يسمح لنا هذا البروتوكول بعزل مجموعات الخلايا الليفية المنشطة التي تسببها الإصابة مع نقاء كبير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي مرونته للارتجال. لتدفق، فضلا عن العزلة القائمة على حبة، يمكن للمرء أن دمج الأجسام المضادة ضد الخلايا الملوثة لاستبعادها من الخلايا المستهدفة المعزولة.
وتستخدم هذه التقنية في المقام الأول لعزل الخلايا الليفية القلبية. ومع ذلك، يمكن استخدامه لعزل الخلايا الليفية من الأنسجة الأخرى. إثبات هذا الإجراء سيكون ميلينغ ميلتزر، متدرب جامعي، وديفيد بيير، مساعد باحث من مختبري.
لإعداد لوحة ستة بئر لتخزين ستة قلوب أثناء التشريح ، الاستغناء عن مليلترين من KHB البارد في كل بئر ، ووضع الطبق على الجليد. رش الجسم مع 70٪ الإيثانول. توجيه ذلك حتى الجانب البطني تواجه المجرب.
قم بزِل الزوائد لمنع التداخل. دون ثقب الكبد، وقطع فتح الجلد البطن والعضلات. قطع عموديا نحو القص، وفتح الصدر بعناية دون ثقب القلب.
بعد ذلك، استمر في قطع القفص الصدري لفضح القلب. باستخدام ملقط، رفع بلطف القلب من الصدر، وقطع أي الرئة أو الأنسجة الزائدة تعلق على خارج القلب. فصل البطين الأيسر.
لكل تشريح، ضع البطين في بئر منفصل من لوحة ستة آبار. أولاً، استخدم ملقط للضغط على البطين في KHB بشكل متكرر وتهيجه له. نقل البطين إلى نظيفة، معقمة، لوحة 10 سم مربع.
بعد ذلك، باستخدام شفرة ذات حدين، سرعان ما ينفر البطين إلى قطع صغيرة. إضافة ملليلتر واحد من كوكتيل الهضم collagenase، ومواصلة mincing. عندما تكون القطع صغيرة بما يكفي لنقلها مع ميكروبيبت ميليلتر واحد، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
اغسل الطبق مرتين مع ميليتين من الكوكتيل، ونقل الغسيل إلى الأنبوب. احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة، وإعادة تعليق الخلايا كما هو موضح في المخطوطة باستخدام ماصة خمسة ملليلتر. بعد إعادةpenpension الأولي، احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة، وإعادة تعليق مرة أخرى باستخدام ماصة 10 ملليلتر.
ثم، ضع مصفاة خلايا 40 ميكرومتر على رأس أنبوب مخروطي جديد يبلغ 50 ملليلتر، وقم بتميّز المصفاة عن طريق تبليلها بميليلتر إلى ملليلتر من KHB. إضافة 25 ملليلتر من KHB إلى تعليق الهضم، و resuspend. تصفية التعليق من خلال مصفاة، واستبدال مصفاة حسب الحاجة.
الطرد المركزي الترشيح في 400 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant، وإعادة فرض بيليه في 1x RBC تحلل العازلة باستخدام خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت في القلب. بعد احتضان التعليق لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي تعليق في 400 مرات ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
إزالة ناظر، ومن ثم إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من KHB. ثم، إضافة تسعة ملليلتر من KHB إلى التعليق. تصفية التعليق من خلال مصفاة خلية تستعد، 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد، 50 ملليلتر.
الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 400 مرة ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، إزالة نافع، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الليفية أو برنامج تلفزيوني. بعد تحديد رقم الخلية، يمكن عزل الخلايا الليفية عن التعليق بثلاث طرق مختلفة موصوفة في المخطوطة.
لبدء العزلة عن طريق الطلاء التفاضلي، وإعداد لوحة ستة جيدا عن طريق إضافة مليلترين من الوسائط الليفية إلى كل بئر. دوامة لوحة لتغطية قيعان البئر. إذا علقت خلايا القلب الماوس في برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي وإعادة تعليقها في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الليفية في القلب.
إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية، أي ما يعادل قلب واحد، إلى كل بئر. دوامة لوحة لتوزيع الخلايا بالتساوي. إضافة واحد إلى ملليلتر إضافية من الوسائط الليفية في بئر لحجم إجمالي يصل إلى أربعة ملليلتر في البئر.
احتضان في 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. لأن الخلايا الليفية سوف تلتزم انتقائيا إلى الآبار، فإنها يمكن أن تكون معزولة عن طريق إزالة وتجاهل وسائل الإعلام. غسل الخلايا المرفقة المتبقية مع مليلترين من برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 2-4 ملليلتر من الوسائط الليفية العقيمة في بئر.
احتضان في 37 درجة حتى التقاء، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى أربعة أيام. لبدء وضع العلامات المغناطيسية وفصل خلايا الدم CD45 إيجابية، الطرد المركزي تعليق خلايا القلب الماوس في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant، وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من العازلة التوازن.
عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. بعد الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى، resuspend بيليه الخلية في العازلة التوازن. إضافة CD45-إيجابية الخرز المغناطيسي، واخلط جيدا.
احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا بإضافة العازلة التوازنية وrifuging في 500 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة فائقة، وعد الخلايا باستخدام مقياس قياس الهيموسيت.
إعادة تعليق بيليه في العازلة التوازن. مرر التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر لمنع تجميعات الخلايا من انسداد عمود الفصل. بعد ذلك، ضع عمود فصل في المجال المغناطيسي للفاصل المناسب، وتكفّل العمود بثلاثة ملليلترات على الأقل من برنامج تلفزيوني.
صب تعليق الخلية من خلال العمود، وجمع تدفق من خلال، والتي سوف تحتوي على الخلايا غير التي تحمل علامة، في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. اغسل العمود ثلاث مرات بثلاثة ملليلترات من العازلة التوازنية، والجمع بين يغسل مع تدفق من خلال. قم بإزالة العمود من الفاصل، ووضع العمود على أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
ل elute الخلايا CD45 - الإيجابية المسماة، ماصة خمسة ملليلتر من العازلة التوازن في العمود، وتغرق العمود بحزم. جهاز طرد مركزي أنبوب من الوينت وأنبوب من خلال تدفق في 500 مرات ز. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت.
لإكمال العزلة، اتبع البروتوكولات الموجودة في المخطوطة الخاصة بالخلايا البطانية 55 CD31 والخلايا الليفية الإيجابية MEFSK4، والتي تشبه البروتوكول لخلايا CD45 الإيجابية. تم إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلور على خلايا مفردة معزولة عن قلوب الماوس ألفا-SMA-GFP بعد احتشاء عضلة القلب. يوضح مخطط البوابات التمثيلية الخلايا الإيجابية GFP التعبير المشترك عن CD31 أو CD45 أو AN2.
في قلوب الفئران المصابة، عبّرت نسبة صغيرة من الخلايا البطانية والخلايا الـدمية عن GFP. ومع ذلك، لم GFP إيجابية/CD31-سالبة CD45-الخلايا السلبية لا تعبر عن AN2، علامة pericyte. GFP إيجابية الخلايا أعرب ألفا-SMA, الكولاجين واحد ألفا واحد, periostin, وفيمينتين.
غير المصابين الخلايا الليفية المعزولة بالتصاق انتقائية أعرب vimentin ولكن لم تثبت التعبير عن ألفا-SMA, periostin, أو الكولاجين واحد ألفا واحد. أعرب كل من الخلايا الليفية غير المصابة والمفعّلة عن مستضد MEFSK4. أظهرت كل من الخلايا الليفية غير المصابة ، المعزولة بالتصاق انتقائي ، والأبلوستات العضلية ، المعزولة والمفرزة من فئران ألفا-SMA-GFP، القدرة على التعاقد على الكولاجين.
من المهم أن ينم الأنسجة جيدا قبل الحضانة. قبل فصل القائمة على حبة، من المهم لتمرير التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر لمنع تجمعات الخلايا. ويمكن تنقية الخلايا التي يتم تنقيتها من خلال هذه الطريقة باستخدام الخرز المغناطيسي المرتبطة الأجسام المضادة لل beicyte محددة لضمان مستوى عال من النقاء.
مع توافر الأجسام المضادة الجديدة الخرزة المقترنة ، وكذلك الفئران المعدلة وراثيا مراسل ، يمكن للمرء أن استخدام هذه التقنيات لعزل ودراسة مجموعات الخلايا المختلفة ، وليس فقط الخلايا الليفية.
