עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (074,696 NIGMS-) לKAM וחברה אמריקנית למיקרוביולוגיה מלגת רוברט ד &#39;ווטקינס סטודנט לתואר מחקר לJLA אנו מודים גם ג&#39;ון גלובר באוניברסיטת טורונטו למתן FFL מקור-GFP פלסמיד.

1. בנייה של זנים המכילים FFL-GFP פלסמיד במחקר זה, זן Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MAT, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) שימש יחד עם מתח מחיקת HSP104 מאוסף נוקאאוט שמרים (הפתוח Biosystems / Thermo Scientific). המחיקה אושרה באמצעות נוגדן ספציפי לHsp104 ניתוח כתם מערבי. FFL-GFP בא לידי ביטוי מp426MET25-FFL-GFP, שנבנה ממקור פלסמיד מבוסס LEU2 התקבל מהמעבדה גלובר באוניברסיטת טורונטו 17 והשגה, על פי בקשה למחברים. הביטוי של חלבון היתוך פלסמיד FFL-GFP נשלט על ידי אמרגן מתיונין-repressible MET25. פלסמיד הפך לכל זן באמצעות פרוטוקול הותאם מGietz et. אל, 1995: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 25 מ&quot;ל O<html> f תאי שלב יומן בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל ב 4,400 סל&quot;ד במשך 2 דקות, לשטוף עם 500 μl של מזוקק H הכפול 2 0 (DDH 2 O), וזורקים supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 250 μl של TE / LiAc (טריס-HCl 10 מ&quot;מ, pH = 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 אצטט ליתיום מ &#39;). לדגור על 30 מעלות צלזיוס, ללא ערבוב במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 50 μl של תאים מוסמכים לצינור חדש יחד עם 5 מ&quot;ל (50 מיקרוגרם) של ה-DNA ומנשא 5 μl (0.1-5 מיקרוגרם) של ה-DNA פלסמיד. הוסף 300 μl של PEG / TE / LiAc (אותו הדבר כמו פוליאתילן גליקול% TE / LiAc בתוספת 40) לתערובת זו, ותאים לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח 1/10 (V / V) DMSO (36 μl) לתערובת זו והלם חום על 42 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תערובת על 6,000 סל&quot;ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate. Resuspend תאים ב100 μl של 2 0 תאים בצלחת DDH סטריליות על גבי מדיה שלמה סינטטי חסרות אורציל (SC-אורה). </li></ol> 2. אינדוקציה של FFL-GFP NT &quot;&gt; FFL-GFP הוא מושרה ברגע תאים נמצאים בשלב יומן כך שרוב החלבון לפני חום ההלם הוא עשה זה עתה, כדי למנוע חלבונים שהסתכמו סופני לאורך זמן עקב ליקויים הקשורים להזדקנות הסלולר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: תאי דגירה ב5 מ&quot;ל של SC-URA ב 30 מעלות צלזיוס מסתובב O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: מדוד OD 600 ותרבויות טריות בלחסן 5 מ&quot;ל של SC-URA OD 600 ~ 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבויות עם סיבוב על 30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים יומן השלב OD 600 ~ 0.8-1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ב15 צינורות חרוטי מ&quot;ל ב 4,400 סל&quot;ד במשך 3 דקות, למזוג supernate ו resuspend תא גלולה ב 500 μl של DDH 2 0; פתרון טרנספר לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב -6,000 סל&quot;ד וזורקים supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 5 מ&quot;ל של SC-URA-נפגש. תאים צריכים להיות מודגרות מסתובב באת המדיה עבור שעת 1 ב 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגות וחזור על לשטוף בDDH 2 0 וזורקים supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspeתאי nd ב5 מ&quot;ל תקשורת SC-URA המכיל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של cycloheximide לעכב ביטוי חלבון, ופנה מייד לשלב 3. </li></ol> 3. Assay שחזור FFL-GFP האנזימטית assay זה הוא גישה כמותית כדי לקבוע את רמות האנזים פעיל באוכלוסייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לassay זה: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד OD 600 עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הסכום דרוש של D-luciferin צורך בהתבסס על מספר הדגימות ומספר החזרות בתוספת כ -1,200 μl לצינורות רצוי. ריכוז סופי של D-luciferin הוא ~ 23 מיקרוגרם לכל 100 μl של תאים. תחילה הוא מומס במים בריכוז פתרון מניות של 7.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ובדילול ל455 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בSC לפני הניסוי. באיור 2, שלוש משכפל עבור כל דגימה נבדקו וכתוצאה מכך הסכום כולל של 2.4 מ&quot;ל של D-luciferin בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית צלחת קורא לבזק לומיassay nescence (עיבוד &quot;Assay הארת פלאש עם הזרקה&quot; BioTek Gen5; למכשירים אחרים פעלו בהתאם להוראות יצרן) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר קורא צלחת להוסיף D-luciferin, לנער, ולקרוא היטב כל אחד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את הארה (נקודת סיום קריאה, 5 שניות זמן אינטגרציה, רמת רגישות 180) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay ההתאוששות בין כל קריאה לנער במשך 5 דקות, 20 דקות עיכוב, ולנער את 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 50 μl של D-luciferin ממזרק. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הארה מחממים ההלם נמדדה מייד לאחר הוספת תאים לתקשורת המכיל cycloheximide לעצור סינתזת חלבון. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של תאים עבור כל דגימה עם מספר רצוי של משכפל לתוך צלחת 96 היטב מוצקה לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרה צריכה לכלול ריק מים ותאים המכילים וקטור ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לקרוא עם SPEcifications מפורט לעיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפגל מחצית FFL של FFL-GFP, דגירה תרבות 5 מ&quot;ל בצינור זכוכית תרבות על 42 מעלות צלזיוס רעד במשך 25 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאות הארה assay שחזור להתחיל מייד לאחר תאים יוסרו מן החממה, שהוא אפס נקודת זמן. מידת הארה זהה למתואר לעיל לנקודת הזמן הראשונה וכל 30 דקות במשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הדגימות לערכי הארה-הלם מחממים שהותאמו על בסיס OD 600 (לחלק את הערכים מחממים-הלם על ידי OD 600). </li></ol> 4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי assay זה הוא שיטה חצי כמותית כדי לקבוע solubilization של אגרגטים לאורך הזמן באוכלוסייה של תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינדוקציה היא אותו כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8 של פרוטוקולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותן נקודות הזמן נלקחות כמתואר לעיל (סעיף 3, שלב 4), אבל למיקרופוןroscopy לאסוף 1 מ&quot;ל של תאים במחממים בהלם וכל נקודת זמן החלמה, ודגימות דגירה מסתובבות ב 30 מעלות צלזיוס בצינור התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מ&quot;ל של תאים ב 6000 סל&quot;ד במשך 30 שניות ולהסיר supernate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב2 μl של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 μl של תאים בתוספת 2 μl של 2% הנמוך להמיס agarose בשקופית ולהוסיף להחליק את המכסה. על מנת לקבל מישור אחד של תאים לחצו קל את האצבע כלפי מטה במרכז להחליק את המכסה ולסובב עד להחליק את המכסה קשה לזוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם דמיינו באמצעות אובייקטיבי שמן 100X במיקרוסקופ פלואורסצנטי; להשתמש דסק&quot;ש לדמיין תאים ומסנן FITC לדמיין הקרינה ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התמונות מרובות עבור כל זן בכל נקודת זמן כדי לכמת. שדות עבור תמונות צריכים להכיל 15-30 ~ תאים לניתוח שלאחר הניסוי כמותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את אחוז התאים המכילים אגרגטים, לספור 50תאי -100 הכוללים ולחלק את מספר התאים המכילים אגרגטים. </li></ol></li></ol> 5. מיקרוסקופית תא בודד שיטה זו משמשת למעקב solubilization של אגרגטים בודדים בתא בודד לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום ביטוי FFL-GFP כפי שתואר בסעיף 2, שלבי 1-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הלם חום, תאי צנטריפוגות בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל ב 4,400 סל&quot;ד במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם 500 μl מים וresuspend ב 20 μl של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל זן, לחתוך את קטע של 5x5 מ&quot;מ צלחת אגר SC-URA ושימוש במשטח שהיה במגע עם צלחת פטרי, פיפטה μl 4 תאים והתפשטו ברחבי פני השטח של אגר עם קצה פיפטה. לתת לעמוד במשך דקות ~ 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה למקום סעיף קובייה אגר עם פנים כלפי מטה על ~ 0 צלחת תחתית זכוכית 55 מ&quot;מ מס ולחץ כלפי מטה בקלילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ויזואליזציה: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה I-III בכתיון 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר קואורדינטות עבור 2-4 מוקדים לכל זן בהתאם לצפיפות של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המצלמה כדי לצלם תמונות עם Z-מחסנית עם הטווח מתאים (- / + 15 מיקרומטר עם עובי פרוס מיקרומטר 0.5-1.0) כל 5 דקות לתקופה 90 דקות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

במאמר זה מודל חלבון FFL-GFP שימש כדי להראות שdisaggregase השמרים, Hsp104 תורם לחלבון מחדש solubilization ותיקון. את מבחני וכן במיקרוסקופ אנזימטיות נחקרו באופן דיפרנציאלי את המצב של אותו חלבון המצע כדי לקבוע את היעילות ותשואת refolding. תוצאות של מבחני ההתאוששות אנזימטית עולה כי לא רק שההתא?...

אצל בני אדם הפרעות ניווניות לרבות המחלות של הנטינגטון אלצהיימר, פרקינסון, ונקשרו לחלבון misfolding וצבירה 10. תאים להעסיק מלווים מולקולריים כדי למנוע השמנה הקינטית של חלבונים תאיים לתוך מבני 6 misfolded לא פעילים. מלווים להשתתף ברשתות אינטראקציה מורכבות בתוך התא, אך הוא לא הבין לגמרי איך הסכום של אינטראקציות אלה תורם לproteostasis האורגניזם. אחד מהמלווים העיקריים האחראים למרבית קיפול חלבוני cytosolic הוא חלבון 70 KD חום ההלם (Hsp70) המשפחה 19. הוכח כי באובדן שמרים של ירידות HSP70 היכולת לקפל FFL heterologously הביע המתהווה וכדי לקפל את חלבון אנדוגני, ornithine transcarbamoylase, ב18 vivo, 7. היכולת לנתח מתקפל עם רזולוציה קרובה זמן אמת יקל להבין כיצד גורמים נוספים המשך הסלולריribute לתהליך Hsp70 תלוי זה. בנוסף, קיפול / refolding תגובות לא יכול להיות תלוי לחלוטין בחלבונים התורמים אלה, ולכן מבחני חייבים להיות רגישים מספיק כדי לזהות את שני שינויים גדולים וקטנים בקינטיקה ויעילות. Disaggregase תא השמרים, Hsp104, ממלא תפקיד חיוני בתיקון חלבוני misfolded מצטברים. למרות Hsp104 homologs זוהה בפטריות וצמחים, משפחה זו מופיעה להיעדר בmetazoans. זה הוצע כי מלווים אחרים, כגון אלו של משפחת Hsp110 לבצע חלק מפעילויות Hsp104 הידועות ביונקים 16. Hsp104 הוא +, חלבון מורכב hexameric AAA שמתפקד בשמרים לאגרגטים חלבון לשפץ, שתרם לrefolding ותיקון 13. Hsp104, יחד עם שמרי Hsp70, Ssa1, ושמרי Hsp40, Ydj1, נדרש להתאוששות של FFL מפוגל בשמרי תאים 5, 8. החלבון הקטן חום ההלם, Hsp26, גם הוכח להיות requiאדום לdisaggregation Hsp104 בתיווך של FFL 2. FFL הוא חלבון שני תחום שנקשר luciferin המצע באתר הפעיל ובעקבות שינוי קונפורמציה שדורש ATP וחמצן, decarboxylates מצע שחרור oxyluciferin, פחמן דו חמצני (CO 2), monophosphate אדנוזין (AMP), ו -11 קלות, 9, 3. המצע זמין מסחרי FFL, D-luciferin, התוצאות בפליטת אור בין 550-570 ננומטר שניתן לאתר באמצעות luminometer 15. FFL הוא רגיש להפליא denaturation מטיפולים כימיים או חום ואגרגטים במהירות על התגלגלות. בעת חשיפה לטמפרטורות שבין 39-45 מעלות צלזיוס FFL הוא פרש הפיך ו12 מומתים. לעומת זאת, ה-GFP ונגזרותיו הם עמידים מאוד לחלבון התגלגלות לחצים 14. לכן שילוב של שני החלבונים האלה מאפשר FFL לתפקד כמחצית ניסוי יציבה מסוגלת מיקוד G הפונקציונליFP לתאי פיקדונות שניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהוא על האוכלוסייה ורמות תא בודדות. יישום של assay אנזימטי בקורא צלחת multimode חצי אוטומטית בשילוב עם מיקרוסקופ האוטומטי מאפשר הערכה בו זמנית חסרת תקדים של קינטיקה תשואה של refolding תגובות. בנוסף, הגנטיקה המולקולרית הקלילה של cerevisiae Saccharomyces eukaryote המודל מאפשרת גם מניפולציה מדויקת של רשת בקרת איכות החלבון ואת ההזדמנות לגילוי המבוססים על גישות חדשניים כדי לזהות שחקנים שתרמו לתגובת לחץ התאי וproteostasis. במחקר זה, זני הבר מסוג (WT) וHSP104 מחיקה להביע FFL-GFP כפופים להלם חום denaturing חלבון. refolding FFL-GFP הוא פיקוח באמצעות שניהם assay אנזימטי ומיקרוסקופיה כreadout proxy עבור תיקון של proteome בא לידי ביטוי לאורך כמובן זמן התאוששות. בהשוואה לתאי WT, אנו מראים הזן מחיקת Hsp104 דואר הוא ~ 60% פחות יעיל בrefolding FFL-GFP, התומכים בממצאים קודמים הקמת תפקיד לHsp104 בהפעלה מחדש של מפוגל FFL 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Synergy MX Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td><td>Olympus, Tokyo Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>(LiAc) Lithium Acetate</td><td>Sigma</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>PEG (polyethelene glycol)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>Sunrise</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>Sunrise</td><td>1306-030</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Acros Organics</td><td>357420050</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>low melt agarose</td><td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>immersion oil</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, שהוגדר כתהליכים המשולבים של קיפול חלבונים / biogenesis, refolding / תיקון, והשפלה, הוא איזון עדין סלולרי שחייבים להישמר, כדי למנוע השלכות מזיקות 1. גורמים חיצוניים או פנימיים המשבשים את האיזון הזה יכולים להוביל להצטברות חלבון, רעיל ומוות של תאים. אצל בני אדם זה הוא גורם מרכזי תורם לסימפטומים הקשורים בהפרעות ניווניות כגון הנטינגטון 10, פרקינסון, והמחלות אלצהיימר. לכן זה חיוני שהחלבונים המעורבים בתחזוקה של proteostasis להיות מזוהים על מנת לפתח טיפולים למחלות המתישות האלה. מאמר זה מתאר שיטות לניטור בקיפול חלבוני vivo ברזולוציה זמן כמעט אמיתית באמצעות לוציפראז גחלילית חלבון המודל התמזג חלבון פלואורסצנטי ירוק (FFL-GFP). FFL-GFP הוא חלבון chimeric מודל ייחודי כמחצית FFL היא רגישה מאוד ללחץ-Induced מ &#39;isfolding וצבירה, אשר מנטרלת את האנזים 12. פעילות לוציפראז היא פיקוח באמצעות assay אנזימטי, ומחצית GFP מספקת שיטה של ​​הדמיה FFL המסיס או מצטבר באמצעות מיקרוסקופ האוטומטי. שיטות אלה בשילוב לשלב את שתי מקבילות ועצמאיים מבחינה טכנית גישות לניתוח והן refolding מחדש תפקודי של אנזים אחרי מתח. התאוששות פעילות יכולה להיות בקורלציה ישירה עם קינטיקה של disaggregation מחדש solubilization כדי להבין טוב יותר כיצד גורמי בקרת איכות חלבון כגון מלווים חלבון לשתף פעולה כדי לבצע פעולות אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בו מחיקות או מוטציות גנטיות כדי לבדוק את תרומתם של חלבונים ספציפיים או יחידות משנת חלבון לתהליך זה. במאמר זה אנו בוחנים את תרומתם של חלבון disaggregase 13 Hsp104, ידוע לשותף עם גורם חילופי Hsp40/70/nucleotide (NEF) refolding מערכת 5, לrefolding חלבון כדי לאמת את הגישה הזאת.

השמרים תלויים בdisaggregase, Hsp104 לקפל חלבוני חום מפוגלים ביעילות. הפעילות של FFL-GFP הייתה פיקוח אחרי 25 דקות הלם חום, באמצעות assay הבזק הארה איור 1. את התוצאות של assay האוטומטי זו שמוצגת באיור 2 נחשפו עלייה הדרגתית בפעילות מעל 90 דקות שסופו של דבר הובילו להתאוששות&...

Watch this Scientific Journal Video about Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור<em&gt; In vivo</em&gt; קיפול חלבונים ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em&gt;. שימוש מגיב זה, refolding של חלבון בחום מפוגל מודל יכול להיות במעקב בו זמנית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וassay אנזימטי לחקור את התפקידים של רכיבי רשת proteostasis בבקרת איכות חלבון.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K Views.  University of Texas Medical School. מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור In vivo קיפול חלבונים ב Cerevisiae Saccharomyces. שימוש מגיב זה, refolding של חלבון בחום מפוגל מודל יכול להיות במעקב בו זמנית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וassay אנזימטי לחקור את התפקידים של רכיבי רשת proteostas...

Video: Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetics

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Biochemistry

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Intracellular Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds with inhibitory/stimulating activity. Molecular chaperones are proteins involved in regulation of protein folding1 and have a crucial role in promoting cell survival upon stress insults like heat shock2, nutrient starvation and exposure to chemicals/poisons3. For this reason chaperones are found to be involved in events like tumor development, chemioresistance of cancer cells4 as well as neurodegeneration5. Design of small molecules able to inhibit or stimulate the activity of these enzymes is therefore one of the most studied strategies for cancer therapy7 and neurodegenerative disorders9. The assay here described offers the possibility to measure the refolding activity of a particular molecular chaperone and to study the effect of compounds on its activity. In this method the gene of the molecular chaperone investigated is transfected together with an expression vector encoding for the firefly luciferase gene. It has been already described that denaturated firefly luciferase can be refolded by molecular chaperones10,11. As normalizing transfection control, a vector encoding for the renilla luciferase gene is transfected. All transfections described in this protocol are performed with X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cells. In the first step, protein synthesis is inhibited by treating the cells with cycloheximide. Thereafter protein unfolding is induced by heat shock at 45&deg;C for 30 minutes. Upon recovery at 37&deg;C, proteins are re-folded into their active conformation and the activity of the firefly luciferase is used as read-out: the more light will be produced, the more protein will have re-gained the original conformation. Non-heat shocked cells are set as reference (100% of refolded luciferase).

In this protocol a method to measure intracellular protein refolding after heat shock is described. This method can be used to study foldases like molecular chaperones and their co-factors or compounds able to influence their activity. Firefly luciferase activity is used as reporter to measure chaperone refolding activity.

שב וקיפל תאיים Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

שב וקיפל תאיים Assay

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב

בימוי שיטת אבולוציה

Cycloheximide ניתוח צ'ייס של פירוק חלבונים ב

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל