معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة JSO روث L. كيرشتاين NRSA (F32 DK091040)، معتمد من قبل AK زمالة ما بعد الدكتوراه من جمعية السكري الأمريكية (7-10-MI-05)، ومعتمد من قبل آه جمعية القلب الأمريكية تأسست جائزة الباحث (12EIA8270000). وقد أجريت تجارب التدفق الخلوي في التدفق الخلوي VMC مورد مشترك. يتم اعتماد التدفق الخلوي VMC مورد مشترك من قبل الجهاز الهضمي مركز بحوث أمراض فاندربيلت (DK058404).

1. الكواشف واللوازم قبل الشروع في هذا البروتوكول التجريبي، وإعداد الكواشف التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70٪ من الإيثانول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) تستكمل مع 0.5٪ BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS العازلة: 1X DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم)، 2 مم EDTA، و 1٪ FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة ACK: 150 ملي NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 3، و 0.1 ملي نا 2 EDTA في الماء </li></ol> 2. الحصاد وإعداد الأنسجة الدهنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران وفقا للإجراءات التي وافق عليها IACUC الخاصة بكل مؤسسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبلل تماما الفراء مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق على مستوى عملية الخنجري (الجزء السفلي من عظمة القص) وفتح التجويف الصدري لفضح القلب، مع الحرص على عدم قطع أي الأوعية الدموية الرئيسية. </li></ol> ملاحظة: عند هذه النقطة، بل هو أيضا مفيدة لترك الحجاب الحاجز سليمة بقدر<html> ممكن وخفض خدش للخروج من الجانب الأيمن من القفص الصدري للسماح الدم وسائل الإرواء في التدفق من التجويف الصدري. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقطع الأذين الأيمن للسماح الدم وسائل الإرواء للهروب من نظام الدورة الدموية. </li></ol> ملاحظة: عندما يكون التعامل مع الفئران السمينة، التامور الزائدة AT قد تحتاج إلى إزالة للسماح بالوصول إلى القلب. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم القلب مع ملقط وإدراج بلطف إبرة في البطين الأيسر من خلال قمة. يروي ببطء الماوس مع 15 مل العقيمة PBS. </li></ol> ملاحظة: تخفيض معدل نضح إذا بدأت الرئتين لملء والتوسع. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح التجويف البريتوني وإزالة منصات الدهون perigonadal باستخدام الحرص على تجنب أي أنسجة الغدد التناسلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع منصات الدهون في وزن قارب على الجليد تحتوي على 2 مل 1X DPBS (بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم) تستكمل مع 0.5٪ BSA، واللحم المفروم في الدقيقة القطع الجميلة. </li></ol>الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; ملاحظة: الحد من كمية AT لكل وزن القارب إلى 1.2 غرام. اذا كان المبلغ من AT يتجاوز 1.2 غرام، تقسيمها بالتساوي بين اثنين من وزن القوارب. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على عينات من على الجليد وإعداد 3 مل كولاجيناز حل هضم في AT عينة تتكون من 1X DPBS تستكمل مع 0.5٪ BSA، 10 مم CaCl 2، و 4 ملغ / مل كولاجيناز، من النوع الثاني. </li></ol> 3. الهضم كولاجيناز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل AT إلى 50 مل أنابيب مخروطية بواسطة صب جناسة والشطف وزن القارب مع DPBS 1 مل (0.5٪ BSA) و 3 مل كولاجيناز الثاني حل هضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند جناسة في شاكر التناوب (200 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل DPBS (0.5٪ BSA) إلى أنابيب مخروطية ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن جناسة مرات عديدة باستخدام 10 مل ماصة المصلية، وتمرير الايقاف الخلية من خلال 100 ميكرون مرشح في لأنبوب جديد 50 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 والتطويرعلى سبيل المثال؛ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف و resuspend SVF الخلية بيليه في 3 مل العازلة ACK إلى ليز تلويث الكريات الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 مل FACS العازلة وتعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف و resuspend SVF بيليه الخلية في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة. </li></ol> ملاحظة: استخدام حجم الخلية بيليه كدليل لمدى FACS العازلة ل resuspend فيه. إذا كان يغطي الخلية بيليه الجزء السفلي من مل المخروطية أنبوب 50، استخدم 0.5-1 مل FACS العازلة، وإلا، في resuspend 0.25-0.5 مل. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان العينات على الجليد وإعداد مأخوذة تخفيف 01:10 من كل عينة لفرز الخلايا عن طريق خلط 40 ميكرولتر العازلة FACS، 50 ميكرولتر حل الأزرق التريبان (0.2٪)، و 10 ميكرولتر التعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد خلايا قابلة للحياة على أساس التريبان الأزرق الإقصاء وتمييع تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 5-10 × 10 6 خلية / مل. </li></ol> 4. تلطيخ المضادات سطح الخلية <oL&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف مكافحة فأر CD16/CD32 الأجسام المضادة (اف سي بلوك) إلى التركيز النهائي من 0.5-1 μg/10 6 خلايا، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات (≥ 10 6 خلايا) إلى 12 × 75 مم البوليسترين جولة أنابيب أسفل. إعداد أنابيب منفصلة إذا تحليل أجهزة الصراف الآلي وخلايا T، والجمع بين الخلايا الإضافية لإعداد عدد كاف من الأنابيب لاستيعاب التعويضات المطلوبة ومضان تعديل ناقص واحد (FMO) الضوابط. </li></ol> ملاحظة: وكمثال على ذلك، عندما سوف قياس نسبة من أجهزة الصراف الآلي على أساس F4/80 وCD11b، التعويضات التالية والضوابط FMO ابد أن نكون مستعدين: - غير ملوثين (خلايا) - دابي أو يوديد propidium (PI) وصمة عار واحد (الخلايا؛ لا تضيف صبغة جدوى حتى الخطوة 5.1) - F4/80 APC (خلايا أو الخرز التعويض) واحد وصمة عار - CD11b FITC الخلايا أو واحد وصمة عار (حبات التعويض) - FMO 1 (خلايا): الجرذ IgG2a κ نمط إسوي السيطرة APC + CD11b FITC + صبغ الجدوى (المضافة في الخطوة 5.1) - FMO 2 (خلايا): F4/80 APC + الجرذ و IgG2b κ نمط إسوي السيطرة FITC + صبغ الجدوى (المضافة في الخطوة 5.1) <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة الأولية fluorophore مترافق و / أو ضوابط نمط إسوي في التركيز المناسب (انظر الجدول من الكواشف والمواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حماية العينات من الضوء واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل FACS العازلة وتعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف و resuspend SVF الخلية بيليه في 2 مل FACS العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend بيليه خلية في صندوق التبرعات الخاص ≥ 400 FACS ميكرولتر العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى 12 × 75 مم البوليسترين أنابيب أسفل جولة مجهزة 35 ميكرومتر الخلية مصفاة قمم أنبوب.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحفظ بعيدا عن الضوء، وعينات تخزينها في 4 درجات مئوية حتى تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li></ol> ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ينبغي تحليل الخلايا immeadiately، ومع ذلك، تم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع هذا البروتوكول بنجاح على الخلايا المسمى المخزنة في نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة لمدة 1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية. إذا كان بحاجة إلى الخلايا لتكون ثابتة لزيادة وقت التخزين، ويمكن أن تكون ثابتة الخلايا المسمى مع بارافورمالدهيد 2٪ في 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة قبل التحليل FACS. الشركات الأجسام المضادة تشير إلى أن الخلايا المسمى يمكن تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد، ولكن هذا لم يتم اختباره في سياق هذا الإجراء. 5. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، إضافة إلى عينات صبغ الجدوى والضوابط المناسبة للسماح لايف / الميت تمييز الخلية. </li></ol> ملاحظة: تتوفر تجاريا العديد من الأصباغ جدوى، ولكن ينصح دابي وPI اعتمادا على الإثارة / الانبعاثات الأستاذديزيل من الأجسام المضادة، مترافق fluorophore المستخدمة. تضاف دابي ويوديد propidium إلى كل عينة في تركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عينة السيطرة السلبية غير ملوثين، ويفضل خلايا معزولة من نفس الأنسجة والعينات التجريبية، لضبط الجانب مبعثر (SSC) ومبعثر إلى الأمام (FSC) بحيث يتسنى للسكان الخلية (ق) من الفائدة هي على نطاق واسع. </li></ol> ملاحظة: بالنسبة لتحليل AT الخلايا صندوق التبرعات الخاص، فمن المستحسن أن SSC يتم عرضها في نطاق السجل مقابل FSC في مقياس خطي. استخدام نطاق وسجل لSSC أهمية خاصة عند تحليل أجهزة الصراف الآلي، والتي غالبا ما تكون كبيرة جدا ومحبب. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم ضوء بوابة مبعثر الأولي يعتمد على نوع الخلية (الخلايا) التي يجري تحليلها، وضبط أنبوب مضخم (PMT) مكسب بحيث الخلايا غير ملوثين هي في أقصى اليسار من الرسم البياني-معلمة واحدة (تركز على ما يقرب من 10 2) للقنوات المناسبة. &lt;/ لى&gt; </ol> ملاحظة: من المستحسن أن الخلايا الليمفاوية والضامة (أو خلايا الدم النخاعي أخرى) يتم تحليلها بشكل منفصل بسبب وجود خلافات في تألق ذاتي. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عناصر التحكم الملون واحد أو الضد التقاط حبات تعويضات لأداء التعويض متعددة الألوان. </li></ol> ملاحظة: من المستحسن استخدام الخرز التعويض، ولكن لا بد من ضمان التوافق من كل الأجسام المضادة. على سبيل المثال، والخرز التعويض قد لا عبر تتفاعل مع الأجسام المضادة أرنب، وفي هذه الحالة يطلب من خلايا منعزلة للحصول على سيطرة وصمة عار واحد المناسبة. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين غيتس التجريبي القائم على ضوابط FMO معدلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط تدفق عداد الكريات لجمع العدد المناسب من الأحداث على أساس انتشار السكان من الاهتمام وتسجيل البيانات التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير ملفات البيانات FCS للتحليل غير متصل. وهناك العديد من البرامج المتاحة لتدفق cytometrتحليل البيانات ذ. نوصي Cytobank، منصة على شبكة الإنترنت التي تسمح investigatores لتخزين وتحليل البيانات وتوليد الأرقام من أي جهاز كمبيوتر مع الوصول إلى الإنترنت 18. بالإضافة إلى ذلك، Cytobank يوفر القدرة على جعل الوصول إليها الجمهور البيانات أو تقييد الوصول إلى المتعاونين. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis.">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).</li><li>Danse, L. H., Verschuren, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+oil-induced+yellow+fat+disease+in+rats.+III.+Lipolysis+in+affected+adipose+tissue.">Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue.</a> Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).</li><li>Weisberg, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+is+associated+with+macrophage+accumulation+in+adipose+tissue.">Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+in+fat+plays+a+crucial+role+in+the+development+of+obesity-related+insulin+resistance.">Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).</li><li>Mathis, D., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunometabolism:+an+emerging+frontier.">Immunometabolism: an emerging frontier.</a> Nature Reviews. Immunology. 11, 81 (2011).</li><li>Stefanovic-Racic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+promote+macrophage+infiltration+and+comprise+a+substantial+proportion+of+obesity-associated+increases+in+CD11c++cells+in+adipose+tissue+and+liver.">Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver.</a> Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice.">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).</li><li>Feuerer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lean,+but+not+obese,+fat+is+enriched+for+a+unique+population+of+regulatory+T+cells+that+affect+metabolic+parameters.">Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters.</a> Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity.">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).</li><li>Winer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+obesity-associated+insulin+resistance+through+immunotherapy.">Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy.</a> Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).</li><li>Winer, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+insulin+resistance+through+modulation+of+T+cells+and+production+of+pathogenic+IgG+antibodies.">B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies.</a> Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+by+lipid+excess+promotes+tissue+inflammation,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice.">Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).</li><li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophils+sustain+adipose+alternatively+activated+macrophages+associated+with+glucose+homeostasis.">Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis.</a> Science. 332, 243-247 (2011).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).</li><li>Talukdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+mediate+insulin+resistance+in+mice+fed+a+high-fat+diet+through+secreted+elastase.">Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase.</a> Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).</li><li>Hagman, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+quantifying+leukocyte+populations+in+human+adipose+tissue:+impact+of+enzymatic+tissue+processing.">Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing.</a> Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).</li><li>Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+analysis+and+publication+of+flow+cytometry+experiments.">Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments.</a> Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).</li><li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+compensation+for+flow+cytometry:+visualization+artifacts,+limitations,+and+caveats.">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45, 194-205 (2001).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

وقد أدى الاهتمام المتزايد في دور الجهاز المناعي في العواقب الأيضية من السمنة إلى الاستخدام الواسع النطاق للالتدفق الخلوي لتحديد خصائص الخلايا المناعية من AT. على الرغم من أن بروتوكول الدقيقة تختلف بين المختبرات على أساس الخبرة الخاصة بهم والمعدات المتاحة، وتشمل الخ...

تاريخيا، كان ينظر إلى الأنسجة الدهنية (AT) كجهاز تخزين خاملة من الدهون، والذي يوسع والعقود ردا على توازن الطاقة. ونحن نفهم الآن أن AT يمثل جهازا الغدد الصماء التي تفرز ديناميكية بنشاط عدد من الهرمونات التي تؤثر تأثيرا مباشرا سلوك التغذية والنظامية توازن الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، على مدى العقد الماضي كان هناك تقدير متزايد لسكان العديد من الخلايا المناعية المقيمين في AT جزء الأوعية الدموية اللحمية (صندوق التبرعات الخاص)، فضلا عن مساهمتها في AT التوازن. القدرة على فصل AT خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص باستخدام هضم كولاجيناز تليها الطرد المركزي المغاير وقد وصفت لأول مرة في عام 1964 رودبيل 1. غالبا ما يتم استخدام كولاجيناز الثاني للفصل خلية شحمية وصندوق التبرعات الخاص بسبب الصيانة من مستقبلات الانسولين خلية شحمية 1. في وقت مبكر، وتجزيء الأنزيمية من AT كان يعمل في المقام الأول لدراسة الشحمcyte الأيض وعزل preadipocytes. وفي الآونة الأخيرة، وهذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع توافر نطاق واسع من أجهزة قياس التدفق الخلوي وعدد متزايد من المتاحة تجاريا الأجسام المضادة fluorophore مترافق، يسرت توصيف AT الخلايا المناعية. على الرغم من وجود الخلايا المناعية في التهاب AT وقد وصفت سابقا 2، وأوراق المنوية بواسطة يسبيرج وآخرون. وشو وآخرون. نشرت في عام 2003 كانت أول لتوثيق تراكم AT الضامة (الصراف الآلي) في السمنة، والتي تفرز السيتوكينات الالتهابية وترتبط مع المقاومة AT-محددة والنظامية الأنسولين 3،4. خدم هذه الملاحظات كأساس لحقل جديد من التحقيقات التي صيغت مؤخرا، &quot;immunometabolism،&quot; 5 و تم متابعتها من قبل دراسات تورط مختلف السكان الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا الجذعية 6، 7 الخلايا البدينة، الخلايا T 8 -10، خلايا B 11، خلايا NKT 12، 13 الحمضات، والعدلات 14،15 في تطوير البدانة ترتبط مقاومة الأنسولين. الهدف من هذه المقالة هو أن تقدم وصفا مفصلا لتقنية هضم كولاجيناز تستخدم لعزل خلايا AT صندوق التبرعات الخاص لتوصيف وأجهزة الصراف الآلي وAT خلايا T عن طريق التدفق الخلوي. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للماوس AT، ومع ذلك، يمكن أن تستفيد من المشاهدين قراءة مقال ممتاز تقديم تفاصيل مستفيضة حول الاستفادة المثلى من هذه التقنية للإنسان في 16. الجمهور المستهدف من هذه المادة يتضمن محققين من ذوي الخبرة المحدودة والعاملة مع الماوس AT وأداء التدفق الخلوي. وتعرض العديد من الاعتبارات العملية لتحقيق التوازن بين العائد الخلوية وقدرتها على البقاء مع الوقت والموارد، فضلا عن الضوابط المثلى التدفق الخلوي لوصف AT السكان الخلايا المناعية. بالإضافة إلى بروتوكول لدينا، والقراء هي referrإد إلى المادة إن الرب مؤخرا من قبل باسو وآخرون. لمناقشة ممتازة لبعض الجوانب الفنية من التدفق الخلوي لتشمل الضوابط المناسبة والتعويضات 17.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14190-250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>D3571</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2153-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C6885-5G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>propidium iodide solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P4864-10 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stable stack 20 microliter</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SS-L10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 microliter filter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SRL10F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stable stack 250 microliter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SS-L250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1000 microliter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>GPS-L1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1000 microliter filter tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>GP-L1000F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 microliter Filter Tips</td>
 <td>Rainin</td>
 <td>SR-L200F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FC Block</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553142</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>fisher 100mn strainers</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>22-363-549</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>medium weigh dish</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>02-202B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>aluminum foil</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>1213100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mincing scissors</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>089531B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vortex</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>2215365</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>14-959-49A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>filter top FACS tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette case 200</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>1367520</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>round bottom tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352058</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringe</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>309646</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>V Bottom Plates</td>
 <td>Costar</td>
 <td>07-200-107</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>transfer bulb pipette</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>13-711-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>11 676 071</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive mat</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>1368750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Culture Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>75253839</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adapters</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>75003723</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD16/CD32</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553142</td>
 <td>Concentration: 0.5 - 1 &mu;g/ 106 cells</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse F4/80</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>17-4801</td>
 <td>Fluorophore conjugate: APC 
 Concentration: 0.2 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 17-4321</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD11b</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>11-0112</td>
 <td>Fluorophore conjugate: FITC 
 Concentration: 0.5 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 11/1/4031</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Armenian Hamster anti-mouse CD11c</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>12-0114</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.8 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: Dec-88</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Goat anti-mouse MGL1/2</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>FAB4297P</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.1 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: IC108P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Goat anti-mouse CD206</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>FAB2535P</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.1 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: IC108P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CCR2</td>
 <td>R&amp;D Systems</td>
 <td>FAB5538P</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE 
 Concentration: 0.1 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: IC013P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Armenian Hamster anti-mouse TCR&beta;</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>553174</td>
 <td>Fluorophore conjugate: APC 
 Concentration: 0.2 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 553956</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD8a</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>552877</td>
 <td>Fluorophore conjugate: PE-Cy7 
 Concentration: 0.8 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 552784</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat anti-mouse CD4</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>557956</td>
 <td>Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 
 Concentration: 0.2 &mu;g/ 106 cells 
 Isotype control catalog number: 557963</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Table 1. List of Materials and Reagents.

isolation of adipose tissue immune cells

وقد أدى اكتشاف تسلل زيادة البلاعم في الأنسجة الدهنية (AT) من القوارض والبشر يعانون من السمنة المفرطة إلى تكثيف الاهتمام مساهمة الخلايا المناعية لمقاومة الانسولين وجهازية. العزلة والكمي لمختلف السكان الخلايا المناعية في العجاف والسمنة AT الآن تقنية تستخدم عادة في المختبرات immunometabolism، ويجب توخي الحذر الشديد حتى الآن سواء في انسجة الخلايا الوعائية والعزلة في تحليل التدفق الخلوي بحيث البيانات التي تم الحصول عليها هو موثوق بها والتأويل . في هذا الفيديو نحن لشرح كيفية اللحم المفروم، هضم، وعزل الخلايا المناعية التخصيب انسجة جزء الأوعية الدموية. وفي وقت لاحق، وتبين لنا كيفية الضامة تسمية الأجسام المضادة والخلايا الليمفاوية T وكيفية البوابة بشكل صحيح عليها في تجارب التدفق الخلوي. يتم توفير تدفق ممثل المؤامرات الخلوي من الدهون التي تغذيها الهزيل وارتفاع الدهون في الفئران السمينة التي تغذيها منخفضة. وثمة عنصر حاسم من هذا التحليل هو استخدام الأجسام المضادة التي تفعللا يتألق في القنوات حيث في الضامة هي autofluorescent بشكل طبيعي، فضلا عن استخدام ضوابط التعويض المناسب.

وقد استخدم الهضم كولاجيناز من AT تليها الطرد المركزي المغاير لعزل صندوق التبرعات الخاص من منصات الدهون بربخي من الفئران C57BL/6J ذكر تغذية قليلة الدهون (10٪ سعر حراري من الدهون)، أو ارتفاع الدهون (60٪ سعر حراري من الدهون) النظام الغذائي (LFD وHFD ، على التوالي) لمدة 16 أسبوعا. ثم ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adipose Tissue Immune Cells at JoVE.com

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

الأنسجة الدهنية (AT) هو موقع على مكثفة تنشيط الخلايا المناعية والتفاعل. تقريبا جميع خلايا الجهاز المناعي موجودة في AT ويتم تغيير النسب من خلال السمنة. العزلة المناسبة، القياس الكمي، وتوصيف AT السكان الخلايا المناعية تعتبر بالغة الأهمية لفهم دورها في مرض immunometabolic.

العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.0K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. الأنسجة الدهنية (AT) هو موقع على مكثفة تنشيط الخلايا المناعية والتفاعل. تقريبا جميع خلايا الجهاز المناعي موجودة في AT ويتم تغيير النسب من خلال السمنة. العزلة المناسبة، القياس الكمي، وتوصيف AT السكان الخلايا المناعية تعتبر بالغة الأهمية لفهم دورها في مرض immunometabolic.

Video: Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

موثوقة وعالية استخراج كفاءة الكلى الخلايا المناعية

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...