البروتوكول الموصوف هنا يوفر للمحققين طريقة لدراسة العدلات عن طريق الفم داخل نموذج حيواني مستحث بالأربطة من مرض اللثة بطريقة مماثلة للمشاركين البشريين. يتم تسليط الضوء على الميزة الرئيسية لهذه التقنية من خلال زيادة حجم الأنسجة الملتهبة المتاحة للتحليل اللاحق ، مما يقلل من استخدام الحيوانات. قدرتنا على استرداد الأربطة المغلفة بيو فيلم من جميع أنحاء الأسنان يسمح لمحاكاة العلاج الفعال لمرض اللثة المترجمة.
ويمكن تطبيق استخدام هذا النموذج في دراسة الآثار النظامية ل التهاب اللثة في نموذج حيواني ، وذلك بسبب زيادة مناطق الأنسجة اللثة الملتهبة. الإلمام باستخدام الأدوات الجراحية المجهرية ومجاهر التشريح ، وكذلك ربط عقدة الجراح قبل التعامل مع مواضيع الحيوانات الحية ، ينصح بشدة. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية في تقليل طول منحنى التعلم المطلوب لتحقيق وضع إتقان الرباط.
(سيُظهر الإجراء أن (جيف تشادفيغ طالب دراسات عليا من مختبري ابدأ بوضع الماوس على منصة جراحية ساخنة. بعد التأكد من تخدير الفأر بشكل صحيح ، قم بتثبيت الفك العلوي و الفك السفلي في الوضع المفتوح باستخدام أشرطة مرنة.
دعامة الرقبة مع لفة القطن للحفاظ على maxilla في وضع أفقي وتغطية الجسم والذيل للتخفيف من فقدان الحرارة. ضع المجهر الجراحي عند التكبير والإضاءة المرغوبة فوق تجويف الفم. استخدم ملقط منشقة لتثبيت خياطة حريرية مُضفرة 50 أو أصغر حول ضرسات الفك العلوي M1 وM2 داخل السولكوس gingival.
ضع ذيل الغريزة على الجانب الحنكي من الأسنان وأدخل الجزء القريب بين جهة الاتصال M2 و M3. ثم، التفاف حول سطح buccal من M2 وإدراجه بين الاتصال M1 و M2. تأكد من أن يتم سحب طرفي الغرز بإحكام لدفعه إلى sulcus gingival. لف الجزء خياطة قريبة حول M1 تحت ارتفاعها من كفاف وإدراجه بين اتصال M1 و M2. سحب ذيل قريب من خياطة بإحكام لإزالة جميع الركود. ربط نهايات الغرزة مع عقدة الجراح وتقليم ذيول الفرز قدر الإمكان.
ضع العقدة في الزّرّب بين M1 و M2 على الجانب الحنكي من الزمر الفكي. ومن الأهمية بمكان أن تكون العقدة المستخدمة لتأمين الرباط آمنة وفي وضعية حيث لا تهيج الحيوان أو تتداخل مع التشنج. بعد تركيب الرباط، قم بإزالة الماوس من الجهاز الجراحي وضعه في قفص نظيف تحت مصباح حراري، مع التأكد من مراقبته حتى يتم استرداده بالكامل.
تعقيم الأدوات الجراحية في معقمة حبة الزجاج الساخن بين كل موضوع الحيوان. منزل كل فأرة على حدة مع الإثراء البيئي المناسب والسماح لـ الإعلانية libitum الوصول إلى المياه المصفاة وطعام القياسية المهروسة في بيئة تسيطر على درجة الحرارة والرطوبة لمدة سبعة إلى 11 يوما. عندما تكون على استعداد لجمع العينات، واستخدام ماصة لشطف تجويف الفم مع 100 ميكرولترات من عقم أربع درجة مئوية PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 10 ثانية.
كرر شطف مرتين أكثر، ووضع كل شطف في نفس 15 ملليلتر أنبوب اختبار معقم مخروطي لكل. تشغيل محتويات كل أنبوب 15 ملليلتر من خلال مرشح شبكة النايلون 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، ونقل الترشيح إلى أنبوب اختبار جديد 15 ملليلتر. إضافة 33.3 ميكرولترات من 16٪ شبهformaldehyde لتسهيل تثبيت العينة.
دوامة العينات على الفور واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة. Paraformaldehyde هو الكاشف الأكثر خطورة المستخدمة في البروتوكول وينبغي التعامل مع معدات الحماية الشخصية الموصى بها التي ينصح بها الصانع. بعد الحضانة، وملء أنبوب إلى 15 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني ثم الطرد المركزي في 1000xg وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
pirate المابير، إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من العازلة FACS في أربع درجات مئوية وعد الخلايا على مقياس قياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. كرر الطرد المركزي وpirate ابر. ثم قم بإعادة تعليق بيليه الخلية في حجم مناسب من مخزن FACS المؤقت لتركيز نهائي من 500 إلى 1 مليون خلية لكل 50 ميكرولترات من مخزن FACS المؤقت ونقل الخلايا إلى أنبوب FACS.
إضافة ميكرولتر واحد من مصل الفئران واثنين من ميكرولترات من الأجسام المضادة المضادة IGG الماوس إلى 50 ميكرولترات من العينة. دوامة العينة على الفور ومنعها على الجليد لمدة 20 دقيقة. ثم، إضافة الأجسام المضادة المناسبة لكل عينة.
دوامة واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الحضانة، وغسل العينات مع ملليلتر واحد من عازلة FACS، دوامة لفترة وجيزة، والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 1000xg وأربع درجات مئوية. تفريغ المابير و كتلة بلطف افتتاح أنبوب FACS.
كرر الغسيل مرتين، ثم أعد تعليق العينات في 250 ميكرولترات من مخزن FACS للتخزين. تغطية الأنابيب مع فيلم البارافين، والتفاف عليها في رقائق الألومنيوم، وتخزينها في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للتحليل. تم استخدام قياس التدفق لتحليل العدلات التي تم استردادها من شطف الفم من فأر ساذج ، بالإضافة إلى شطف فموي واستئصال مسترد من فأر مع التهاب اللثة الناجم عن الرباط.
لتقييم فقدان العظام السنخية، تم قياس مستويات العظام السنخية من قمة العظام السنخية إلى تقاطع الإسمنت للفئران الصحية والملتبة. ثم تم حساب اختلافات القياس. في حين لم يتم استعراض هنا، يمكن أيضا تقييم الهيستوباتولوجي، والمناعة، وmorphometric من اللثة والعظام السنخية اعتمادا على مسألة البحث.
هذا النموذج حاليا يستخدم في مختبري لدراسة آثار الجهاز المناعي الفطري عن طريق الفم على الصحة الجهازية والمرض.
