وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (NIGMS-074696) لكام والجمعية الأمريكية لعلم الأحياء المجهرية روبرت واتكينز D. طالب دراسات عليا زمالة أبحاث لJLA كما نشكر جون غلوفر في جامعة تورنتو عن توفير FFL -GFP البلازميد مصدر.

1. بناء سلالات تحتوي على FFL-GFP البلازميد لهذه الدراسة، خميرة الخباز سلالة BY4741 (MAT لذلك، his3Δ1، leu2Δ0، met15Δ0، ura3Δ0) كانت تستخدم جنبا إلى جنب مع سلالة الحذف HSP104 من جمع خروج المغلوب الخميرة (فتح النظم البيولوجية / الحرارية العلمية). تم تأكيد الحذف باستخدام الأجسام المضادة Hsp104 محددة للتحليل لطخة غربية. وأعرب عن FFL-GFP من p426MET25-FFL-GFP، التي شيدت من مصدر المستندة إلى LEU2 البلازميد التي تم الحصول عليها من المختبر غلوفر في جامعة تورونتو 17 والتي يمكن الحصول عليها عند الطلب للمؤلفين. يتم التحكم تعبير عن انصهار بروتين GFP البلازميد FFL-من قبل MET25 مروج ميثيونين-كظوم. تحولت البلازميد في كل سلالة باستخدام بروتوكول تم تكييفها من GIETZ وآخرون. آل، 1995: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي 25 مل س<html> و الخلايا مرحلة دخول في أنبوب مخروطي 50 مل في 4،400 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة، ويغسل مع 500 ميكرولتر من ضعف المقطر H 2 0 ([ده 2 O)، وتجاهل الطافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر من TE / LiAc (تريس، حمض الهيدروكلوريك 10 ملم، ودرجة الحموضة = 7.5، 1 ملم EDTA، 0.1 M خلات الليثيوم). احتضان عند 30 درجة مئوية دون خلط لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة إلى أنبوب جديد جنبا إلى جنب مع 5 مل (50 ميكروغرام) من الحمض النووي الناقل و5 ميكرولتر (0،1-5 ميكروغرام) من الحمض النووي البلازميد. إضافة 300 ميكرولتر من PEG / TE / LiAc (نفس TE / LiAc بالإضافة إلى 40٪ البولي ايثيلين جلايكول) إلى هذا الخليط، والخلايا احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم 1/10 (V / V) DMSO (36 ميكرولتر) إلى هذا الخليط والصدمة الحرارية في 42 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخليط في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية وإزالة الطافي. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العقيمة DDH 2 0 والخلايا لوحة على وسائل الإعلام كاملة الاصطناعية تفتقر اليوراسيل (SC-URA). </li></ol> 2. تحريض FFL-GFP NT &quot;هو فعل&gt; FFL-GFP الخلايا مرة واحدة في مرحلة السجل بحيث يتم الغالبية العظمى من البروتين قبل للصدمة الحرارة حديثا لتجنب البروتينات التي تم تجميع عناصره من شفائهم مع مرور الوقت بسبب القصور الخلوية الشيخوخة المرتبطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1: الخلايا احتضان في 5 مل من SC-URA في 30 ° C الدورية O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2: قياس OD 600 والثقافات الطازجة تلقيح في 5 مل من SC-URA OD 600 ~ 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الثقافات مع دوران عند 30 درجة مئوية حتى بلوغهم مرحلة دخول OD 600 ~ 0.8-1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا في أنابيب مخروطية 15 مل في 4،400 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، صب الطافي و resuspend الخلية بيليه في 500 ميكرولتر من DDH 2 0؛ حل نقل إلى أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 6،000 دورة في الدقيقة وتجاهل الطافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 5 مل من SC-URA-MET. وينبغي حضنت الخلايا الدورية في هذه الوسائط لمدة 1 ساعة عند 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي وتكرار غسل في DDH 2 0 وتجاهل الطافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspeالخلايا الثانية في 5 مل سائل الإعلام SC-URA تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد لكبح بروتين تعبير، والشروع فورا في الخطوة 3. </li></ol> 3. الأنزيمية FFL-GFP استعادة الفحص هذا الاختبار هو نهج كمي لتحديد مستويات انزيم نشط في عدد السكان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير لهذا الفحص: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المبلغ اللازم من D-وسيفيرين اللازمة بناء على عدد من العينات والمطلوب عدد من مكررات بالإضافة إلى ما يقرب 1،200 ميكرولتر للأنابيب. تركيز النهائي من D-وسيفيرين هو ~ 23 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر من الخلايا. في البداية يتم حله في الماء بتركيز محلول المخزون من 7.5 ملغ / مل وتخفيفه إلى 455 ميكروغرام / مل في SC قبل التجربة. في الشكل 2، وثلاثة مكررات لتم تحليل كل عينة مما أدى إلى ما مجموعه 2.4 مل من D-وسيفيرين المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج قارئ لوحة للفلاش وميمقايسة nescence (مقتبس من BIOTEK Gen5 &quot;التلألؤ الفحص فلاش مع حقن&quot;؛ لصكوك أخرى اتبع تعليمات الشركة الصانعة) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة إلى 30 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين قارئ لوحة لإضافة D-وسيفيرين، يهز، وقراءة كل بئر على حدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة التلألؤ (القراءة نقطة النهاية، 5 ثانية الوقت التكامل، ومستوى الحساسية 180) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفحص الانتعاش بين كل هزة القراءة لمدة 5 دقائق، وتأخير 20 دقيقة، ويهز في 5 دقائق إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 50 ميكرولتر من D-وسيفيرين من حاقن. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس التلألؤ سخن للصدمة مباشرة بعد يتم إضافة خلايا إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على سيكلوهيكسيميد لوقف تخليق البروتين. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من الخلايا لكل عينة مع العدد المرغوب فيه من يعيد إلى مادة صلبة بيضاء 96 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تشمل الضوابط فارغة المياه والخلايا التي تحتوي على ناقلات الفارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابدأ القراءة مع جمعية مهندسي البترولcifications المذكورة أعلاه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتفسد شاردة FFL من FFL-GFP، احتضان ثقافة مل 5 في أنبوب الثقافة زجاج في 42 ° C الهز لمدة 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتعاش فحص قراءات التلألؤ تبدأ على الفور بعد إزالة الخلايا من الحاضنة، والتي حان الوقت نقطة الصفر. مقياس التألق نفسها كما هو موضح أعلاه لأول مرة نقطة وكل 30 دقيقة لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع عينات لتسخين للصدمة القيم التلألؤ التي تم تعديلها بناء على OD 600 (تقسيم القيم سخن للصدمة من قبل OD 600). </li></ol> 4. المجهر مضان هذا الاختبار هو وسيلة شبه كمي لتحديد الانحلالية من المجاميع على مر الزمن في عدد السكان من الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستقراء هو نفسه كما هو موضح في القسم 2، والخطوات 1-8 من البروتوكولات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تؤخذ النقاط نفس الوقت كما هو موضح أعلاه (القسم 3، الخطوة 4)، ولكن لهيئة التصنيع العسكريroscopy جمع 1 مل من الخلايا في سخن للصدمة وكل نقطة زمنية استرداد، وعينات احتضان الدورية عند 30 درجة مئوية في أنبوب الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصور: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي 1 مل من الخلايا في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية وإزالة الطافي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلية بيليه في 2 ميكرولتر من DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 2 ميكرولتر من الخلايا زائد 2 ميكرولتر من 2٪ منخفضة ذوبان الاغاروز على الشريحة وإضافة انزلاق الغطاء. من أجل الحصول على طائرة واحدة من الخلايا برفق اضغط الإصبع إلى أسفل في وسط من انزلاق الغطاء وتدوير حتى زلة تغطية من الصعب للتحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا هي تصور باستخدام هدف النفط 100X على المجهر الفلورسنت، واستخدام مدينة دبي للإنترنت لتصور الخلايا وتصفية FITC لتصور GFP مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور متعددة لكل سلالة في كل نقطة زمنية لتحديد الكميات. يجب الحقول للحصول على صور تحتوي على 15-30 ~ الخلايا لتحليل ما بعد التجريبية الكمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على المجاميع، عد 50مجموع الخلايا -100 وتقسيم عدد من الخلايا التي تحتوي على المجاميع. </li></ol></li></ol> 5. الميكروسكوب خلية واحدة وتستخدم هذه الطريقة لمتابعة الانحلالية من المجاميع الفردية في خلية واحدة على مر الزمن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث FFL-GFP التعبير كما هو موضح في القسم 2، والخطوات 1-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما بعد الصدمة الحرارية، والخلايا الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 15 مل في 4،400 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر من المياه وresuspend في 20 ميكرولتر من DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل سلالة، وقطع جزء مم 5X5 لوحة آغار SC-URA واستخدام السطح الذي كان على اتصال مع طبق بتري، ماصة 4 ميكرولتر من الخلايا وانتشارها في جميع أنحاء سطح أجار مع طرف ماصة. اسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملاقط لوضع القسم مكعب أجار وجها لأسفل على ~ 55 مم أسفل الزجاج طبق رقم 0 واضغط لأسفل برفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصور: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انظر الأول إلى الثالث في الطائفةأيون 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة تنسق لمدة 2-4 نقاط الاتصال لكل سلالة اعتمادا على كثافة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الكاميرا لالتقاط الصور مع Z-مكدس مع مجموعة مناسبة (- / + 15 ميكرون مع 0.5-1.0 ميكرون شريحة سمك) كل 5 دقائق لمدة دقيقة 90. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذه المقالة نموذج البروتين كانت تستخدم FFL-GFP تبين أن disaggregase الخميرة، Hsp104 يساهم في البروتين إعادة الانحلالية والإصلاح. المقايسات الأنزيمية والفحص المجهري استجواب تفاضلي حالة من البروتين الركيزة نفسه لتحديد طوي ثانية كفاءة وانتاجية. نتائج فحوصات الانتعاش الأنزيمي...

في البشر وقد تم ربط الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض الزهايمر، وباركنسون، والأمراض هنتنغتون إلى misfolding البروتين والتجميع 10. الخلايا توظيف المحرمين الجزيئية لمنع محاصرة الحركية من البروتينات الخلوية في الهياكل غير نشط تتجمع 6. المشاركة المحرمين في شبكات تفاعل معقدة داخل الخلية، ولكن ليست مفهومة تماما كيف أن مجموع هذه التفاعلات يساهم في proteostasis العضوي. واحد من المحرمين الرئيسية المسؤولة عن غالبية عصاري خلوي للطي البروتين هو بروتين الصدمة الحرارية دينار كويتي 70 (HSP70) الأسرة 19. وقد تبين أنه في فقدان الخميرة النقص HSP70 القدرة على أضعاف الوليدة FFL أعرب heterologously وrefold البروتين الذاتية، الأورنيثين ناقلة الكربامويل، في الجسم الحي 18، 7. والقدرة على تحليل للطي مع القرار في الوقت شبه الحقيقي تيسير فهم كيف إضافية العوامل الخلوية تابعribute لهذه العملية التي تعتمد على HSP70. وبالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون قابلة للطي / طوي ثانية التفاعلات تعتمد اعتمادا كليا على هذه البروتينات المساهمة، لذلك يجب أن تكون المقايسات حساسة بما يكفي للكشف عن كلا من التغيرات الكبيرة والصغيرة في حركية وكفاءة. وdisaggregase خلية الخميرة، Hsp104، تلعب دورا حيويا في إصلاح البروتينات تتجمع المجمعة. على الرغم من أن تم التعرف Hsp104 homologs في الفطريات والنباتات، وهذه العائلة ويبدو أن تغيب في metazoans. وقد اقترح أن المحرمين أخرى مثل تلك الأسرة Hsp110 أداء بعض الأنشطة المعروفة Hsp104 في الثدييات 16. Hsp104 هو AAA +، بروتين معقد hexameric الذي يعمل في الخميرة إلى المجاميع البروتين اعادة تشكيلها، والمساهمة في طوي ثانية وإصلاح 13. Hsp104، جنبا إلى جنب مع الخميرة HSP70، SSA1، والخميرة Hsp40، Ydj1، مطلوب للتعافي من FFL التشويه والتحريف في خلايا الخميرة 5 و 8. وقد تبين أن الحرارة الصغيرة بروتين الصدمة، Hsp26، أيضا أن يكون ل requiأحمر لتفصيل Hsp104 بوساطة من FFL 2. FFL هو بروتين ثنائي المجال الذي يربط الركيزة luciferin في موقع نشط وبعد تغيير متعلق بتكوين الذي يتطلب ATP والأكسجين، decarboxylates الركيزة الإفراج oxyluciferin، وثاني أكسيد الكربون (CO 2)، أحادي فسفات الأدينوزين (AMP)، وضوء 11، 9، 3. الركيزة المتاحة تجاريا FFL، D-وسيفيرين، والنتائج في انبعاث الضوء بين 550-570 نانومتر التي يمكن أن يتم الكشف عن باستخدام luminometer 15. FFL حساس بشكل رائع لتمسخ من العلاجات الكيميائية أو الحرارة والمجاميع بسرعة على تتكشف. عندما تتعرض لدرجات حرارة تتراوح بين 39-45 درجة مئوية وتكشفت FFL عكسية والمعطل 12. في المقابل، GFP ومشتقاته هي مقاومة للبروتين تتكشف الضغوط 14 للغاية. فيوجين من هذه البروتينات اثنين يسمح FFL ليعمل وشاردة عطوب تجريبيا قادرة على استهداف وظيفية GFP بين الخلايا الودائع التي يمكن تصور باستخدام المجهر مضان في كل من السكان ومستويات خلية واحدة. تطبيق فحص الأنزيمية في قارئ لوحة المتعدد شبه الآلي إلى جانب المجهر الآلي يسمح التقييم في وقت واحد لم يسبق له مثيل من حركية والعائد من ردود الفعل طوي ثانية. بالإضافة إلى ذلك، علم الوراثة الجزيئي السطحية للنموذج حقيقي النواة خميرة الخباز يسمح على حد سواء التلاعب الدقيق للشبكة مراقبة جودة البروتين وإتاحة الفرصة للنهج القائم على الاكتشاف لتحديد اللاعبين رواية المساهمة في الاستجابة للضغط النفسي الخلوية وproteostasis. في هذه الدراسة، البرية من نوع (WT) وHSP104 الحذف سلالات معربا عن FFL-GFP تخضع لتغيير طبيعة بروتين الصدمة الحرارية. ويتم رصد FFL-GFP طوي ثانية من خلال كل من فحص الأنزيمية والفحص المجهري وقراءات وكيل لإصلاح بروتيوم أعرب أكثر من مرة بالطبع الانتعاش. بالمقارنة مع خلايا WT، وتبين لنا اله Hsp104 سلالة الحذف هو ~ 60٪ أقل كفاءة في طوي ثانية FFL-GFP، ودعم النتائج السابقة إنشاء دور للHsp104 في تنشيط التشويه والتحريف FFL 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis، الذي يعرف بأنه العمليات مجتمعة من البروتين للطي / النشوء الأحيائي، طوي ثانية / إصلاح، وتدهور، هو توازن دقيق الخلوية التي يجب المحافظة عليها لتجنب العواقب الوخيمة 1. العوامل الخارجية أو الداخلية التي تعطل هذا التوازن يمكن أن يؤدي إلى تجميع البروتين، والسمية وموت الخلايا. في البشر هذا هو أحد العوامل الرئيسية التي تسهم في الأعراض المصاحبة للاضطرابات العصبية مثل هنتنغتون، باركنسون، والأمراض الزهايمر 10. ولذا فمن الضروري أن البروتينات المشاركة في صيانة proteostasis أن يتم تحديدها من أجل تطوير علاجات لهذه الأمراض المنهكة. توضح هذه المقالة التقنيات للرصد في طي البروتين في الجسم الحي في القرار قرب الوقت الحقيقي باستخدام نموذج البروتين luciferase يراعة تنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP FFL-). FFL-GFP هو نموذج البروتين خيالية فريدة من نوعها كما شاردة FFL هو حساسة للغاية التوتر الناجم عن مisfolding والتجميع، الذي يثبط نشاط الإنزيم 12. ويتم رصد luciferase النشاط باستخدام مقايسة الأنزيمية، ويوفر شاردة GFP وسيلة لتصور FFL قابل للذوبان أو مجمعة باستخدام المجهر الآلي. هذه الأساليب إلى جانب إدراج نهجين متوازيين ومستقلين من الناحية الفنية لتحليل كل من طوي ثانية وإعادة تنشيط الوظيفية للانزيم بعد الإجهاد. انتعاش النشاط يمكن ربط مباشرة مع حركية التفكيك وإعادة الانحلالية إلى فهم أفضل لكيفية العوامل مراقبة الجودة بروتين مثل البروتين المحرمين التعاون من أجل أداء هذه المهام. وبالإضافة إلى ذلك، الحذف أو طفرات الجينات يمكن استخدامها لاختبار المساهمات بروتينات معينة أو الوحدات الصغرى البروتين لهذه العملية. في هذه المقالة ندرس المساهمات من البروتين disaggregase Hsp104 13، والمعروف أن شريك مع عامل تبادل Hsp40/70/nucleotide (NEF) طوي ثانية نظام 5، طوي ثانية إلى البروتين للتحقق من صحة هذا النهج.

الخميرة تعتمد على disaggregase، Hsp104 إلى refold البروتينات حرارة التشويه والتحريف بكفاءة. تم رصد نشاط FFL-GFP بعد الصدمة الحرارية دقيقة 25، وذلك باستخدام التلألؤ فلاش فحص الشكل 1. وكشفت نتائج هذا الفحص الآلي هو مبين في الشكل 2 الزيادة التدريجية في النشاط أكثر من 90...

Watch this Scientific Journal Video about Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

توضح هذه المقالة استخدام luciferase يراعة-GFP انصهار بروتين للتحقيق<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; طي البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;. باستخدام هذا الكاشف، طوي ثانية من نموذج البروتين للحرارة التشويه والتحريف يمكن رصدها في وقت واحد بواسطة المجهر مضان وفحص الأنزيمية للتحقيق في أدوار مكونات شبكة proteostasis في مراقبة الجودة البروتين.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K Views.  University of Texas Medical School. توضح هذه المقالة استخدام luciferase يراعة-GFP انصهار بروتين للتحقيق في الجسم الحي طي البروتين في خميرة الخباز. باستخدام هذا الكاشف، طوي ثانية من نموذج البروتين للحرارة التشويه والتحريف يمكن رصدها في وقت واحد بواسطة المجهر مضان وفحص الأنزيمية للتحقيق ...

Video: Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

قياس مرنا تسوس الأسعار<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; استخدام<em&gt; rpb1-1</em&gt; سلالات

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.