Bu çalışma KAM ve Ayrıca OFF sağlamak için Toronto Üniversitesi&#39;nde John Glover teşekkür JLA için Mikrobiyoloji Robert D. Watkins Yüksek Lisans Araştırma Bursu bir American Society Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS-074.696) bir hibe ile desteklenmiştir GFP kaynak plazmid.

1. Plazmid OFF-GFP İçeren Suşlarının İnşaatı Bu çalışma için, Saccharomyces cerevisiae suşu BY4741 (MAT bir, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) maya nakavt toplama (Açık Biyosistem / Thermo Scientific) bir HSP104 silme suşu ile birlikte kullanılmıştır. Silme Western blot analizi için bir Hsp104 spesifik antikor kullanılarak doğrulandı. OFF-GFP yazarlara talep üzerine Toronto 17 Üniversitesi ve elde de Glover laboratuvar elde edilen plazmid bir LEU2-tabanlı kaynak yapılmış, p426MET25-OFF-GFP ifade edildi. III-gfp plazmit füzyon proteininin ifadesi doğal arttırıcıları olan MET25 metiyonin bastırılabilir promotörü tarafından kontrol edilir. Plazmid Gietz ve arkadaşları uyarlanmış bir protokol kullanılarak, her bir suş dönüştürüldü. arkadaşları, 1995: <ol><li> 25 ml o Santrifüj<html> 2 dakika 4.400 rpm&#39;de 50 ml konik tüp f log fazı hücreleri, çift distile H 2 0 (GKD 2 O) 500 ul ile yıkayın ve yüzen kısım atın. </li><li> TE / LiAc (Tris-HCI 10 mM, pH = 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 M lityum asetat) ve 250 ul içinde süspanse hücreleri. 20 dakika boyunca karıştırmadan 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Taşıyıcı DNA 5 ml (50 mg) ve plazmid DNA 5 ul (0.1-5 mg) ile birlikte, yeni bir tüpe yetkili hücreleri 50 ul aktarın. PEG / TE / LiAc (TE / LiAc artı% 40 polietilen glikol gibi) bu karışıma 300 ul ekleyin ve ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca 30 inkübe hücreleri. </li><li> 6 dakika boyunca 42 de bu karışım ve ısı şoku ° C ila 1/10 hacim (v / v) DMSO (36 ul) ilave edilir. </li><li> 30 sn ve kaldır yüzen kısım için 6.000 rpm karışımı santrifüj. Urasil (SC-URA) eksik sentetik tam medya üzerine steril GKD 2 0 ve plaka hücreleri 100 ul hücreleri tekrar süspansiyon. </li></ol> 2. OFF-GFP indüksiyon önce ısı şok proteini çoğunluğu yeni terminal yaşlanmayla ilişkili hücresel yetersizlikler nedeniyle zaman içinde toplanmış olan proteinler önlemek için yapılır, böylece hücrelerin log fazı bir kez nt &quot;&gt; III-GFP indüklenir. <ol><li> Gün 1: 30 SC-Ura 5 ml inkübe hücreleri ° C döner O / N </li><li> 2. Gün: ölçün OD 600 ve SC-URA OD 600 ~ 0.2 5 ml inokülasyon taze kültür. </li><li> Onlar log fazı OD 600 ~ 0.8-1.0 ulaşmak ° C kadar 30 rotasyon ile kültür inkübe edin. </li><li> GKD 2 0 500 ul 3 dakika, süzün yüzen kısım ve tekrar süspansiyon hücre pelet için 4,400 rpm&#39;de 15 ml konik tüpler hücreleri Santrifüj, bir mikrosantrifüj tüp transferi çözüm. </li><li> 6.000 rpm&#39;de santrifüj ve yüzen kısım atın. </li><li> SC-URA-MET 5 ml süspansiyon hücreleri. Hücreler, 30 ° C&#39;de 1 saat boyunca bu ortam içinde dönen inkübe edilmelidir </li><li> Santrifüj hücreleri ve tekrar GKD 2 0 olarak yıkama ve yüzen kısım atın. </li><li> Resuspe100 ug / protein ekspresyonu inhibe ettiği ve Adım 3 hemen devam etmeye sikloheksimid ml içeren 5 ml SC-URA ortam nd hücreleri. </li></ol> 3. Enzimatik OFF-GFP Kurtarma Testi Bu testte bir popülasyonda aktif enzim düzeylerini belirlemek için nicel bir yaklaşımdır. <ol><li> Bu deney için hazırlanması: <ol class="lroman"><li> Her numune için OD 600 ölçün. </li><li> D-luciferase gerekli miktarda hazırlayın örneklerin sayısına göre ve kopya sayısı artı boru için yaklaşık olarak 1.200 ul istenilen gerekli. D-luciferase son konsantrasyon hücrelerinin 100 ul başına ~ 23 mikrogram olduğunu. Başlangıçta bu 7.5 mg / ml &#39;lik bir stok çözeltisi konsantrasyonda su içinde çözülür ve önceden deneme için 455 ug / SC ml&#39; ye seyreltildi. Her bir örnek D-luciferase kullanılan 2.4 ml toplam sonuçlanan analiz edildi için Şekil 2&#39;de, üç çoğaltır. </li><li> Flaş lumi Programı plaka okuyuculüminesans yöntemi (BioTek Gen5 &quot;Enjeksiyon ile Lüminesans Flaş Testi&quot; uyarlanan; diğer enstrümanlar üreticinin talimatlarına için) <ol class="lalpha"><li> 30 ° C sıcaklık ayarı </li><li> , D-luciferase ekleyin sallamak, ve tek tek her iyi okumak için plaka okuyucu ayarlayın. </li><li> Lüminesans okuyun (nokta okuma, 5 saniye entegrasyon süresi, 180 duyarlılık düzeyi) </li><li> 5 dakika boyunca her bir okuma Karıştırılmış arasında iyileşme testi için, 20 dakika gecikme ve ilave 5 dakika karıştırın. </li><li> Bir enjektörün D-luciferase 50 ul koyun. </li></ol></li></ol></li><li> Hücreler protein sentezi durdurmak için sikloheksimid içeren medya eklendikten sonra ön ısıtma-şok lüminesans hemen ölçülür. <ol class="lroman"><li> Sağlam bir beyaz 96 plaka içine çoğaltır istenilen sayıda her bir örnek için hücrelerin 100 ul aktarın. </li><li> Kontroller bir su boş ve boş bir vektör içeren hücreleri içermelidir. </li><li> SPE ile okuma başlarcifications Yukarıda listelenen. </li></ol></li><li> III-GFP OFF yarımı denatüre etmek için, 42 yaşında bir camdan yapılmış bir kültür tüp içinde 5 ml kültür ° C&#39;de inkübe edin, 25 dakika boyunca sallayın. </li><li> Hücreler zaman noktası sıfırdır inkübatör, kaldırılır sonra Kurtarma test lüminesans okuma hemen başlar. İlk zaman noktası ve 90 dakika boyunca her 30 dakika için yukarıda tarif edildiği gibi aynı ölçüde lüminesans. </li><li> OD 600 (OD 600 ile ön ısıtma-şok değerleri bölmek) göre ayarlanır olan ön ısıtma-şok lüminesans değerlere örnekleri normalleştirmek. </li></ol> 4. Floresan Mikroskopi Bu deney bir hücre popülasyonunda zamanla agrega çözünürleştirme belirlemek için bir yarı-nicel bir yöntemdir. <ol><li> İndüksiyon, Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi, aynı protokol 1-8 adımlar. </li><li> Aynı zaman noktalarında (Bölüm 3, Adım 4) yukarıda tarif edildiği gibi alınmıştır, ancak mikrofon içinroscopy 1 ön ısıtma-şok da hücre ml ve her iyileşme süresi noktası ve ° C kültür tüp içinde 30 dönen inkübe örnekleri toplamak. </li><li> Görselleştirme: <ol class="lroman"><li> 30 sn ve kaldır yüzen kısım için 6.000 rpm hücre 1 ml santrifüj. </li><li> GKD 2 O. 2 ul tekrar süspansiyon hücre pelet </li><li> Pil, slayt üzerinde% 2 düşük erime agaroz 2 ul 2 ul karıştırın ve bir kapak kayma ekleyin. Hücreleri tek bir düzlem elde etmek için hafifçe kapak kayma ortasındaki parmak bastırın ve kapak kayma taşımak zor kadar döndürün. </li><li> Hücreler floresan mikroskop 100X yağ objektif kullanarak raporlarının yer; GFP floresan görselleştirmek için hücreleri ve FITC filtresi görselleştirmek için DIC kullanın. </li><li> Kantitatif için her noktada her bir suş için birden fazla fotoğraf çekmek. Resimler için alanları nicel sonrası deneysel analizi için ~ 15-30 hücreleri içermelidir. </li><li> Agrega içeren hücrelerin yüzdesi hesaplamak için, 50 saymak-100 Hücreleri toplam ve agrega içeren hücrelerin sayısı bölün. </li></ol></li></ol> 5. Tek Hücre Mikroskopi Bu yöntem, zaman içinde tek bir hücrede bireysel agregaların çözündürme takip etmek için kullanılır. <ol><li> Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi III-GFP ekspresyonunu, 1-8 adımlar. </li><li> Sonra ısı-şok, 2 dakika 4.400 rpm&#39;de 15 ml konik tüp santrifüj hücreleri. </li><li> GKD 2 O. 20 ul su ve tekrar süspansiyon 500 ul hücreleri yıkayın </li><li> Her bir suş için, bir SC-URA agar plaka bir 5x5 mm bölümünü kesip Petri kabı, pipet ile agar yüzeyi etrafında hücreleri ve yayılma ul pipet 4 ile temas olan yüzey kullanarak. ~ 1 dakika bekletin. </li><li> Bir ~ 55 mm cam alt çanak No 0 yüzü aşağı agar küp bölümü yerleştirin ve hafifçe bastırın için cımbız kullanın. </li><li> Görselleştirme: <ol class="lroman"><li> Tarikatı i-iii bakiyon 4. </li><li> Set kültür yoğunluğuna bağlı olarak her bir suş için 2-4 odak noktaları için koordine eder. </li><li> (- Bir 0.5-1.0 mikron dilim kalınlığında / + 15 mikron) bir 90 dakika süreyle her 5 dk uygun yelpazesi ile bir Z-yığını ile fotoğraf çekmek için kamera ayarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+proteostasis+for+disease+intervention.">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li><li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104.">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li><li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis.">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li><li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104,+Hsp70,+and+Hsp40:+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins.">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li><li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+folding.">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li><li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins.">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li><li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding.">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li><li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+bioluminescence:+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions.">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone.">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li><li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104.">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li><li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+(GFPuv)+at+various+pH+values.">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li><li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light.">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+disaggregase+machinery:+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system.">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319 (2011).</li><li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells.">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li><li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Hsp70+subfamily,+Ssa,+in+protein+folding+in+yeast+cells,+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants.">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li><li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones:+budding+yeast+(Saccharomyces+cerevisiae)+as+a+model+system.">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda modeli protein FFL-GFP maya disaggregase, Hsp104 protein yeniden-solübilizasyon ve onarım katkıda göstermek için kullanılmıştır. Enzimatik deneyler ve diferansiyel olarak mikroskobik yeniden katlama etkinliği ve verimi belirlemek için, aynı alt-tabaka proteini durumunu sorguya. Enzimatik kurtarma testlerinin sonuçları, verimsiz hsp104D mutant soyu içinde maksimum iyileşme değil sadece olduğunu göstermektedir, ancak açılımı stres başlangıç ​​büyüklüğü mutant suşu <s...

İnsanlarda Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları gibi nörodejeneratif hastalıklar yanlış katlanması ve protein agregasyonu 10 ile bağlantılı olmuştur. Hücreler katlanan aktif yapıları 6 içine hücresel proteinlerin kinetik yakalama önlemek için moleküler şaperonlar kullanır. Chaperones hücre içinde karmaşık etkileşim ağları katılmak, ancak tamamen bu etkileşimlerin toplamı organizma proteostasis nasıl katkıda anlaşılamamıştır. Sitozolik protein katlanması çoğunluğu sorumlu başlıca chaperones biri 70 kD ısı şok proteini (Hsp70) aile 19&#39;dur. Bu, gösterilmiştir ki, Hsp70 azalır maya kaybı olgunlaşmamış heterolog bir şekilde eksprese OFF katlamak ve in vivo 18, 7, endojen proteinin, ornitin transcarbamoylase, yeniden kapatmak için yeteneği. Yakın-gerçek zamanlı çözünürlüğü ile katlama analiz yeteneği anlaşılmasını kolaylaştırmak nasıl ek hücresel faktörler devamBu Hsp70 bağımlı işlemine destek olmaktır. Buna ek olarak, katlama / reaksiyonlar refolding bu katkı proteinler tamamen bağımlı olmayabilir, bu nedenle testleri kinetik ve verimlilik büyük ve küçük değişiklikler hem saptamak için yeterli olmalıdır. Maya hücre disaggregase, Hsp104, toplu katlanan proteinleri tamir hayati bir rol oynar. Hsp104 homologlar mantar ve bitki tespit edilmiş olmasına rağmen, bu aile metazoans yok gibi görünmektedir. Bu tür Hsp110 ailesinin gibi diğer chaperones memeliler 16 bilinen Hsp104 faaliyetlerin bazı gerçekleştirmek ileri sürülmüştür. Hsp104 bir AAA +, heksamerik protein kompleksi olduğunu değişiklik protein agrega için maya fonksiyonları, refolding ve onarım 13 katkıda. Hsp70 maya, Ssa1, ve maya Hsp40, Ydj1 birlikte Hsp104, maya hücreleri 5, 8 denatüre OFF geri kazanımı için gereklidir. Küçük ısı şok proteini, Hsp26, aynı zamanda requi olduğu gösterilmiştirOFF 2 Hsp104 aracılı ayrıştırma için kırmızı. Ffl alt tabaka, aktif sahada lusiferin ve ATP ve oksijen, decarboxylates gerektiren bir konformasyonel değişimin ardından bağlanan bir iki-domenli bir proteindir oxyluciferin, karbon dioksit (CO2), adenozin monofosfat (AMP) ve ışık 11, serbest substrat 9, 3. Ticari olarak temin edilebilen OFF substrat, D-luciferase bir luminometrede 15 kullanılarak tespit edilebilir 550-570 nm arasında ışık yayılması ile sonuçlanır. OFF açılımı üzerine kimyasal veya ısıl işlemler ve hızla agrega gelen denatürasyon için zarif duyarlıdır. 39-45 arasında sıcaklıklara maruz kaldığında ° C OFF geri dönüşümlü gelişeceğini ve inaktif 12 olduğunu. Bunun tersine GFP ve türevleri gerilme 14 açılımı proteini için son derece dayanıklıdır. Bu nedenle, bu iki proteinin füzyon fonksiyonel G hedefleme yeteneğine sahip bir deneysel olarak oynak parçası olarak işlev sağlar OFFFP nüfus ve tek bir hücre düzeyde hem de floresan mikroskobu kullanarak görüntülenebilir mevduat hücre içi. Otomatik mikroskobu ile birleştiğinde bir yarı-otomatik modlu plaka okuyucu enzimatik test uygulanması kinetik ve reaksiyon refolding getirisi görülmemiş eş zamanlı değerlendirilmesi sağlar. Buna ek olarak, ökaryot modeli, Saccharomyces cerevisiae kolay moleküler genetik hassas protein kalitesi kontrol ağ manipülasyon ve hücresel stres tepkisi ve proteostasis katkıda bulunan yeni bir oyuncu tespit etmek Buluşa dayalı yaklaşımlar için fırsat hem de sağlar. Bu çalışmada, III-GFP ifade vahşi tip (WT) ve HSP104 silme suşları protein denatüre ısı şokuna tabi tutulur. OFF-GFP refolding bir iyileşme süresi boyunca ifade proteom tamiri için bir proxy okuma olarak bir enzimatik tahlil ve mikroskopi hem aracılığıyla izlenir. WT hücrelere karşılaştırıldığında, biz th göstermekE Hsp104 silme gerginlik denatüre OFF 2 reaktivasyonu içinde Hsp104 için bir rol kurulması önceki bulguları destekleyen, FFL-GFP refolding de ~% 60 daha az verimlidir.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Protein katlanması / biyogenezi kombine süreçler olarak tanımlanan Proteostasis, refolding / onarım ve bozulması, zararlı sonuçlara 1 önlemek için korunması gerekir hassas bir hücresel dengedir. Bu dengeyi bozabilir iç ve dış faktörler protein toplama, toksisite ve hücre ölümüne yol açabilir. İnsanlarda bu, Huntington, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları gibi nörodejeneratif hastalıkların 10 ile ilişkili semptomlar için önemli bir katkıda bulunan bir faktördür. Bu proteostasis bakım katılan proteinler bu zayıflatan hastalıklar için tedavi geliştirmek amacıyla tespit edilmesi bu nedenle önemlidir. Bu makale yeşil flüoresan protein (FFL-GFP) erimiş modeli protein ateşböceği lusiferaz kullanarak yakın gerçek zamanlı çözünürlükte in vivo protein katlanması izleme teknikleri anlatılmaktadır. OFF kısmı strese bağlı m son derece hassas olduğu için OFF-GFP eşsiz bir model kimerik proteindirenzim 12 inaktive isfolding ve toplama,. Lusiferaz aktivitesi, bir enzimatik deney kullanılarak izlenir, ve GFP kısmı otomatik mikroskopi kullanılarak çözülebilir ya da toplu OFF görüntülenmesi için bir yöntem temin edilmektedir. Bu birleştiğinde yöntemler refolding ve stres sonra enzimin fonksiyonel reaktivasyonu hem analiz etmek için iki paralel ve teknik olarak bağımsız yaklaşımlar içermektedir. Faaliyet kurtarma doğrudan daha iyi protein chaperones gibi protein kalite kontrol faktörler bu işlevleri gerçekleştirmek için işbirliği nasıl anlamak için ayrıştırma ve yeniden çözünmüş kinetiği ile ilişkili olabilir. Buna ek olarak, gen silme ya da mutasyon bu işlem için özel protein veya protein alt birimlerinin katılım test etmek için de kullanılabilir. Bu yazıda bu yaklaşım doğrulamak için protein refolding için, sistemi 5 refolding Hsp40/70/nucleotide değişim faktörü (NEF) ile ortak bilinen protein disaggregase Hsp104 13, katkıları inceleyin.

Maya disaggregase bağlıdır, Hsp104 verimli ısı denatüre proteinlerin yeniden kapatmak için. OFF-GFP faaliyeti bir parlaklık flaş testi Şekil 1 kullanarak, bir 25 dakika ısı şok sonrası izlenmiştir. Şekil 2&#39;de gösterilen bu otomatik test sonuçları, sonuçta WT hücrelerinde&gt;% 80 düzelme sağladı 90 dakika boyunca aktivitesinde kademeli bir artış saptandı. Hsp104Δ gerginlik aynı zaman dilimi içinde, orijinal aktivitesinin% 19 iyileşti. Ayrıca, ...

Watch this Scientific Journal Video about Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif eder<em&gt; In vivo</emIçinde&gt; protein katlanması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bir model ısıyla denatüre edilmiş proteinin yeniden katlanması, bu tepkin madde kullanılarak floresan mikroskop ve protein kalite kontrol proteostasis ağ bileşenlerinin rollerini araştırmak için bir enzimatik deneyi ile aynı anda kontrol edilebilir.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K Görüntüleme.  University of Texas Medical School. Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif eder In vivo protein katlanması Saccharomyces cerevisiae. Bir model ısıyla denatüre edilmiş proteinin yeniden katlanması, bu tepkin madde kullanılarak floresan mikroskop ve protein kalite kontrol proteostasis ağ bileşenlerinin rollerini araştırmak için bir enzimatik deneyi ile aynı anda kontrol edilebilir.

Video: Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.