). وعلاوة على ذلك، وقد استخدمنا هذا النهج لتوليد operons تضم تسعة الجينات. ومن غير المعروف بالضبط كم DNA أو الجينات كم يمكن دمجها في نوع PET-البلازميدات، إلا أن المقاييس المذكورة أعلاه توفر مرجعية لأنظمة معقدة مثل الاريثروميسين طريق السكروز. وأخيرا، ومعيار في الخطوات اللاحقة وربط المختبر خطوات التحول الناجح يصبح من الصعب على نحو متزايد مع زيادة حجم OPERON والبلازميد. درجة الحرارة ربط (12-22 ° C) والوقت (3-24 ساعة) متنوعة ويستخدم الكهربائية التحول للمساعدة في عملية إنتاج بنيات البلازميد النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل السكروز البلازميدات المصممة حديثا في E. القولونية سلالة BAP1 الكهربائية باستخدام التحول (الشكل 5). قد حاول الإجراء مع البلازميدات قدم إما بشكل تسلسلي أو في المشاركةmbination. عندما تحويل الحجم قادرة أو البلازميدات عديدة، وقد استخدمنا تقليديا الكهربائية التحول (على العكس من التحول الكيميائي). تحولت مرة واحدة، لوحة الخلايا على المتوسط ​​LB الصلبة التي تحتوي على التتراسيكلين (5 ملغم / لتر)، كربنيسيلين (100 ملغ / ل)، الكاناميسين (50 مجم / لتر)، الستربتوميسين (50 مجم / لتر)، وأبراميسين (50 ملغ / لتر ) لتحديد لصيانة بلازميد. أنه من غير المألوف للغاية لاستخدام المضادات الحيوية الستة المختلفة بعد اختيار التحول لE. خلية بكتيريا، ولكن هذا يعكس ببساطة العدد الإجمالي للالبلازميدات اللازمة للسماح الاريثروميسين النهائي A الحيوي. في حين أمكن، فإن نهج الحد من القدرات الإنتاجية للمجمع مرة واحدة وقد بدأت زراعة (انظر أدناه). </li></ol> 2. E. السكروز القولونية إعادة إعماره <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تم تصميم BAP1 سلالة لتوفير ركائز المطلوبة لالحيوي ومرحلة ما بعد translationally تعديل megasynthase B deoxyerythronolide. فرد جينات erytوقد تم اختبار hromycin طريقا للتعبير الجينات والموحدة كما في operons البلازميدات التعبير. وهذا القسم مخصص للظروف الثقافة لاختبار النشاط متضافرة من الاريثروميسين كامل طريقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 3 مستعمرات منفصلة من BAP1 تحولت حديثا وتطعيم 1.5 مل تحتوي على الثقافات LB المطلوبة المضادات الحيوية اختيار البلازميد (في تركيزات نفس المشار إليه أعلاه لتحديد لtransformants على وسط الصلبة)، الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG و 100 ميكرومتر ) وأرابينوز (2 ملغ / مل) للحث على التعبير الجيني، و 20 ملي الصوديوم بروبيونات لدعم تشكيل الخلايا السلائف السكروز. مرة واحدة وقد تم تأكيد الإنتاج، قد يتم إجراء أكبر الثقافات في محاولة لتوسيع نطاق المنتجات وتعظيم التتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا في 22 ° C و 250 دورة في الدقيقة لمدة 24-48 ساعة. في هذه الحالة، واختيار المضاد الحيوي يضمن الحفاظ على البلازميدات المطلوبة في المراحل الأولى للثقافة الخلوية. ومع ذلك، بلازميدويمكن ليالي خسر بسهولة اختيار مستويات المضادات الحيوية تغيير على مدى فترة زراعة. وهذا قد يؤدي إلى عدم الاستقرار بلازميد (أي فقدان واحد أو أكثر خلال البلازميدات الثقافة)، والذي من شأنه أن يحد ثم القدرة على الإنتاج. وتتفاقم المشكلة عندما تستخدم البلازميدات غير متوافق لإدخال الجينات كاملة الكتلة مغاير. هذا هو الحال بالنسبة للمجمع الاريثروميسين A (الشكل 5) ويتعين معالجتها على الإفراط في الإنتاج حقا من المجمع E. القولونية. ومع ذلك، لغرض إثبات الإنتاج المبدئي، يتم التسامح مع مثل هذه العيوب في التصميم من أجل إنشاء بسرعة جدوى النهج مغاير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضيح الثقافات بواسطة الطرد المركزي عند 10،000 دورة في الدقيقة في microfuge إيبندورف. إزالة طاف وتخزينها في 4 درجات مئوية لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة وجود الاريثروميسين، قلة إنتاج مركب كانت موجهة من قبل إدراج chaperonin GroES / EL (باستخدام pGro7خصيصا لمعالجة نقص نشاط الانزيمات التعبير عن آخر) وإدراج نسخ الجين إضافية (على تلك الجينات يشتبه في التعبير ضعيفة / النشاط). قد تكون هناك حاجة استراتيجيات مماثلة مع غيري الطبيعية الأخرى جهود إنتاج المنتج. </li></ol> 3. تحليل المنتج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتأكيد وتحديد الاريثروميسين A تشكيل، حقن طاف الثقافة على نظام LC-MS (الشكل 6). الاريثروميسين المتاحة تجاريا واستخدم لتأكيد الإنتاج وكمعيار خلال القياس الكمي. لحالات دون المعايير المتاحة تجاريا، سوف LC-MS تحتاج الى مزيد من التحليل الخواص الكيميائية بواسطة NMR وارتفاع القرار مطياف الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة بين إنتاج المستعمرات 3 / ثقافات من التحول BAP1. اختيار أعلى المنتجة وإعداد الأسهم الجلسرين من المصدر مستعمرة. ويمكن أن يتم هذه الخطوة بالتوازي مع الثقافات إنتاج قسم البروتوكول2 باستخدام جزء صغير من الثقافات لإعداد مخزون الجلسرين. تخزين المخزون الجلسرين في الفريزر -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أكد أعلى، والأوراق المالية الخلية المنتجة، تبدأ إنتاج ثقافة منفصلة واستخراج طاف النهائي مع حجم 2X إيثيل أسيتات. استخدام نظام التبخر فراغ لتجفيف استخراج و resuspend في 100 ميكرولتر الميثانول. نقل إلى القرص استخراج مرشح العقيمة (~ قطر 1/4 بوصة) والسماح ليجف القرص. بشكل منفصل، والثقافة، B. subtillis في السائل LB بين عشية وضحاها. إضافة 20 ميكرولتر من B. ثقافة الرقيقة إلى 20 مل من السائل LB أجار في 45 ° C. لوحة للأجار والسماح لترسيخ. ضع القرص تصفية على لوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية (الشكل 7). وبدلا من ذلك، يمكن إضافة استخراج السائل على الثقافات داخل لوحة 96-جيدا لقياس النشاط باستخدام قارئ لوحة (الشكل 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products.">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li><li>Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+an+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea+for+stable+expression+of+the+Vitreoscilla+haemoglobin+gene+(vhb).">Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb).</a> Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modulation+of+the+overexpression+of+tailoring+genes+eryK+and+eryG+leading+to+the+improvement+of+erythromycin+A+purity+and+production+in+Saccharopolyspora+erythraea+fermentation.">Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).</li><li>McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Ilotycin,"+a+new+antibiotic.">"Ilotycin," a new antibiotic.</a> Antibiot &amp; Chemother. 2, 281-284 (1952).</li><li>Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+erythromycin+production+in+a+genetically+engineered+industrial+strain+of+Saccharopolyspora+erythraea.">Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea.</a> Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).</li><li>Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+uptake+rate+optimization+with+nitrogen+regulation+for+erythromycin+production+and+scale-up+from+50+L+to+372+m3+scale.">Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale.</a> Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).</li><li>Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+options+for+the+heterologous+production+of+complex+natural+products.">Methods and options for the heterologous production of complex natural products.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).</li><li>Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusually+large+multifunctional+polypeptide+in+the+erythromycin-producing+polyketide+synthase+of+Saccharopolyspora+erythraea.">An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.</a> Nature. 348, 176-178 (1990).</li><li>Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+genes+required+for+complex+polyketide+biosynthesis.">Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis.</a> Science. 252, 675-679 (1991).</li><li>Salah-Bey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+for+the+elucidation+of+deoxysugar+biosynthesis+in+the+erythromycin+producer+Saccharopolyspora+erythraea.">Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea.</a> Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).</li><li>Summers, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+and+mutagenesis+of+genes+from+the+erythromycin+biosynthetic+gene+cluster+of+Saccharopolyspora+erythraea+that+are+involved+in+L-mycarose+and+D-desosamine+production.">Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production.</a> Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).</li><li>Corre, C., Challis, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+natural+product+biosynthetic+chemistry+discovered+by+genome+mining.">New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).</li><li>McAlpine, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+understanding+and+use+of+the+genomic+base+of+microbial+secondary+metabolite+biosynthesis+for+the+discovery+of+new+natural+products.">Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products.</a> J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).</li><li>Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+basis+for+natural+product+biosynthetic+diversity+in+the+actinomycetes.">Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes.</a> Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).</li><li>Oliynyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+erythromycin-producing+bacterium+Saccharopolyspora+erythraea+NRRL23338.">Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338.</a> Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).</li><li>Wilkinson, B., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+and+engineering+natural-product+biosynthetic+pathways.">Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).</li><li>Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+exploiting+intermodular+communication+in+polyketide+synthases.">Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases.</a> Science. 284, 482-485 (1999).</li><li>Quadri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Sfp,+a+Bacillus+subtilis+phosphopantetheinyl+transferase+for+peptidyl+carrier+protein+domains+in+peptide+synthetases.">Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases.</a> Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).</li><li>Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+complex+polyketides+in+a+metabolically+engineered+strain+of+E.+coli.">Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli.</a> Science. 291, 1790-1792 (2001).</li><li>Lee, H. Y., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay-guided+evolution+of+glycosylated+macrolide+antibiotics+in+Escherichia+coli.">Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli.</a> PLoS Biol. 5, e45 (2007).</li><li>Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+potent+antibacterial+polyketide+erythromycin+C+in+Escherichia+coli.">Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).</li><li>Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+engineered+Escherichia+coli+for+efficient+production+of+glycosylated+natural+products.">Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products.</a> Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).</li><li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering.">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li><li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host.">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

واجهت خطوات حاسمة في التركيب الحيوي مغاير في كل من النقاط الثلاث الإجرائية في العملية: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة السكروز، و 3) تحليل المنتج. وهناك مشكلة في أي مرحلة عرقلة الهدف النهائي من إنشاء الحيوي مغاير. ولعل الجانب الأكثر تحديا لعملية التركيب الحيوي وإنشاء المعاد، ح...

الاريثروميسين هو مضاد حيوي A متعدد الكيتيد التي تنتجها إيجابية الجرام بكتيريا التربة Saccharopolyspora قنطريون أحمر، وقد تحسنت تدريجيا الإنتاج الحالي إلى 10 ~ L / ز خلال عقود من الطفرات والبروتوكولات التقليدية الفرز، ومؤخرا من خلال خطط عملية التحسين 1-6. الطفرات وفحص استراتيجيات شائعة في المضادات الحيوية وتطوير المنتجات الطبيعية نتيجة لصعوبات في زراعة و / أو التلاعب وراثيا تستضيف الإنتاج الأصلي وبسبب النشاط المضاد الحيوي متاحة بسهولة أو الظواهر تحسن النمو لمساعدة الاختيار. في حالة وجود الاريثروميسين، S. ويقتصر قنطريون أحمر من قبل الملف النمو البطيء وعدم وجود أكثر مباشرة تقنيات التلاعب الجيني (نسبة إلى الكائنات الحية مثل الإشريكية القولونية)، وبالتالي، عرقلة تحسينات سريعة في الإنتاج والتركيب الحيوي للمشتقات جديدة. بعد أن أدرك قضايا الإنتاج ومقفلة diversificatiعلى الاحتمالات مع مركبات مثل A الاريثروميسين، بدأت الأوساط البحثية لمتابعة فكرة الحيوي غيروي (الشكل 1) 7. تزامنت هذه الجهود مع تسلسل المعلومات المتاحة لالاريثروميسين كتلة الجينات 8-11. ينبغي التأكيد على أن عدد المعقدة الطبيعية التسلسل الجيني مجموعات المنتجات وسعت إلى حد كبير 12-16، توفير الزخم اللازم للاستمرار في الجهود للوصول مغاير الحيوي المحتملة الطبية المشفرة. للقيام بذلك، إعادة مغاير يتطلب أن المضيف الجديد تلبية احتياجات محددة طريق السكروز. E. القولونية توفر الراحة الفنية، ومجموعة واسعة تمتد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية، والهندسة استراتيجيات عملية التمثيل الغذائي وتطوير المنتجات ل. حتى الآن، بالمقارنة مع المضيفين الإنتاج الأصلي، E. القولونية لا يحمل نفس المستوى من مجمع لإنتاج المنتجات الطبيعية. ولم يعرف ما إذا كان ذلك E. يمكن أن تكون بمثابة القولونية الخيار لغيري قابلة للمجمع الحيوي المنتج الطبيعية. ومع ذلك، كان من المفترض أن E. والإشريكية يكون الكائن الحي المضيف المثالي يمكن أن يتحقق إذا الحيوي مغاير. مع هذا الهدف في الاعتبار، بدأت الجهود الأولية لإنتاج الجزء اللاسكري متعدد الكيتيد 6 deoxyerythronolide B (6dEB) من خلال E. القولونية. ومع ذلك، E. الأصلي يمكن التمثيل الغذائي القولونية لا توفر مستويات ملموس من بروبيونيل، لجنة الزراعة و(2S)-ميثيل، لجنة الزراعة السلائف اللازمة لدعم الحيوي 6dEB ولا يمكن للمضيف جديد بعد translationally تعديل سينسيز B deoxyerythronolide (DEBS) الانزيمات. لمعالجة هذه القضايا، تم بناء المسار الأيضي تتألف من الإنزيمات الأصلية وغير متجانسة إلى E. القولونية بحيث تم تحويل الاحتياطي الفيدرالي خارجيا بروبيونات داخل خلوي لبروبيونيل، لجنة الزراعة وبعد ذلك (2S)-ميثيل، لجنة الزراعة، وخلال الهندسة لاستكمال هذا المسار، وضعت جين SFP في الكروموسوم (ه) من E. ووصف القولونية BL21 (DE3) لإنتاج سلالة جديدة BAP1. الانزيم هو قادر SFP phosphopantetheinyl ترانسفيراز من العامل المساعد إرفاق 4&#39;-phosphopantetheine إلى الإنزيمات DEBS 17،18. ثم وضعت ثلاثة DEBS الجينات (كل ~ 10 KB) على اثنين من ناقلات التعبير بشكل منفصل تحتوي على اختيار محرض المروجين T7. بعد تعديل مفتاح من بعد تحريض درجة الحرارة (C ° إلى 22)، وأعرب عن coordinately الجينات داخل DEBS BAP1 في حالة نشطة قادرة على توليد 6dEB 19. السعي من الاريثروميسين كامل A الحيوي ثم بدأت باستخدام الجينات كتلة مشابهة من megalomicea البوغانة أو طريقا الهجين يتكون من جينات من S. قنطريون أحمر، S. الفرادية، وS. venezuelae التي أنتجت سيطة الاريثروميسين C و D 6 deoxyerythromycin على التوالي 20-22. في الآونة الأخيرة، وسعت مجموعتنا هذه الجهود من خلال إنتاج erythromفايز A (الشكل الأكثر سريريا ذات الصلة من الاريثروميسين) من خلال E. القولونية. وعلى النقيض من الأعمال السابقة، وأعرب coordinately استراتيجيتنا في 20 S. الأصلي الجينات اللازمة لقنطريون أحمر الحيوي متعدد الكيتيد، deoxysugar الحيوي والمرفقات والخياطة إضافية، وحقها في المقاومة (الشكل 2). في المجموع، تم تصميم 26 (أصلي وغيري) جينات للسماح E. الإشريكية لإنتاج الاريثروميسين A في 4 ملغ / L 23،24. هذه النتيجة التي أنشئت الإنتاج الكامل للمنتج معقد متعدد الكيتيد الطبيعية باستخدام E. القولونية ويخدم كأساس للاستفادة من هذا الخيار إنتاج جديدة أو متابعة جديدة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> PCR آلة </td><td> إيبندورف </td><td> Mastercycler الشخصية </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) </td><td> الصياد </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> الصياد </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> بروبيونات الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-أرابينوز </td><td> سيجما </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> المبردة شاكر </td><td> الحرارية العلمية </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Microfuge </td><td> Eppendorf </td><td> أجهزة الطرد المركزي 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> تاكارا </td><td> مجموعة كوصي بلازميد (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21، pET28، الفيوران-ديو-1 </td><td> EMD كيماويات </td><td> 69742-3، 69864، 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> النظم البيولوجية التطبيقية </td><td> 3200 Q-فخ </td><td></td></tr><tr><td> إيثيل أسيتات </td><td> سيجما </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> سيجما </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> فراغ أجهزة الطرد المركزي </td><td> إيبندورف </td><td> المكثف 5301 </td><td></td></tr><tr><td> مبخر دوار </td><td> BUCHI </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

إنتاج مغاير للمنتجات الطبيعية المعقدة هو نهج مصممة لمعالجة أوجه القصور الحالية واحتمالات المستقبل. انها مفيدة بشكل خاص لتلك المركبات التي تمتلك قيمة علاجية ولكن لا يمكن تصنيعها بشكل كاف أو أن تستفيد من نموذج تحسين الإنتاج. ويمكن تقسيم الإجراءات التجريبية المعنية إلى ثلاثة عناصر: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة مغاير، و 3) تحليل المنتج. كل مكون التجريبية التحسين المستمر تحت لمواجهة التحديات والفرص المرتبطة توقع مع هذا النهج الناشئة. غيروي الحيوي يبدأ تحديد تسلسل الجيني المسؤول عن المنتجات الطبيعية القيمة. نقل هذا التسلسل لمجموعة مغايرة من قبل معقد تعقيد مسار السكروز المسؤولة عن تشكيل المنتج. والاريثروميسين المضادات الحيوية A هو مثال جيد. الجينات والعشرين (مطلوبة مجموعها&gt; 50 KB) لالحيوي في نهاية المطاف. وبالإضافة إلى ذلك، ثلاثة من هذه الجينات ترميز megasynthases، متعددة المجالات الانزيمات ~ 300 كيلو دالتون كل في الحجم. يجب أن تصمم هذه المواد الجينية ونقل إلى E. الإشريكية لالمعاد الحيوي. وسيتم وصف استخدام العزل PCR، والبناء OPERON، البلازميدات متعددة cystronic، والتحول الكهربائية في نقل الاريثروميسين A الكتلة الجينية لE. القولونية. نقل مرة واحدة، E. يجب أن خلية دعم القولونية الحيوي في نهاية المطاف. كما أن هذا عملية صعبة نظرا للاختلافات جوهرية بين E. ومعظم المضيفين القولونية الأصلي المسؤولة عن تشكيل مجمع المنتج الطبيعي. يجب توفير ركائز الخلية اللازمة لدعم الحيوي والتعبير عن coordinately الكتلة نقل الوراثية لإنتاج الانزيمات النشطة. في حالة وجود الاريثروميسين، وE. كان خلية بكتيريا أن هندستها لتوفير السلائف اثنين (العلاقات العامةopionyl، لجنة الزراعة و(2S)-ميثيل، لجنة الزراعة) اللازمة لالحيوي. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة أيضا تعديلات تسلسل الجينات، البلازميد في عدد النسخ، chaperonin شارك في التعبير، بعد التعديل متعدية الأنزيمية، ودرجة الحرارة للسماح عملية الاريثروميسين النهائي A التشكيل. وأخيرا، يجب تقييم الإنتاج الناجحة. لالاريثروميسين A الحالة، سوف نقدم طريقتين. الأول هو السائل اللوني الكتلة الطيفي (LC-MS) لتأكيد وتحديد الإنتاج. وأيضا النشاط الحيوي من الاريثروميسين A تأكيد من خلال استخدام الأحيائي التي يتم اختبار فعالية المضاد الحيوي ضد العصوية الرقيقة. والمقايسات تقييم تنشئ الاريثروميسين A الحيوي من E. القولونية ومهدت الطريق لجهود هندسة المستقبل لتحسين أو لتنويع الإنتاج وإنتاج مركبات جديدة الطبيعية المعقدة باستخدام هذا النهج.

النتيجة المرجوة من هذا النهج هو إنتاج منتج طبيعي تماما النشطة بيولوجيا من E. القولونية مغاير المضيف. ويمثل هذا أفضل من نتائج LC-MS تستخدم لتأكيد وتحديد الإنتاج (الشكل 6) ومضادة للجراثيم تستخدم الأحيائي لتأكيد النشاط النهائي (الشكل 7). في الخطة الشا?...

Watch this Scientific Journal Video about The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. 

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

التركيب الحيوي من A مغاير من خلال الاريثروميسين<em&gt; E. القولونية</em&gt; تتضمن الخطوات التالية التجريبية: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة مغاير، و 3) تحليل المنتج. وسيتم شرح كل خطوة في سياق الدافع، وإمكانات، والتحديات في إنتاج المنتجات الطبيعية العلاجية باستخدام<em&gt; E. القولونية</em&gt; كمضيف بديلة.

المنطق، خطوات التجريبية، وإمكانية البناء الحيوي المنتج من غيري الطبيعية وتتميز هذه الاريثروميسين مجمع المضادات الحيوية المنتجة من خلال A<em&gt; E. القولونية</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K Views.  State University of New York at Buffalo. التركيب الحيوي من A مغاير من خلال الاريثروميسين E. القولونية تتضمن الخطوات التالية التجريبية: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة مغاير، و 3) تحليل المنتج. وسيتم شرح كل خطوة في سياق الدافع، وإمكانات، والتحديات في إنتاج المنتجات الطبيعية العلاجية باستخدام E. القولو?...

Video: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

التحول من الحمض النووي البلازميد في كولاي استخدام أسلوب الصدمة الحرارية

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

معالجة Loblolly باين PtGen2 ميكروأري [كدنا]

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

إجمالي تشريح المعدة من جراد البحر ، Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

بروتوكولات اختيار الطفرات وظيفية لتطور المخرج من البروتينات في E. القولونية</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

إنتاج نوروفيروس الإبراز المجالات الإنسان في<em&gt; E. القولونية</em&gt; لأشعة البلورات

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.