Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (NIGMS-074696) a KAM y la Sociedad Americana de Microbiología Robert D. Watkins de Becas de Postgrado Investigación Estudiantil de JLA También agradecemos a John Glover en la Universidad de Toronto para la prestación del FLE -GFP fuente de plásmido.

1. Construcción de las cepas que contienen FFL-GFP plásmido Para este estudio, Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741 (MAT una, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) se utiliza junto con una supresión cepa HSP104 de la colección nocaut levadura (Open Biosystems / Thermo Scientific). La deleción se confirmó utilizando un anticuerpo Hsp104-específico para el análisis de Western blot. FFL-GFP se expresa a partir de p426MET25-FFL-GFP, construido a partir de una fuente LEU2 plásmido basado obtenido por el laboratorio Glover en la Universidad de Toronto 17 y obtenible a petición de los autores. Expresión de la proteína de fusión plásmido FFL-GFP es controlado por el promotor MET25 metionina-reprimible. El plásmido se transformó en cada cepa usando un protocolo fue adaptado de Gietz et. al, 1995: <ol><li> Centrifugar 25 ml o<html> f células en fase de registro en un tubo cónico de 50 ml a 4.400 rpm durante 2 min, se lavan con 500 l de doble destilada H 2 0 (ddH 2 O), y descartar sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 250 l de TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 1 mM, acetato de litio 0,1 M). Incubar a 30 ° C sin mezclar durante 20 min. </li><li> Transferir 50 l de células competentes a un nuevo tubo junto con 5 ml (50 g) de ADN portador y 5 l (0,1-5 g) de ADN plásmido. Añadir 300 l de PEG / TE / LiAc (igual que el% de polietilenglicol TE / LiAc más 40) a esta mezcla, y las células se incuban a 30 ° C durante otros 30 min. </li><li> Añadir 1/10 volumen (v / v) de DMSO (36 l) a esta mezcla y choque térmico a 42 ° C durante 6 min. </li><li> Se centrifuga la mezcla a 6.000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante. Resuspender las células en 100 l de ddH 2 0 y células de la placa estériles en medios completos sintéticos que carecen de uracilo (SC-URA). </li></ol> 2. La inducción de la FFL-GFP nt &quot;&gt; FFL-GFP es inducida una vez que las células están en la fase de registro por lo que la mayoría de la proteína antes de choque térmico se hace para evitar recién proteínas que se han agregado terminalmente con el tiempo debido a las insuficiencias celulares relacionadas con el envejecimiento. <ol><li> Día 1: Se incuban las células en 5 ml de SC-ura a 30 ° C giratoria O / N. </li><li> Día 2: Medida OD 600 y cultivos frescos inocular en 5 ml de SC-URA OD 600 ~ 0,2. </li><li> Incubar los cultivos con rotación a 30 º C hasta que alcanzan la fase de registro OD 600 ~ 0,8-1,0. </li><li> Centrifugar las células en tubos cónicos de 15 ml a 4400 rpm durante 3 min, decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 500 l de ddH 2 0; solución de transferencia a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 6000 rpm y descartar sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 5 ml de SC-URA-MET. Las células deben ser incubadas rotación en este medio durante 1 hora a 30 ° C. </li><li> Centrifugar las células y de lavado se repiten en ddH 2 0 y descartar sobrenadante. </li><li> Resuspend células en 5 medios SC-URA ml conteniendo 100 mg / ml de cicloheximida para inhibir la expresión de la proteína, y proceder de inmediato al paso 3. </li></ol> 3. Ensayo enzimático Recuperación FFL-GFP Este ensayo es un enfoque cuantitativo para determinar los niveles de enzima activa en una población. <ol><li> Preparación para este ensayo: <ol class="lroman"><li> Mida OD 600 para cada muestra. </li><li> Prepare la cantidad necesaria de D-luciferina necesaria basada en el número de muestras y el número de repeticiones más aproximadamente 1200 l para el tubo deseado. La concentración final de D-luciferina es ~ 23 g por 100 l de células. Inicialmente se disuelve en agua a una concentración de solución madre de 7,5 mg / ml y se diluyó hasta 455 g / ml en SC antes del experimento. En la Figura 2, tres repeticiones para cada muestra fueron analizados resultando en un total de 2,4 ml de D-luciferina que se utiliza. </li><li> Lector de placas Programa para el flash lumiensayo nescence (adaptado de BioTek Gen5 &quot;luminiscencia flash ensayo con inyección&quot;, para otros instrumentos sigan las instrucciones del fabricante) <ol class="lalpha"><li> Ajustar la temperatura a 30 ° C </li><li> Establecer lector de placas para añadir D-luciferina, agitar y leer cada pozo individual. </li><li> Leer luminiscencia (lectura de punto final, 5 segundos de tiempo de integración, 180 niveles de sensibilidad) </li><li> Para el ensayo de recuperación entre cada movimiento de la lectura durante 5 min, 20 min retrasar, y agitar un adicional de 5 min. </li><li> Dispensar 50 l de D-luciferina de un inyector. </li></ol></li></ol></li><li> Luminiscencia Precaliente-shock se mide inmediatamente después las células se añaden a los medios de comunicación que contienen cicloheximida para detener la síntesis de proteínas. <ol class="lroman"><li> Transferir 100 l de células para cada muestra con el número deseado de repeticiones en un blanco placa de 96 pocillos sólida. </li><li> Los controles deberán incluir un blanco de agua y las células que contienen un vector vacío. </li><li> Inicie la lectura con el SPEcificaciones mencionados anteriormente. </li></ol></li><li> Para desnaturalizar el resto de FFL de FFL-GFP, se incuba el cultivo de 5 ml en un tubo de cultivo de vidrio a 42 ° C con agitación durante 25 min. </li><li> Lecturas de luminiscencia de ensayo de recuperación comienzan inmediatamente después de las células se retiran de la incubadora, que es punto de tiempo cero. Medida luminiscencia mismo como se describe anteriormente para el primer punto de tiempo y cada 30 min durante 90 min. </li><li> Normalizar las muestras a los valores de luminiscencia de choque de precalentamiento que se han ajustado en base a la OD 600 (dividir los valores de precalentamiento de choque por OD 600). </li></ol> 4. Microscopía de fluorescencia Este ensayo es un método semi-cuantitativo para determinar la solubilización de los agregados con el tiempo en una población de células. <ol><li> La inducción es la misma como se describe en la Sección 2, Etapas 1-8 de protocolos. </li><li> Los mismos puntos de tiempo se toman como se ha descrito anteriormente (Sección 3, Paso 4), pero para micrófonoroscopy recoger 1 ml de células en precalentar-choque y cada punto de tiempo de recuperación, y las muestras se incuban que giran a 30 ° C en tubo de cultivo. </li><li> Visualización: <ol class="lroman"><li> Centrifugar 1 ml de células a 6000 rpm durante 30 segundos y quitar sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 2 l de ddH 2 O. </li><li> Mezcle 2 l de células más 2 l de 2% de agarosa de baja fusión en la diapositiva y agregue una hoja de cubierta. Con el fin de obtener un solo plano de células presione ligeramente el dedo en el centro de la hoja de la cubierta y gire hasta que la hoja de la cubierta es difícil de mover. </li><li> Las células se visualizaron utilizando aceite objetivo de 100X microscopio de fluorescencia, el uso de DIC para visualizar las células y el filtro FITC para visualizar la fluorescencia de GFP. </li><li> Tome varias imágenes para cada cepa en cada punto de tiempo para la cuantificación. Los campos para los cuadros deben contener ~ 15 a 30 células para el análisis post-experimental cuantitativa. </li><li> Para calcular el porcentaje de células que contienen agregados de la talla 50Células -100 suman y dividen el número de células que contienen agregados. </li></ol></li></ol> 5. Soltero Microscopía Celular Este método se utiliza para seguir la solubilización de los agregados individuales en una sola celda con el tiempo. <ol><li> Inducir la expresión FFL-GFP como se describe en la Sección 2, los pasos 1-8. </li><li> Después de choque térmico, las células de centrifugación en tubo cónico de 15 ml a 4400 rpm durante 2 min. </li><li> Lavar las células con 500 l de agua y volver a suspender en 20 l de ddH 2 O. </li><li> Para cada cepa, cortar una sección de 5x5 mm de una placa de agar SC-URA y el uso de la superficie que estaba en contacto con una placa de Petri, pipeta de 4 l de células y se extendió alrededor de la superficie de agar con la punta de la pipeta. Deje reposar durante aproximadamente 1 min. </li><li> Use pinzas para colocar la sección del cubo agar boca abajo en un ~ 55 mm con fondo de cristal plato n º 0 y presione ligeramente hacia abajo. </li><li> Visualización: <ol class="lroman"><li> Ver i-iii en la Secciónion 4. </li><li> Set coordina por 2-4 puntos focales para cada cepa en función de la densidad de la cultura. </li><li> Ajuste la cámara al tomar fotografías con una Z-stack con el rango adecuado (- / + 15 m con un grosor de 0,5 a 1,0 micras slice) cada 5 minutos durante un período de 90 min. </li></ol></li></ol>

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

En este artículo la proteína modelo FFL-GFP se utilizó para demostrar que el disaggregase levadura, Hsp104 contribuye a la proteína re-solubilización y reparación. Los ensayos enzimáticos y microscopía interrogados diferencialmente el estado de la misma proteína sustrato para determinar la eficiencia y el rendimiento de replegamiento. Resultados de los ensayos de recuperación enzimáticos sugieren que no sólo es la recuperación máxima en la cepa mutante hsp104D ineficiente, pero la magnitud inicial...

En los seres humanos trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, y las enfermedades de Huntington se han relacionado con el mal plegamiento y la agregación de la proteína 10. Las células emplean chaperones moleculares para prevenir atrapamiento cinética de las proteínas celulares en las estructuras inactivas mal plegadas 6. Los acompañantes que participen en redes de interacción complejas dentro de la célula, pero no se conocen con exactitud cómo la suma de estas interacciones contribuye a proteostasis organismo. Uno de los principales chaperonas responsables de la mayoría de plegamiento de la proteína citosólica es la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de la familia 19. Se ha demostrado que en la pérdida de la levadura de Hsp70 disminuye la capacidad de doblar naciente de FFL heteróloga expresada y para replegar la proteína endógena, ornitina transcarbamilasa, in vivo 18, 7. La capacidad de analizar plegable con resolución de tiempo casi real, facilitará la comprensión de cómo los factores celulares cont adicionalribute a este proceso de Hsp70-dependiente. Además, plegado / replegamiento reacciones no puede ser completamente dependiente de estas proteínas que contribuyen, por lo que los ensayos deben ser lo suficientemente sensible como para detectar tanto los cambios grandes y pequeños en la cinética y la eficiencia. El disaggregase célula de levadura, Hsp104, juega un papel vital en la reparación de las proteínas mal plegadas agregados. Aunque Hsp104 homólogos han sido identificados en hongos y plantas, esta familia parece estar ausente en metazoos. Se ha propuesto que otras chaperonas tales como los de la familia Hsp110 realizan algunos de los conocidos Hsp104 actividades en mamíferos 16. Hsp104 es un +, complejo de proteínas hexameric AAA que funciona en la levadura de proteínas remodelación de agregados, que contribuyen a replegado y reparación 13. Hsp104, junto con la levadura Hsp70, ssa1, y la levadura Hsp40, Ydj1, se requiere para la recuperación de FLE desnaturalizado en células de levadura 5, 8. La pequeña proteína de choque térmico, Hsp26, también se ha demostrado que es Requirojo para la desagregación Hsp104 mediada OFF 2. FFL, es una proteína de dos dominios que se une el sustrato luciferina en el sitio activo y después de un cambio conformacional que requiere ATP y el oxígeno, descarboxila el sustrato liberando oxiluciferina, dióxido de carbono (CO 2), monofosfato de adenosina (AMP), y la luz 11, 9, 3. El sustrato disponible comercialmente FFL, D-luciferina, resulta en la emisión de luz entre 550-570 nm que pueden ser detectados usando un luminómetro 15. FLE es exquisitamente sensible a la desnaturalización de los tratamientos químicos o calor y agregados rápidamente al despliegue. Cuando se expone a temperaturas entre 39-45 ° C OFF se desarrolló reversible e inactivadas 12. Por el contrario, GFP y sus derivados son altamente resistentes a desplegamiento de la proteína tensiones 14. Por lo tanto, la fusión de estas dos proteínas permite OFF para funcionar como un resto experimentalmente lábil capaz de dirigirse funcional TFP a intracelular de depósitos que se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia a la población y de los niveles de células individuales. Aplicación del ensayo enzimático en un lector de placas multimodo semi-automatizado junto con microscopía automatizada permite la evaluación simultánea sin precedentes de la cinética y el rendimiento de replegamiento reacciones. Además, la genética molecular fáciles del modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae permite tanto la manipulación precisa de la red de control de calidad de la proteína y la oportunidad para que los enfoques basados ​​en descubrimientos para identificar nuevos jugadores que contribuyen a la respuesta al estrés celular y proteostasis. En este estudio, las cepas de tipo salvaje (WT) y HSP104 eliminación expresan FFL-GFP están sujetos a la desnaturalización de proteínas de choque térmico. FFL-GFP replegamiento se controla a través tanto de un ensayo enzimático y microscopía como una lectura de proxy para la reparación del proteoma expresado sobre un curso de tiempo de recuperación. En comparación con las células WT, mostramos ªsupresión cepa e Hsp104 es de ~ 60% menos eficientes en el replegamiento FFL-GFP, el apoyo a los hallazgos previos establecen un rol para Hsp104 en la reactivación de desnaturalizado OFF 2.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Synergy MX Microplate Reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td>
 <td>Olympus, Tokyo Japan</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td>
 <td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP152-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(LiAc) Lithium Acetate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L6883</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG (polyethelene glycol)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP233-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP120-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Malinckrodt</td>
 <td>4948</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1300-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SC-URA</td>
 <td>Sunrise</td>
 <td>1306-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cycloheximide</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>357420050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-luciferin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>low melt agarose</td>
 <td>NuSieve</td>
 <td>50082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>immersion oil</td>
 <td>Cargille</td>
 <td>16484</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

coupled assays for monitoring protein refolding in saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, definida como los procesos combinados de plegamiento de proteínas / biogénesis, replegado / reparación, y la degradación, es un delicado equilibrio celular que se debe mantener para evitar consecuencias perjudiciales 1. Factores externos o internos que perturban este equilibrio puede conducir a la agregación de la proteína, la toxicidad y la muerte celular. En los seres humanos esto es un factor importante que contribuye a los síntomas asociados con los trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Huntington, Parkinson, y las enfermedades de Alzheimer 10. Por lo tanto, es esencial que las proteínas implicadas en el mantenimiento de proteostasis ser identificados con el fin de desarrollar los tratamientos para estas enfermedades debilitantes. Este artículo describe las técnicas para el seguimiento en el plegamiento de proteínas in vivo a una resolución de tiempo casi real utilizando el modelo de proteína luciferasa de luciérnaga fusionado a la proteína fluorescente verde (FFL-GFP). FFL-GFP es una proteína quimérica modelo único como resto de FFL es extremadamente sensible a la tensión inducida por misfolding y la agregación, que inactiva la enzima 12. La actividad de luciferasa se controló usando un ensayo enzimático, y el resto de GFP proporciona un método de visualización de FFL soluble o agregada mediante microscopía automatizada. Estos métodos acoplados incorporan dos enfoques paralelos y técnicamente independiente para analizar tanto replegamiento y la reactivación funcional de una enzima después de estrés. Recuperación de la actividad se puede correlacionar directamente con la cinética de desagregación y de re-solubilización para comprender mejor cómo los factores de control de calidad de proteínas, tales como chaperones de la proteína colaboran para llevar a cabo estas funciones. Además, las supresiones de genes o mutaciones se pueden usar para probar las contribuciones de proteínas específicas o subunidades de proteínas a este proceso. En este artículo se reflexiona sobre las aportaciones de la proteína disaggregase Hsp104 13, conocido por colaborar con el factor de cambio Hsp40/70/nucleotide (NEF) Sistema 5 replegado, con el replegamiento de proteínas para validar este enfoque.

La levadura es dependiente de la disaggregase, Hsp104 se repliegue de manera eficiente las proteínas desnaturalizadas por el calor. La actividad de FFL-GFP se controló después de un choque 25 min calor, utilizando un ensayo de luminiscencia flash de la Figura 1. Los resultados de este ensayo automatizado se muestra en la Figura 2 revelaron un aumento gradual en la actividad de más de 90 min que finalmente condujo a una recuperación&gt; 80% en las células WT. La cepa hsp104Δ</...

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Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Este artículo describe el uso de una proteína de fusión luciferasa de luciérnaga-GFP para investigar<em&gt; In vivo</em&gt; Plegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. El uso de este reactivo, el replegamiento de un modelo de proteína desnaturalizada con calor puede ser controlada simultáneamente por microscopía de fluorescencia y un ensayo enzimático para investigar las funciones de los componentes de la red Proteostasis en el control de calidad de la proteína.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

10.2K vistas.  University of Texas Medical School. Este artículo describe el uso de una proteína de fusión luciferasa de luciérnaga-GFP para investigar In vivo Plegamiento de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. El uso de este reactivo, el replegamiento de un modelo de proteína desnaturalizada con calor puede ser controlada simultáneamente por microscopía de fluorescencia y un ensayo enzimático para investigar las funciones de los componentes de la red Proteostasis en el control de...

Video: Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em