نشكر موظفي AniCan (CRCL، ليون) للحصول على المساعدة الفنية مع رعاية الحيوان. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للسانتيه إت دي لا بحوث ميديكال (برنامج أفينير INSERM)، الرابطة الوطنية من كونتر جنيه السرطان، من قبل الرابطة من أجل الديمقراطية بحوث السرطان سور جنيه، من قبل المعهد الوطني للسرطان، وزمالة من الرابطة الوطنية من كونتر جنيه السرطان (JG)، من المعهد الوطني للسرطان (JG)، من MINISTÈRE DE L&#39;ENSEIGNEMENT العالي للبحوث وآخرون دي لا من فرنسا (RMP وDFV) ومن جمعية من أجل الديمقراطية بحوث سور جنيه السرطان ( DFV).

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات تحت التنظيمية للسلطة الحكومية (&quot;Comité D&#39;التقييم COMMUN الاتحاد الافريقي ليون بيرار مركز، à L&#39;Animalerie دي العبور DE L&#39;ENS، والاتحاد الافريقي وآخرون PBES الاتحاد الافريقي مختبر P4&quot; (CECCAPP)). واستمرت الفئران في منشأة معينة خالية من مسببات الأمراض الحيوانية في &quot;Plateforme AniCan، مركز ليون بيرار&quot; (ليون، فرنسا) والتعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. ويرد التمثيل التخطيطي الإجراء في الشكل 1. 1. تشريح البنكرياس وتفتيت (يوم 0) A تشريح السريع جدا هو أمر حاسم لعائد الأمثل لاستخراج ولتأمين استمرارية جيدة من الخلايا في الثقافة. من أجل تقليل الوقت اللازم لعزل البنكرياس، يجب على جميع الأجهزة و المعدات لتكون جاهزة قبل القتل الرحيم الماوس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><html> الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق أو خلع عنق الرحم. </li></ol> من هذه الخطوة، وجميع الإجراءات يجب أن تؤديها في إطار جو معقم (الميكروبيولوجية مجلس الوزراء السلامة، من المستوى الثاني) مع معدات تشريح العقيمة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الماوس ورش البطن الفأر مع الايثانول 70٪. مع أي مقص تشريح وملقط، وجعل شق على شكل حرف V في المنطقة التناسلية وتستمر ليصل إلى الحجاب الحاجز لفتح تماما تجويف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع فصوص الكبد ضد الحجاب الحاجز، بل ينبغي أن تظل هناك إذا تجويف الجسم مفتوح بعيدا بما فيه الكفاية. سحب الأمعاء والقولون خارج تجويف البطن إلى يسارك، والعثور على المستقيم. مع زوج من ملقط المنحني وتشريح مقص، والاستيلاء على القسم المستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع نفس زوج من ملقط، انبسط بعناية تماما الأمعاء من المستقيم إلى المعدة عن طريق سحب الأمعاء على يسارك. </li></ol>الأنف والحنجرة &quot;&gt; في هذه الخطوة، ويمكن التمييز بين البنكرياس وشريط صغير بين المعدة وبداية الامعاء. عملية ربط لها مع الطحال لا تزال سليمة. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص نويس وزوج من ملقط، وقطع بعناية البنكرياس على طول الأمعاء وتحريرها مع الطحال من بقية الجهاز الهضمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على الطحال والبنكرياس قسم مرفقة به (الشكل 2). </li></ol> في هذه الخطوة، تأكد من أن لا الأنسجة الدهنية المساريقي و / أو الأنسجة المجاورة الأخرى (الطحال والأمعاء، إلخ) يمكن جمعها مع البنكرياس، لتجنب التلوث الخلوية. لبقية الإجراء، يجب أن يكون مستعدا جميع مخازن الكالسيوم دون أيون الكالسيوم 2 + chelators لتجنب التفكك الكامل للأنسجة البنكرياس الإفرازية في خلايا عنيبية واحد. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف البنكرياس مرتين في محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) 1X. </li></ol> في هذه الخطوة، سوف تطفو والأنسجة الدهنية على عكس البنكرياس التي من شأنها أن تغرق، فمن الممكن بسهولة لتصور وبسرعة ازالة الملوثات أبيض الأنسجة الدهنية لا تزال تعلق على البنكرياس. إذا يحتاج البنكرياس ليتم نقلها إلى مرفق خلية ثقافة، يجب أن يوضع على الجليد في HBSS 1X. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البنكرياس في طبق بتري معقمة تحتوي على 5 مل من HBSS 1X. باستخدام مقص نويس ومشرط، شريحة البنكرياس في قطع صغيرة من 1-3 مم 3 (الشكل 3A). </li></ol> 2. Dissociations الأنزيمية والميكانيكية للبنكرياس (يوم 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقلها إلى العقيمة 50 مل أنبوب البولي بروبلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 450 XG و 4 ° C. نضح وتجاهل طاف لإزالة شظايا الخلية وخلايا الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من كولاجيناز حل IA (HBSS 1X تحتوي على 10 ملي HEPES، 200 U / مل من collagenaSE IA، و 0.25 ملغ / مل من التربسين المانع) إلى أقسام البنكرياس. باستخدام 25 مل ماصة المصلية، نقلها إلى 25 سم 2 قارورة. احتضان لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. خلال هذا الوقت (كل 5 دقائق)، إجراء تفارق الميكانيكية عن طريق تحريك بقوة ذهابا وإيابا شظايا البنكرياس حوالي عشر مرات، في ماصات معقمة من تناقص حجمها (25، 10، و 5 ماصات المصلية مل). </li></ol> في هذه الخطوة، فمن الضروري لرصد كثير من الأحيان مدى تفارق الأنزيمية من أقسام البنكرياس. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يبدو أن نسيج البنكرياس ليكون جيدا فصلها (وفقا لاختفاء أجزاء البنكرياس وزيادة العكارة من الحل) (الشكل 3B)، ووقف رد الفعل الأنزيمية وذلك بإضافة 10 مل من البرد مخزنة غسل حل (HBSS 1X تحتوي على 5 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10 HEPES ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويلها إلى العقيمة 50 مل أنبوب البولي بروبلين والمركifuge لمدة 2 دقيقة في 450 XG و 4 ° C. نضح بعناية وتجاهل طاف لإزالة الحل IA كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وغسل بيليه مع 10 مل من محلول الغسيل مخزنة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 450 XG و 4 ° C. نضح بعناية وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. </li></ol> 3. الترشيح والبذر من تفرقوا عنيبات ​​(يوم 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه الخلية في 7 مل من المتوسط ​​Waymouth التي تحتوي على FBS 2.5٪، 1٪ البنسلين، الستربتوميسين خليط (PS)، 0.25 ملغ / مل من التربسين المانع، و 25 نانوغرام / مل من المؤتلف عامل نمو البشرة الإنسان (صندوق تعديل العولمة الأوروبي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رشح الخليط الخلية عن طريق السماح لها بالمرور من خلال 100 ميكرون مرشح للاحتفاظ شظايا غير المهضوم (القنوات، والأوعية الدموية، وانجرهانز الجزر). هياكل عنيبي البنكرياس (عنيبة من 10-15 الخلايا) بالمرور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف تصفية مع 6 مل من المتوسط ​​تحتوي على FBS Waymouth، وتبسيط العمليات، والتربسين INHibitor، وصندوق تعديل العولمة الأوروبي. </li></ol> بعد هذه الخطوة، فإن الخلايا يجب أن تعامل بعناية فائقة، لتجنب أي عنيبات ​​التفكك. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور عنيبات ​​معزولة في طبق ثقافة 6 جيدا (2 مل لكل بئر) (الشكل 3C). ثقافة لهم عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ (V / V) CO 2 الغلاف الجوي. </li></ol> بعد هذه الخطوة، يتم استزراع الخلايا عنيبي في التعليق. 4. عنيبي خلية ثقافة (اليوم 1-10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أربع وعشرين ساعة، ونقل عنيبات ​​(في التعليق) في طبق ثقافة جديدة 6 جيدا، للقضاء على الخلايا الملوثة وبقايا الخلوية التي انضمت ليلة وضحاها (الشكل 4). </li></ol> إذا احتاج ثقافة الخلية إلى أن تمتد لعدة أيام أو إذا اقتضت الظروف التجريبية الخلايا المزروعة في أحادي الطبقة، فمن المستحسن لنقل والبذور عنيبات ​​على السقالات المصفوفة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم ونرىقرع على دعم مصفوفة (يوم 0)، ومعطف طبق ثقافة 6 جيدا مع النوع الأول من الكولاجين (5 ميكروغرام / سم 2). إضافة 1 مل من النوع الأول حل الكولاجين (50 ميكروغرام / مل في 0.02 M حمض الخليك، 0.2 ميكرون تصفية) إلى كل بئر والسماح لها كثف بشكل سلبي على البلاستيك، خلال 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح نوع أنا الكولاجين الحل وشطف مرتين المغلفة بشكل جيد مع الفوسفات مخزنة المالحة 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح المغلفة جيدا لتجف (في إطار مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية) لا يقل عن 12 ساعة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عنيبات ​​الأولية المعزولة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.1) في النوع الأول من الكولاجين المغلفة طبق ثقافة 6 جيدا وثقافة لهم في نفس الظروف كما هو موضح سابقا (عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ (V / V) CO 2 الغلاف الجوي) . الخلايا التمسك النوع الأول الركيزة الكولاجين لمدة 2 ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3، وتغيير ثقافة المتوسط ​​للقضاء على الخلايا غير قابلة للحياة التي لم تنضم. مع الوقت في الثقافة، فإن الخلايا SP تدريجياقراءة على الدعم المحتوية على الكولاجين. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام (الشكل 5). </li></ol> الخلايا عنيبي المعزولة التي تم الحصول عليها يمكن عدها، بعد التفكك الميكانيكية كاملة باستخدام خلية العد غرفة توما. لاحظ أن الخلايا عنيبي معزولة لا يمكن الحفاظ عليها في ثقافة بعد ذلك. يمكن التحكم في نوعية الثقافة عنيبي الحصول عليها عن طريق التحقق من التعبير عن علامات محددة عنيبي مثل مولد التريبسين والبنكرياس عامل النسخ 1 الوحيدات ألفا، أو A1 كربوكسي ببتيداز (بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية أو التجارب المناعي).

<ol>
	<li>Lardon, J., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaplasia+in+the+pancreas.">Metaplasia in the pancreas.</a> Differentiation. 73, 278-286 (2005).</li><li>Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retention+of+zymogen+granules+in+cultured+murine+pancreatic+acinar+cells+and+induction+of+acinar-ductal+transdifferentiation+in+vitro.">Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro.</a> Pancreas. 30, 148-157 (2005).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+I.+Dissociation+technique+and+morphologic+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+II.+Functional+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).</li><li>Schultz, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guinea+pig+pancreatic+acini+prepared+with+purified+collagenase.">Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase.</a> Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+binding+and+biologic+effects+on+mouse+pancreatic+acini.">Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).</li><li>Han, B., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+induction+of+mob-1+chemokine+expression+in+pancreatic+acinar+cells+requires+NF-kappaB+activation.">Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation.</a> Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).</li><li>Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+between+rat+and+mouse+CCKA+receptors+determine+the+divergent+acinar+cell+response+to+the+cholecystokinin+analog+JMV-180.">Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180.</a> J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).</li><li>Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+induces+expression+of+cytokine-induced+SH2+protein+(CIS)+in+rat+brain+astrocytes:+involvement+of+phospholipase+A2,+cyclooxygenase,+and+lipoxygenase.">Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase.</a> Glia. 48, 102-111 (2004).</li><li>Gaiser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activation+of+trypsinogen+in+transgenic+mice+induces+acute+but+not+chronic+pancreatitis.">Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis.</a> Gut. 60, 1379-1388 (2011).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+acinar+cells+in+monolayer+culture:+direct+trophic+effects+of+caerulein+in+vitro.">Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro.</a> Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).</li><li>Stanger, B. Z., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+cellular+origins+of+pancreatic+cancer.">Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer.</a> Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tif1gamma+suppresses+murine+pancreatic+tumoral+transformation+by+a+smad4-independent+pathway.">Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway.</a> Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+TIF1gamma+cooperates+with+Kras+to+induce+cystic+tumors+of+the+pancreas.">Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas.</a> PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+pancreatic+alpha,+beta,+duct+and+acinar+populations+with+cell+surface+markers.">Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers.</a> Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).</li><li>Case, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+intracellular+transport+and+discharge+of+exportable+proteins+in+the+pancreatic+acinar+cell+and+other+cells.">Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف الإجراء لعزل خلايا البنكرياس عنيبية. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لعزل أكثر من 20 × 10 6 خلايا عنيبية لكل حيوان في أقل من 1 ساعة. بفضل التنفيذ السريع وبسيط والخمسين (ما يصل الى 10 البنكرياس يمكن معالجتها بشكل مستقل في التجربة بالتوازي)، يظهر...

وثمة مشكلة واجهت كثير من الأحيان لمختبرات البحوث تعمل على أنسجة البنكرياس الإفرازية هو صعوبة زراعة خلايا عنيبية في المختبر لفترة من الزمن طويلة بما فيه الكفاية للسماح لتجربة طويلة الأجل. أحد العوامل التي تعوق تطوير نظم الاستزراع هذه هي حساسية لا يتجزأ من نسيج البنكرياس للتلاعب التجريبية ويرجع ذلك إلى نسبة عالية في الانزيمات حال السكر، بروتين، دهون و، الذي هضم حرفيا نسيج البنكرياس عندما يتم اطلاق سراحهم خلال عزل خلايا البنكرياس. والعامل الثاني هو ملحوظ في اللدونة المختبر من خلايا عنيبية، والتي تميل الى فقدان الخصائص الإفرازية وtransdifferentiate إلى الخلايا الناضجة الأخرى، مثل خلايا البنكرياس القنوي أو الخلايا الكبدية، مثل 1. في المختبر، هذه اللدونة الخلية يختلف مع الظروف التجريبية (مثل ثقافة تكوين متوسطة) 2 </سوب&gt; ويدخل على درجة من التعقيد في تصميم الظروف الملائمة لزراعة خلايا البنكرياس الإفرازية 1. وقد وضعت عدة طرق للعزلة وثقافة من الخلايا عنيبي، أول من خنزير غينيا 3-5 البنكرياس. في البداية، تلك البروتوكولات المعنية هضم أنسجة البنكرياس مع كولاجيناز، كيموتربسين، وكوكتيل البروتيني، مع العزلة في نهاية المطاف من قبل تفارق الميكانيكية قوية. خلايا البنكرياس معزولة بهذه الطريقة عرض الخصائص الهيكلية والوظيفية غير طبيعي، لا سيما فقدان الهياكل قمية وأضرار كبيرة لمستقبلات الغشاء. ظلت الخلايا المعزولة قابلة للحياة فقط 1 أو 2 أيام. فرقت إعداد يحافظ عنيبات ​​داخل وبين الخلايا الهندسة المعمارية الخاصة بهم، والحفاظ على أغشية الخلايا، مما يحد من الأضرار التي لحقت المستقبلات السطحية، وبالتالي تحسين إفراز إفرازات ردا على secretagogues 6-8. باعتبارها دورة الفتشوبLT، وهذه الطريقة توفر الميزة الرئيسية لتمديد عنيبي بقاء الخلية إلى 7-10 أيام في المختبر. وعلاوة على ذلك، ويفضل هذا الأسلوب حاليا إلى العزلة خلية عنيبية 9-12 لأن صيانة من الاتصالات بين الخلايا، بما في ذلك اقتران الخلية عن طريق تقاطعات الفجوة، هو من العوامل الأساسية لإفرازات البنكرياس عنيبية الخلية النمط الظاهري 13. كما فقد التمايز للخلايا عنيبية وtransdifferentiation على خلايا الأقنية هي واحدة من الآليات المقترحة لنشأة العدوانية سرطانات البنكرياس الإفرازية 14، وعنيبات ​​نموذج فرقت هو أيضا نظام ملائم لدراسة اللدونة البنكرياس وآلياته الجزيئية لاحقة. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا 15،16 وتطوير تقنيات نقل الجينات (الغدانية 2 أو تنبيغ lentiviral، واستخدام الجسيمات النانوية، الخ)، وهذا في المختبر نموذج خلية عنيبية الأولية يمكن أنأن تكون مفيدة جدا في تحديد كيفية تأثير مختلف الاختلالات الجينية تنظيم عنيبي تمايز الخلايا أو فقد التمايز وينبغي توفير فهم أفضل للأحداث الجزيئية المسؤولة عن ظهور التهاب البنكرياس، الآفات السابقة للتسرطن، والتغيرات في اللدونة الخلية. عزل فرقت عنيبات ​​هو النهج التي نستخدمها في مختبرنا لخلايا البنكرياس عنيبية الثقافة. نحن هنا وصف ومناقشة الطريقة المستخدمة. أنها تنطوي تفارق الأنزيمية من نسيج البنكرياس (مع كولاجيناز البكتيرية) بالإضافة إلى اضطراب الميكانيكية دون تفكك خلايا عنيبية. في حين أن معظم بروتوكولات تشمل استزراع عنيبات، سواء في التعليق أو على ركائز من البلاستيك معاملة خاصة، ونحن تنمو لهم في التعليق لفترة وجيزة فقط (لمدة 24 ساعة)، بذر منهم بعد ذلك على السقالات مصفوفة إذا كان المطلوب زراعة الخلايا لفترات طويلة. هذا البروتوكول يسمح العزلة السريع (في أقل من 1 ساعة) من فرقت البنكرياس ACINI ومستدامة لمدة أسبوع واحد أو أكثر في الثقافة. لأنها تتيح عزل أكثر من 20 × 10 6 خلايا البنكرياس عنيبية في الماوس. بساطته يجعل من الممكن لمعالجة بشكل مستقل ما يصل الى 10 البنكرياس في نفس الوقت. عن طريق الحفاظ على الهندسة المعمارية داخل وبين الخلايا من عنيبات ​​وبالتالي النمط الظاهري عنيبي من الخلايا الأولية معزولة، وهذا النموذج يشكل النظام خيارا بالنسبة للدراسة آليات transdifferentiation، كما تستمد جميع الموديلات البنكرياس الإفرازية الأخرى المتاحة حاليا من أورام البنكرياس عرض الوراثية العديد من التعديلات التي تؤدي إلى التحول الخلوي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.2 &mu;m filter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>146560</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 &mu;m filter</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1000 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>20 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-1810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>200 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357535</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml polypropylene tube</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic acid 100%</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2676</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Curved forceps, Dumont #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14188</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting scissors, straight</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epidermal Growth Factor, human</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>C-60180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol absolute (AnalaR Normapur)</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-801F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumont #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14098</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hank's Balanced Salt Solution 1x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator O2/CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-19M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet, level II</td>
			<td>Faster</td>
			<td>SafeFast Elite 212 S</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Noyes scissors, sharp/sharp tips, German</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500228-G</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount Surgimed Ltd.</td>
			<td>Disposable Scalpel Size 23</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T25 flask, 25 cm2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707481</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin inhibitor, from Glycine Max</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Waymouth's medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31220-023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells

يسمح هذا البروتوكول العزلة السريع (في أقل من 1 ساعة) من عنيبات ​​البنكرياس الفئران، مما يجعل من الممكن للحفاظ عليها في الثقافة لمدة أسبوع واحد أو أكثر. ويمكن الحصول على أكثر من 20 × 10 6 خلايا البنكرياس عنيبية من الفئران واحدة. يوفر هذا البروتوكول إمكانية لمعالجة بشكل مستقل ما يصل الى 10 البنكرياس في نفس الوقت. لأنه يحفظ العمارة عنيبي، وهذا نموذج مناسبة تماما لدراسة علم وظائف الأعضاء من إفرازات البنكرياس في المختبر وعلى النقيض من خطوط الخلايا التي أنشئت من أورام البنكرياس، والذي عرض العديد من التعديلات الوراثية مما يؤدي إلى فقدان جزئي أو كلي للتمايز عنيبي بهم.

الشكل 1 schematizes على &quot;فرقت&quot; طريقة عنيبات ​​للتعليم الابتدائي عنيبي زنازين العزل. يتم وصف الخطوات الحاسمة التي يجب أن تحترم بدقة خلال البروتوكول، في جزء المناقشة. لتسهيل زواله، البنكرياس لابد من جمعها من البطن جنبا إل...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

في هذا المنشور، نحن تصف الإجراء السريع ومريحة للعزل وزراعة الخلايا الأولية عنيبي البنكرياس من البنكرياس الفئران. يشكل هذا الأسلوب نهجا قيما لدراسة علم وظائف الأعضاء من خلايا البنكرياس الطازجة الأولية العادي / هو دون تغيير إفرازات.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

isolation-and-culture-of-mouse-primary-pancreatic-acinar-cells

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Views.  Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon.  في هذا المنشور، نحن تصف الإجراء السريع ومريحة للعزل وزراعة الخلايا الأولية عنيبي البنكرياس من البنكرياس الفئران. يشكل هذا الأسلوب نهجا قيما لدراسة علم وظائف الأعضاء من خلايا البنكرياس الطازجة الأولية العادي / هو دون تغيير إفرازات. 

Video: Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

تقييم القدرة الإفرازية للخلايا البنكرياس عنيبية

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

عزل وثقافة الكريات الكيراتينية الفموية الأولية من الحنك الفأري البالغ

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...