この作品は、KAM、我々はまた、FFLを提供するためにトロント大学のジョン·グローバーに感謝JLAに微生物ロバートD.ワトキンス大学院生研究フェローシップのアメリカの社会への国立衛生研究所（NIGMS-074696）からの助成金によってサポートされていましたプラスミド-GFPソース。

1。プラスミドFFL-GFPを含む菌株の構築この研究では、 出芽酵母株 BY4741は（MAT、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0）酵母ノックアウトコレクション（オープンバイオシステムズ/サーモサイエンティフィック）からHsp104の欠失株と一緒に使用されました。欠失は、ウェスタンブロット分析のためにHsp104の特異的抗体を用いて確認した。 FFL-GFPは著者への要求に応じてトロント17の大学と得でグラバー実験から得られたプラスミドLEU2ベースのソースから構築、p426MET25-FFL-GFPから発現された。 FFL-GFPプラスミド融合タンパク質の発現は、MET25メチオニン抑制性プロモーターによって制御される。プラスミドをGietz らから適応されたプロトコルを使用して各菌株に形質転換した。ら 、1995： <ol><li> 25ミリリットルOを遠心<html> 2分間4,400 rpmで50ミリリットルコニカルチューブのF対数期細胞は、蒸留H 2 0（のddH 2 O）を500μlで洗浄し、上清を捨てる。 </li><li> TE / LiAc（トリス塩酸の10mM、pH値= 7.5、1 mMのEDTA、0.1 Mの酢酸リチウム）を250μlで再懸濁した細胞。 20分間混合することなく、30℃でインキュベートする。 </li><li>キャリアーDNAとプラスミドDNA5μlの（0.1-5μgの）を5ml（50μgの）と一緒に新しいチューブにコンピテントセル50μlのを転送します。 PEG / TE / LiAc（TE / LiAcプラス40％のポリエチレングリコールと同じ）、この混合物に300μlのを追加し、℃でさらに30分間30℃でインキュベートした細胞。 </li><li> 6分間、42℃で、この混合物と熱ショック°C、1/10容量（v / v）のDMSOを（36μl）を入れる。 </li><li> 30秒、削除上澄み用6,000 rpmで混合物を遠心分離します。ウラシル（SC-URA）を欠いた合成完全なメディアに無菌のddH 2 0とプレート細胞100μlの細胞を再懸濁します。 </li></ol> 2。 FFL-GFPの誘導前のヒートショックへのタンパク質の大半は新たに末端老化に伴う細胞の不備に起因する時間をかけて集計しているタンパク質を回避するために作られるので、細胞が対数増殖期にある一度NTが &quot;&gt; FFL-GFPが誘導される。 <ol><li> 1日目：30時SC-URA 5ml中インキュベート細胞°C回転O / N </li><li> 2日目：測定OD 600とSC-URA OD 600〜0.2 5ml中の接種新鮮な文化。 </li><li>彼らは対数期OD 600〜0.8〜1.0に達するまで30℃で回転培養する。 </li><li>のddH 2 0500μlの中で3分、デカント上澄みと再懸細胞ペレットのために4,400 rpmで15ミリリットルコニカルチューブで細胞を遠心分離し、マイクロチューブへ転送ソリューション。 </li><li> 6,000 rpmで遠心し、上清を捨てる。 </li><li> SC-URA-MET 5mlに細胞を再懸濁します。細胞は、30℃で1時間℃のため、このメディアに回転培養されるべきである</li><li>遠心細胞とリピートのddH 2 0で洗浄と上清を捨てる。 </li><li> Resuspeタンパク質の発現を阻害し、ステップ3に直ちに進みシクロヘキシミド100μgの/ mlのを含む5ミリリットルSC-URAメディアにおけるNDセル。 </li></ol> 3。酵素FFL-GFP回復アッセイこのアッセイは、集団において活性酵素のレベルを決定するための定量的な手法である。 <ol><li>このアッセイのための準備： <ol class="lroman"><li>各サンプルのOD 600を測定します。 </li><li>サンプルおよび複製プラスチューブ用約1,200μlの、所望の数の数に基づいて、必要に応じて、D-ルシフェリンの必要な量を準備します。 D-ルシフェリンの最終濃度は、細胞を100μlにつき約23μgのです。当初はそれが7.5 mg / mlの原液の濃度で水に溶解し、実験前に455μgの/ SCにおけるmlに希釈した。 図2において、3つの各サンプルのreplicateが使用されているD-ルシフェリン2.4mlの総結果として分析した。 </li><li>フラッシュルミのプログラムプレートリーダーnescenceアッセイ（ &quot;射出と発光フラッシュアッセイ&quot;バイオテックGEN5から適応、他の楽器については、製造元の指示に従ってください） <ol class="lalpha"><li> 30℃に温度を設定</li><li> 、D-ルシフェリンを追加振る、と個別に各ウェルを読むためにプレートリーダーを設定します。 </li><li>発光を読む（エンドポイントの読書、5秒の積分時間、180感度レベル） </li><li> 5分間各読み取り手の間に回復アッセイのために、20分遅らせて、さらに5分を振る。 </li><li>インジェクターからD-ルシフェリン50μlを分注する。 </li></ol></li></ol></li><li>細胞は、タンパク質合成を停止するシクロヘキシミドを含む培地に添加した後、予熱ショック発光を直ちに測定した。 <ol class="lroman"><li>白色96ウェルプレートに複製、所望の数と各サンプルの細胞を100μlを移す。 </li><li>コントロールは水ブランクと空のベクターを含む細胞を含める必要があります。 </li><li> SPEでの読み取りを開始しますcificationsは、上記の。 </li></ol></li><li> FFL-GFPのFFL部分を変性させるために、42℃でガラス培養管の5 mlの培養液をインキュベート°Cで25分間振とう。 </li><li>細胞は、時刻ゼロであるインキュベーターから除去された後に回復アッセイ発光測定値がすぐに開始する。第1の時点および90分毎に30分間、上記と同様のメジャールミネッセンス。 </li><li> OD 600（OD 600によって予熱衝撃値を分割する）に基づいて調整されている予熱ショック発光値にサンプルを正規化します。 </li></ol> 4。蛍光顕微鏡検査法このアッセイは、細胞集団における経時的に凝集体の可溶化を決定するために半定量的方法である。 <ol><li>誘導は、 第2節で説明したように、同じであるプロトコルの1-8ステップ 。 </li><li>同じ時間点（ セクション3、ステップ4）上述したように撮影されていますが、マイク用roscopy 1予熱ショックで細胞mlの各リカバリ時点、と°C培養管で30で回転インキュベートサンプルを収集。 </li><li>可視化： <ol class="lroman"><li> 30秒間6,000 rpmで細胞を1mlを遠心し上清を除去します。 </li><li>のddH 2 O 2μlの中で再懸細胞ペレット</li><li>細胞プラススラ​​イド上の2％低融点アガロース2μlの2μLを混合し、カバースリップを追加します。細胞の単一面を得るために軽くカバースリップの中央に指を押し、カバースリップを移動することが困難になるまで回転させる。 </li><li>細胞を蛍光顕微鏡で100倍のオイル対物を用いて可視化され、GFP蛍光を可視化する細胞およびFITCフィルタを視覚化するために使用DIC。 </li><li>定量のための各時点で各菌株に対して複数の写真を撮る。映像のためのフィールドは、定量的なポスト·実験的解析のために〜15-30細胞が含まれているはずです。 </li><li>凝集体を含む細胞のパーセンテージを計算するために、50を数える-100細胞は、合計して凝集体を含む細胞の数を割る。 </li></ol></li></ol> 5。単一セル顕微鏡この方法は、経時的な単一セル内の個々の凝集物の可溶化をフォローするために使用される。 <ol><li> 第2節では、ステップ1-8で説明したようにFFL-GFPの発現を誘導する。 </li><li>ヒートショックの後、2分間4,400 rpmで15ミリリットルコニカルチューブで遠心細胞。 </li><li>のddH 2 O20μlに再懸濁し、水と500μlの細胞を洗浄</li><li>各株の場合は、SC-URA寒天プレートの5×5 mmのセクションを切り出し、ペトリ皿、ピペットチップと寒天の表面の周りの細胞と広がりμlのピペット4と接触していた面を使用。 〜1分間放置。 </li><li> 〜55ミリメートルのガラスボトムディッシュ番号0にフェイスダウン寒天キューブセクションを配置し、軽く下に押すようにピンセットを使用してください。 </li><li>可視化： <ol class="lroman"><li> 節でI〜IIIを参照してくださいイオン4。 </li><li>文化の密度に応じて、各株について2-4焦点の座標を設定します。 </li><li> （ - 0.5〜1.0μmのスライス厚で/ + 15μm）を90分の期間に5分ごとに適切な範囲を持つZ-スタックで写真を撮るためにカメラを設定します。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. 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R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

この記事では、モデルタンパク質FFL-GFPは、Hsp104のは、タンパク質の再可溶化および修復に貢献する酵母disaggregaseことを示すために使用されていました。酵素アッセイおよび顕微鏡差動的にリフォールディング効率及び収率を決定するために同一の基質タンパク質のステータスを尋問。酵素回復アッセイの結果は、非効率的なhsp104D変異株で最大の回復ですが、展開のストレスの初期の?...

ヒトでは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングとアグリゲーション10にリンクされている。細胞は6ミスフォールド構造に不活性な細胞タンパク質の運動捕捉を防止する分子シャペロンを使用する。シャペロンは、細胞内の複雑な相互作用ネットワークに参加するが、それは完全にこれらの相互作用の合計は生物のproteostasisに寄与する方法を理解されていない。細胞質タンパク質フォールディングの大部分に関与する主要シャペロンの一つは、70 kDの熱ショックタンパク質（Hsp70の）ファミリ19である。なお、Hsp70は低下する酵母損失が初期の異種発現さFFLを折るし、 インビボ18、7内因性タンパク質、オルニチントランスカルバミラーゼを、リフォールディングしたりすることが示されている。ほぼリアルタイム分解能で折りたたみを分析する能力がCONT方法追加の細胞因子を理解することが容易になるこのHsp70の依存プロセスにribute。また、折り畳み/フォールディング反応はこれらの貢献のタンパク質に完全に依存しないかもしれないので、アッセイは、動態およ​​び効率の大小の変化の両方を検出するのに十分な感度でなければならない。 酵母細胞disaggregase、Hsp104のは、集約されたミスフォールドタンパク質の修復に重要な役割を果たしている。 Hsp104のホモログは、菌類や植物に同定されているが、この家族は後生動物に存在しないと表示されます。そのようなHsp110ファミリーのような他のシャペロンは、哺乳類16の既知のHsp104の一部のアクティビティを実行することが提案されている。 Hsp104のは、AAA +、六量タンパク質複合体である改造タンパク質凝集に酵母で機能する、リフォールディングと修復13に貢献。 Hsp70の酵母、SSA1、そして酵母HSP40、Ydj1とともにHsp104のは、酵母細胞5,8における変性FFLの回復のために必要とされる。小さな熱ショックタンパク質、HSP26も、requiであることが示されているFFL 2 Hsp104の媒介分解のための赤。 FFLは、脱炭酸、ルシフェリン、二酸化炭素（CO 2）、アデノシン一リン酸（AMP）と、光11を放出基板活性部位に基質ルシフェリンを結合し、ATPおよび酸素を必要とするコンフォメーション変化に続いて、二ドメインタンパク質である9,3。市販のFFL基板、D-ルシフェリン、照度計15を用いて検出することができる550から570 nmの光の発光をもたらす。 FFLは展開に応じ迅速に化学薬品や熱治療および集計から変性に絶妙に敏感です。 39-45との間の温度にさらされたとき°C FFLは、可逆的に不活化12折り畳まれる。対照的に、GFPおよびその誘導体は、応力14を展開タンパク質に対して非常に耐性がある。したがって、これら2つのタンパク質の融合は機能Gを標的とすることのできる実験的に不安定な部分として機能することができますFFL人口と単一細胞レベルの両方で、蛍光顕微鏡を用いて可視化することが可能な預金を細胞内FP。自動化された顕微鏡と相まって半自動マルチモードプレートリーダーにおける酵素アッセイのアプリケーションが動態と反応をフォールディングの収量前例のない同時評価を可能にします。また、モデル真核生物サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の容易な分子遺伝学は、正確なタンパク質の品質制御ネットワークの操作と細胞ストレス応答とproteostasisに貢献する新たな選手を識別するための発見ベースのアプローチのための機会の両方を可能にします。 本研究では、FFL-GFPを発現している野生型（WT）とHsp104の欠失株はタンパク質変性熱ショックを受けます。 FFL-GFPのリフォールディングは、回復時間にわたって表明プロテオームの修復のためのプロキシ読み出しとして酵素アッセイおよび顕微鏡の両方を通じて監視されています。 WT細胞と比較したとき、我々は番目を示す電子Hsp104の欠失株は変性FFL 2の再活性化にHsp104のための役割を確立する前の調査結果を支持し、FFL-GFPのリフォールディングで約60％の効率が悪くなります。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

タンパク質の折り畳み/生物発生、リフォールディング/修復、および劣化の複合プロセスとして定義さProteostasisは、有害な結果1を回避するために維持されなければならない微妙な携帯バランスです。このバランスを崩壊させる外部または内部の要因は、タンパク質凝集、毒性および細胞死につながる可能性がある。ヒトでは、このようなハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患10に関連した症状の主要な要因である。それはproteostasisの維持に関与するタンパク質は、これらの衰弱性疾患の治療法を開発するために識別されることが不可欠である。この記事は、緑色蛍光タンパク質（FFL-GFP）を融合したモデルタンパク質ホタルルシフェラーゼを用いた準リアルタイム分解能で生体内でタンパク質のフォールディングに監視するためのテクニックについて説明します。 FFL部分がストレス誘発mと非常に敏感であるようにFFL-GFPは、ユニークなモデルキメラタンパク質である酵素12を不活性化isfoldingと集約、。ルシフェラーゼ活性は、酵素アッセイを用いてモニターし、GFP部分は、自動顕微鏡を用いて可溶性または集約FFLを可視化する方法を提供する。これらの結合の方法は、リフォールディング、ストレス後の酵素の機能的再活性化の両方を分析するために二つの平行及び技術的に独立したアプローチを採用しています。活性回収を直接良好ようなシャペロンタンパク質などのタンパク質の品質管理因子がこれらの機能を実行するために協力する方法を理解するために分解し、再可溶化の動態と相関させることができる。また、遺伝子欠失又は突然変異がこのプロセスに特定のタンパク質またはタンパク質サブユニットの寄与をテストするために使用することができる。この記事では、このアプローチを検証するために、タンパク質リフォールディングに、システム5リフォールディングHsp40/70/nucleotide交換因子（NEF）と提携して知られているタンパク質disaggregase Hsp104の13の貢献を検討する。

酵母は、効率的リフォールディング熱変性タンパク質にHsp104のdisaggregaseに依存しています。 FFL-GFPの活性は、 図1の発光フラッシュアッセイを用いて、25分間の熱ショック後にモニターした。 図2に示すように、この自動化されたアッセイの結果は、最終的WT細胞における&gt; 80％の回収率につながっ90分かけて段階的に活性の増加が明らかになった。 hsp104Δ株は?...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載<em生体内で&gt;</emで&gt;タンパク質のフォールディング<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em&gt;。モデル熱変性タンパク質のリフォールディング、この試薬を用いて、蛍光顕微鏡およびタンパク質の品質管理にproteostasisネットワークコンポーネントの役割を調査するために酵素アッセイによって同時に監視することができる。

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

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Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K ビュー.  University of Texas Medical School. この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載タンパク質のフォールディングサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）。モデル熱変性タンパク質のリフォールディング、この試薬を用いて、蛍光顕微鏡およびタンパク質の品質管理にproteostasisネットワークコンポーネントの役割を?...

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ

要約

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の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

指向進化方法で

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ

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の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

指向進化方法で

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で