Este trabalho foi apoiado por uma bolsa (R01GM098394) do NIH e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais, bem como concessão de 1.121.176 National Science Foundation.

1. Pista A. Preparação de Testes ao vivo <ol><li> Prepare PBS dissolvendo 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, 0,24 g de KH 2 PO 4 em 800 ml de água destilada e ajustar o pH para 7,4. Levar o volume a 1 litro e esterilizar por autoclavagem. </li><li> Isolar testículos como previamente descrito 27. </li><li> Preparar tampão de coloração DAPI por diluição de 1 mg / ml a 1 ug / ml em PBS. Use a folha de alumínio para proteger o tubo de luz e armazenar a -20 ° C. </li><li> Após o isolamento dos testículos, mergulhar a amostra em 6 ul de tampão de coloração DAPI no topo de uma lâmina de microscópio de vidro carregadas positivamente durante 10 min. Testículos aderem bem a lâminas disponíveis comercialmente carregados positivamente, permitindo a fácil manipulação do espécime. Lâminas positivamente carregadas são covalentemente modificada para conferir uma carga positiva estática à superfície do vidro. Semelhante ao revestimento polilisina, isso promove a interação do wi testículosª a superfície da lâmina. </li><li> Lavar o excesso de DAPI, substituindo o tampão de coloração duas vezes com 6 mL de PBS. Use um pedaço de papel de filtro para afastar o buffer depois de cada etapa de lavagem. Tenha cuidado para não remover acidentalmente os testículos, juntamente com o tampão durante cada lavagem. </li><li> Adicionar 6 ul de PBS para o espécime. A quantidade de tampão utilizado deve ser ajustado para o tamanho da lamela. Os volumes fornecidos neste protocolo são para uma lamela mm 18 x 18. Opcional: É aconselhável para perfurar os testículos perto da localização relativa do tipo de células de interesse. Isto vai garantir que haja uma pressão mínima sobre essas células, durante o passo de esmagamento, mantendo assim a sua integridade estrutural. Perfuração dos testículos pode ser realizada utilizando um bisturi afiado limpo. </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela em cima do espécime. </li><li> Selar as bordas da lamínula usando unha polonês claro para garantir que o buffer não evapora a partir dos espécimes vivos, enquanto imenvelhecimento. </li><li> Usar um marcador para indicar a posição dos testículos para facilidade em colocar a amostra sobre a lâmina e proceder à imagiologia. </li><li> Lavar o excesso de tampão de coloração DAPI, substituindo o tampão por duas vezes com 6 mL de PBS. Use um pedaço de papel de filtro para afastar o buffer depois de cada etapa de lavagem. Tenha cuidado para não remover acidentalmente a amostra juntamente com o tampão durante cada lavagem. </li></ol> 2. Faixa B. Preparação de Testes Fixos <ol><li> Preparar tampão Fix por diluição de solução stock de formaldeído a 37% em PBS para uma concentração final de 3,7% de formaldeído em PBS 1x </li><li> Preparar tampão de coloração DAPI diluindo estoque de 1 mg / ml de DAPI e 1 mg / ml em PBS. </li><li> Mergulhar os testículos numa queda de 6 ul de PBS no topo de uma lâmina de microscópio de vidro carregadas positivamente. </li><li> Orientar manualmente os testículos de forma linear ou como de outro modo preferido. </li><li> Use um pedaço de papel de filtro para afastar o PBS e substituí-lo com 6 mL de Fixtampão por 5 min. </li><li> Use um pedaço de papel de filtro para afastar o buffer Fix e mergulhar a amostra em 6 mL de tampão de coloração DAPI para 10 min. </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela mm 18 x 18 em cima do espécime. </li><li> Selar as bordas da lamínula usando unha polonês claro para garantir que o buffer não evapora a partir da amostra, enquanto imagem. </li><li> Usar um marcador para indicar a posição dos testículos para facilidade em colocar a amostra sobre a lâmina e proceder à imagiologia. </li></ol> 3. Pista C. Preparação de histoquímica Testículos Siliconização lamela: mergulhar múltiplos 18 x 18 mm em lamelas de um pequeno tabuleiro que contém a solução com silicone e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente numa hotte. Certifique-se de que as lamelas são totalmente exposta e não são empilhadas em cima umas das outras. <ol><li> Coloque a amostra em uma queda mL 5 de PBS na lamela siliconizada. Oriente otestículos se for o caso e furar os testículos com um bisturi afiada. Delicadamente, coloque uma lâmina de vidro carregada positivamente sobre a lamela, permitindo que o PBS para se tornar uniformemente dispersas entre as lamelas e slide. Use um pequeno pedaço de papel de filtro para afastar o excesso de tampão entre a lamela e slide. Como o tampão é removido por o papel de filtro, o aumento da pressão vai esmagar os testículos. Muitas amostras devem ser preparadas simultaneamente, como alguns podem ser perdidos ou danificados ao longo do protocolo. Um gravador de vidro pode ser utilizado para rotular os slides se diferentes tipos de amostras vai ser preparados em simultâneo. <ol><li> Lava-se a lamelas 3x durante 1 min cada, em água, seguido de 3x durante 1 min cada, em etanol a 70%, e uma lavagem final durante 1 min em água. Permitir as lamelas siliconizadas secarem naturalmente sob uma coifa. </li></ol></li><li> Solte os slides em nitrogênio líquido e permitir que a amostra para congelar por 5-10 min. </li><li> Remova os slides da liquid nitrogênio usando um grande fórceps. Use um bisturi para remover rapidamente a lamela. A amostra deve permanecer no slide. Tenha cuidado para não manchar a amostra durante este processo, deslizando as lamelas ao longo do slide. </li><li> Incubar as lâminas em metanol prechilled em uma coloração jarra de Coplin de vidro a -20 ° C por 15 min. </li><li> Transferir as lâminas para uma tina de coloração Coplin vidro contendo acetona pré-arrefecida a -20 ° C durante 30 seg. </li><li> Lavar as lâminas durante 1 min em PBS, à temperatura ambiente, utilizando uma coloração frasco Coplin vidro. </li><li> Prepare PBST-B, completando PBS com 0,1% de Triton-X100 a 1% Albumina de Soro Bovino (BSA). 5% de soro normal, a partir das mesmas espécies de hospedeiros como o anticorpo secundário (a partir do passo 3.14) pode ser usado em vez de BSA para reduzir o ruído de fundo produzido a partir do anticorpo secundário a ligação não especifica. </li><li> Incubar as lâminas durante 10 min em PBST-B em um frasco de vidro para coloração Coplin para bloquear sites inespecíficas. </li><li> Encha as cavidadesa câmara de umidade com água. Humidade no interior da câmara irá minimizar a evaporação de soluções de anticorpos a partir da amostra durante os passos de incubação. </li><li> Prepare PBST-BR, completando PBST-B com 100 ug / ml de RNase A. RNase A degrada o ARN na amostra, e também serve como um agente bloqueador adicional, absorvendo fortemente à superfície do vidro. <ol><li> Coloque um pedaço de aproximadamente 1x1 cm de Parafilm no topo da amostra de espalhar uniformemente a solução de anticorpos e proteger a solução de anticorpo a partir de evaporação. Fechar a câmara de humidade e incubar a amostra com o anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Retire os slides de PBST-B. Utilizar um pedaço de papel de filtro para secar a superfície da lâmina em torno do espécime, utilizando-se o cuidado de não secar a própria amostra. Finalmente, coloque o slide na câmara de umidade com o modelo voltado para cima </li><li> Adicionar cuidadosamente 100 ul do anticorpo primário diluído em PBST-BR na parte superior da especificaçãoImen (1:200 é geralmente uma boa concentração de partida para anticorpos descaracterizados). <ol><li> Cobrir as amostras com um a cerca de 1 x 1 cm pedaço de Parafilm e fechar a câmara de humidade. Incubar a amostra com o anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Abra a câmara de umidade e utilize uma pinça para remover suavemente a Parafilm do slide. Incubar as lâminas durante 5 min em PBST num frasco Coplin coloração de vidro à temperatura ambiente para lavar. Repetir este processo por um total de três lavagens. </li><li> Retire os slides de PBST-B e colocá-los na câmara de umidade com o modelo voltado para cima. Adicionar cuidadosamente 100 ml de anticorpo secundário diluído em PBST-BR na parte superior do espécimen. </li><li> Abra a câmara de umidade e utilize uma pinça para remover suavemente a Parafilm do slide. Mais uma vez, lava-se a amostra 3x durante 5 min cada em PBST num frasco Coplin coloração de vidro seguido de 3x durante 5 minutos cada em PBS. </li><li> Use um Kimwipe e papel de filtro para<html> cuidadosamente secar a superfície da lâmina, tendo o cuidado para evitar tocar ou a secagem da amostra. </li><li> Adicionar 6 mL de meio de montagem de amostras, cobrir com uma lamela limpo (não revestido com silicone), eo selo bordas com unha polonês. </li><li> Usar um marcador para indicar a posição dos testículos para facilidade em colocar a amostra sobre a lâmina e proceder à imagiologia. </li></ol> 4. Notas de imagem Imagem pode ser alcançado através de um microscópio de luz comum vertical ou invertido ou microscópio confocal. É importante que o microscópio está equipado com contraste de fase, especialmente para a imagiologia de amostras testiculares vivos (faixa A). Este recurso tornou-se recentemente disponível em microscopia confocal. Quando os testículos quebrar espontaneamente (Track A), a ponta (caule região da célula) é normalmente mantida intacta e é facilmente identificável, proporcionando um bom marcador para localizar e utilizar inicialmente para a orientação. _content &quot;&gt; Centríolos são bastante pequenas estruturas e as imagens devem ser tiradas com 63X ou 100X objetivos, um fator de zoom de 4-6X, e uma resolução de pelo menos 512 x 512 pixels, quando possível.

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Estudar biologia centrosome nos testículos mosca utilizando marcadores centrosomal geneticamente marcadas é um método útil para avaliar a função ea atividade centrosome tanto em um contexto do tipo selvagem e mutante. Em particular, A faixa é adequado para a triagem rápida de anormalidades centrosomal como malformação, misegregation, instabilidade, ou comprimento anormal num esforço para identificar novos mutantes. Além disso, os cílios spermatid em preparações vivas conservaram a mobilidade durante cerca de 15 minutos após a dissecção eo uso de testes ao vivo Rastrear A também permite a mobilidade do esperma para ser facilmente tratadas. Uma vez que a actividade de esperma cílios móveis está directamente relacionada com a função do centrossoma, os ensaios podem ser realizados para determinar os efeitos de diferentes mutações centrosomal sobre a função ciliar. Pista B pode ser utilizado para a observação mais específicos, especialmente quando os dados estatísticos são exigidos, tais como para a contagem do número de centríolos por célula e ou o número de células por cisto. Pista C é mais useful para observações detalhadas que exigem coloração com anticorpos. Exemplos incluem marcação de um tipo particular de células, tais como células estaminais, a coloração de uma proteína que não possui uma marca disponíveis, tais como a tubulina acetilada, ou para verificar a ausência ou mislocalization de uma proteína num mutante. Quando imagiologia centrossomas e estruturas relacionadas com o centrossoma, utilizando marcadores geneticamente marcados em vez de anticorpos não é apenas experimentalmente mais fácil, mas também fornece resultados mais robustos e reprodutíveis. Portanto, a utilização de proteínas centrosomal geneticamente marcadas é uma abordagem fiável para análises mecanicistas e quantitativos que requerem um grande conjunto de dados. Por exemplo, o uso de marcadores centrosomal geneticamente marcadas tem sido particularmente útil para a quantificação de comprimento de centríolos. Tal análise revelou que várias mutações podem ser classificados em duas categorias com base na variabilidade de comprimento de centríolos. Uma categoria inclui as mutações que change comprimento centriole, mas não afectam o desvio padrão 1 e a outra categoria inclui as mutações que afectam tanto comprimento centriole e o desvio padrão de comprimento 11. Esses dados quantitativos podem fornecer informações úteis para a função de determinados genes centrosomal. Os mutantes que exibem Centrosomal comprimento centriole defeituoso com um aumento no desvio padrão pode ser devido a uma desestabilização da estrutura centriolar. No entanto, o comprimento de centríolos defeituoso com um erro padrão normal pode indicar que a mutação não estruturalmente desestabilizar o centriole e é mais provável que seja devida a uma mudança no mecanismo de controlo do comprimento do regulador de centríolos. Devido a inconsistências na imunocoloração, as análises quantitativas são difíceis com o uso de marcadores de anticorpos sozinhos. O centrossoma é uma estrutura proteica grande, complexo e muitas de suas proteínas são encontradas apenas dentro de seu interior. Usando centrosomal geneticamente marcadomarcadores, em vez dos anticorpos permite rotular consistentemente componentes internos do centrossoma cujos epítopos podem ser de outro modo inacessíveis para marcadores de anticorpos. Por exemplo, estudos de localização de BLD10 utilizando anticorpos encontra a proteína a ser enriquecida nas extremidades proximal e distal do centriole 13, enquanto BLD10-GFP mostra uma distribuição mais uniforme 1. No entanto, é também importante considerar o nível de expressão de uma proteína geneticamente marcado particular, como esta pode afectar a distribuição da proteína. A localização de Sas-4-GFP e SAS-6-GFP expressa sob a sua endógena é restrita às extremidades proximais dos centríolos 1,16,35 Por outro lado, Sas-4-GFP e SAS-6-GFP expressa sob a forte promotor de ubiquitina estão localizadas ao longo de todo o comprimento do centriole 12,14. Outra consideração importante é o efeito da marcação genética na função da proteína. Analisando se as proteínas geneticamente marcadas são funcionais pode ser tested através da introdução da proteína transgénica para um fundo mutante e examinando se a proteína transgénica resgata o fenótipo mutante. Fixação de testículos de Drosophila pode ser realizada utilizando uma variedade de fixadores químicos. Aqui, descrevemos a fixação tanto com formaldeído (Faixa B) e metanol-acetona (Faixa C). No entanto, tanto o fixador pode ser utilizado de forma intercambiável e uma vez que vários fixadores podem perturbar quimicamente epítopos de anticorpos nativos, a selecção do fixador apropriada para imunocoloração deve ser determinada experimentalmente. Os seguintes fixadores e as condições de incubação são geralmente utilizadas: 3,7% de formaldeído, 5 min a temperatura ambiente, o metanol, 15 min a -20 ° C; acetona, 10 min a -20 ° C, metanol, 15 min a -20 ° C. seguido de acetona, 30 seg a -20 ° C; etanol, 20 min a -20 ° C. Embora a fixação com acetona, metanol, etanol e não requerem um passo de permeabilização estendida para a imunocoloração, wi fixaçãoth formaldeído deve ser seguido por uma incubação de 1 h em PBST-B à temperatura ambiente, para permeabilizar as membranas celulares e permitir o acesso do anticorpo a epítopos intracelulares. Além disso, certos agentes fixadores são mais adequados para antigénios específicos. Por exemplo, as funções de formaldeído também para a fixação de pequenas proteínas, enquanto metanol e acetona são bem adaptados para a fixação de grandes complexos moleculares 36. A imunocoloração de Drosophila testículos foi previamente descrito para a observação de estruturas de cromatina e o citoesqueleto de microtúbulos 29,37. Aqui (Faixa C), o procedimento foi otimizado para a análise de estruturas centrosomal contendo proteínas geneticamente marcados. Nós fornecemos uma descrição detalhada deste procedimento para orientar as pessoas que são inexperientes em trabalhar em testículos de Drosophila. Este procedimento também inclui modificações para melhorar a conservação e morfologia dos testículos, como por exemplo, utilizando siliconized lamelas e lâminas de vidro com carga positiva.

Testículos de Drosophila são um sistema de órgãos adequados para estudar uma variedade de processos celulares e de desenvolvimento e foram examinados durante os anos 1-9 extensivamente. Este manuscrito centra-se no uso de testículos de Drosophila para estudar o centrossoma, um organelo celular conservada. Tal como noutros sistemas, centrossoma da função de testículos de Drosophila em mitose, meiose, e ciliogênese 10. Centrossomas são compostos por um par de estruturas baseadas em microtúbulos conhecidos como centríolos rodeadas por uma rede complexa de proteínas que se refere ao material que pericentriolar (PCM). O par centríolo é composto de um centríolo mãe mais velha e um centríolo filha mais nova. À medida que a célula progride para a mitose, os dois centríolos separar, duplicar e adquirir uma grande quantidade de PCM para finalmente formar dois centrossomas distintas. O centrossoma contendo o centríolo mãe original é referido como o centrossoma mãe e do centrosome contendo o centriole filha inicial é referido como o centrossoma filha. Testículos de Drosophila são ideais para estudar a base molecular da biologia do centrossoma por microscopia de fluorescência para uma variedade de razões. <ol><li> A maioria das proteínas de Drosophila, que são necessários para a biologia do centrossoma nos testículos são conservadas entre eucariotas, sugerindo que a visão relevantes para a biologia do centrossoma em seres humanos e outras espécies pode ser adquirida através do estudo do centrossoma em Drosophila testículos 1,11-14. </li><li> Realizar análise mutante em Drosophila fornece uma vantagem significativa, já que, ao contrário de muitos outros modelos, as mutações centrosomal em Drosophila não são embrionárias letal, permitindo, assim, a análise genética clássica da função centrosome. Esta característica única de Drosophila é devido à presença de contribuição materna que persiste durante as fases críticas do desen embrionáriovolvimento. 1,11-14. Assim, pode-se a) mutações de estudo que eliminam completamente formação centrosome e b) estudar o destino de um centrossoma normal que foi formado no embrião por contribuição materna em um contexto mutante após a contribuição materna foi esgotado (o princípio do método é descrita em 11). </li><li> Transgenes funcionais com marcas fluorescentes geneticamente codificados que rotulam o centrossoma estão disponíveis. Muitas dessas linhas de usar o próprio promotor da proteína para conduzir a transcrição do transgene, a fim de evitar a forte sobre-expressão. Isto é particularmente importante, porque a sobre-expressão das proteínas, muitas vezes resulta em produtos manufacturados que interferem com a análise da função centrossoma 1,11. </li><li> O centríolo e centrosome são excepcionalmente longa em todo Drosophila espermatogênese, permitindo assim uma análise rápida e fácil do centrossoma por imagem. </li><li> Etapas consecutivas na espermatogênese e centrosome biology são organizadas por ordem cronológica ao longo dos testículos, começando na ponta testículo com os centrossomas de células estaminais do esperma e que termina na parte inferior dos testículos com tamanho reduzido do centrossoma e na actividade de células de esperma maduros (Figuras 1 e 2). Isso permite uma fácil identificação e análise da função centrossoma durante as diferentes fases de desenvolvimento do esperma. </li><li> Testes são facilmente dissecada a partir de larvas macho, pupas e adultos 27. </li><li> Durante a espermatogênese, o centrossoma e seus centríolos proceder através de composição múltipla, estrutural e estados funcionais para funcionar na mitose, meiose e formação cílio. Durante estes processos, as monta centrossoma, duplicatas, migra, âncoras para partes específicas da célula, amadurece, se divide e cria um cílio. Além disso, o centriole do spermatid madura dá origem a um precursor centriolar chamado o PCL 1. Também no spermatid maduro, o centrossoma passa por um processo called redução centrosome em que ele perde muitos componentes do PCM eo centríolo (Figuras 1 e 2). Assim, os estudos nos testículos permitem abordar vários aspectos da vida, tais como a retenção de centrosome centrosome nas células-tronco, a duplicação centríolo, estabilidade centríolo, alongamento centríolo, separação centríolo e segregação, recrutamento PCM, ciliogênese, formação de PCL, a redução centrosome e nucleação de microtúbulos astral entre outros. </li><li> Finalmente, os estudos de biologia centrosome são ajudados por outras características bem conhecidas de Drosophila que fizeram dele um organismo modelo preferido para estudos biológicos. Estes incluem um curto tempo de geração, a facilidade de genética, assim como a mutagénese aleatória e dirigida para o local. </li></ol> Em conjunto, as características acima indicadas de Drosophila testículos fornece um modelo em que o centrossoma pode ser estudada por imagem de fácil, rápida, e detalhado. As técnicas descritasneste trabalho foram aplicados para investigar vários aspectos da biologia centrosome incluindo formação centríolo 11, a duplicação centríolo 15, o recrutamento PCM 16, regulamentação centrosome 17 e ciliogênese 18. Estas técnicas também foram aplicados ao estudo do centrossoma em outras áreas da biologia tais como a regulação da meiose 19, a montagem do eixo 20, e a actividade do centrossoma na divisão de células estaminais assimétrica 21, entre muitos outros. Imagem de testículos nos centrossoma começa com a obtenção de moscas que expressam proteínas centrosomal geneticamente marcadas e isolar os testículos de larvas macho, pupas, ou moscas adultas. Estas moscas são disponíveis a partir de vários grupos de investigação 1,11,15,22-25. Os testículos conter todas as fases larvares de espermatogénese antes da meiose e são úteis na análise de mutações que são letais em pupa ou adulto. No entanto, pupa Tarde ou jovens adult testículos são as mais robustas e contêm todos os pré e pós-meióticas estágios da espermatogênese, tornando-os preferíveis para análise. Uma vez que o número de células de esperma diminui com o envelhecimento da mosca, a utilização de testículos adulto também é apropriado para o estudo do centrossoma no contexto de envelhecimento 26.. Um método de isolamento de testículo de moscas adultas foi anteriormente descrito 27. Imagem de centrossomas e sua função em testes de Drosophila pode ser alcançado através de três linhas interligadas que estão aqui (Figura 3) apresentados. Selecção de faixa que é a mais adequada depende da natureza da questão do investigador está a tratar. A trilha envolve imagem dos testículos ao vivo. É o mais rápida das três faixas, mas só pode ser aplicada quando a amostra não necessita ser preservada e imunocoloração quando não é necessária. Na faixa A, testículos são montados (intacta, perfurado ou corte) em lâminase cuidadosamente esmagados sob uma lamela de modo a formar uma única camada de células, facilmente identificáveis. As células são então visualizadas usando microscopia de contraste de fase e microscopia de fluorescência. A utilização de contraste de fase é particularmente importante para a análise de testículos de Drosophila, porque revela informação celular que não é visível com outras formas de iluminação transmitida e, portanto, permite a rápida identificação de várias fases de desenvolvimento do esperma 28,29. No entanto, a faixa A tem duas desvantagens principais. Em primeiro lugar, a integridade morfológica das células é frequentemente comprometida uma vez que os testículos são rompidas. Em segundo lugar, as células não fixadas às vezes se mover dentro da amostra, fazendo com que a imagem de múltiplas camadas confocal dentro de uma região especificada difícil. Para promover a análise dos tipos de células específicas, testículos pode ser perfurada ou cortada, a fim de orientar o modo como as rupturas de testículos de modo que sob o esmagamento minimamente lamela afecta a morfologia do tipo celular de interesse. Pista B envolve a fixação química dos testículos. Esta pista requer uma quantidade intermédia de tempo para a preparação de amostras e tem a vantagem de que as amostras fixadas podem ser guardados para posterior análise. Além disso, a fixação serve para fazer as estruturas celulares mais rígidas, minimizando o movimento do espécime durante o exame. No entanto, a microscopia de contraste de fase torna-se muito menos informativa após a fixação química, tornando algumas fases de desenvolvimento difícil identificar esperma. Pista C é a mais demorada, mas tem a vantagem adicional de que as estruturas celulares são fixas e imunocoradas, permitindo a visualização de proteínas que não estão disponíveis com as marcas genéticas adequadas. Há muitos anticorpos disponíveis comercialmente e de vários grupos de pesquisa para imunomarcação centrossomas e estruturas relacionadas com centrossoma em testículos de Drosophila.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/ Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments/Description</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1306</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positively Charged Slides</td>
 <td>AZER Scientific</td>
 <td>EMS200A+</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feather Microscalpel</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72045-30</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37% Formaldehyde or Paraformaldehyde</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP531-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
 <td>Boston Bioproducts</td>
 <td>BM-220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18 mm coverslips number 1.5</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48366 205</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nail Polish</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72180</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A412-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A949-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton-X100</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T9284-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Jackson ImmunoResearch</td>
 <td>001-000-162</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse A</td>
 <td>5 prime</td>
 <td>2900142</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter paper</td>
 <td>Whatman</td>
 <td>1001-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass engraver</td>
 <td>Dremel</td>
 <td>290-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCS SP5 confocal microscope</td>
 <td>Leica </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounting Media</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>17985-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immuno Stain Moisture Chamber, Black</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62010-37</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70315</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

imaging centrosomes in fly testes

Centrossomas são conservadas organelos à base de microtúbulos, cuja estrutura e mudança dramaticamente ao longo do ciclo celular e diferenciação de células de função. Centrossomas são essenciais para determinar o eixo de divisão celular durante a mitose e núcleos cílios durante a interfase. A identidade das proteínas que medeiam estas alterações dinâmicas permanece apenas parcialmente conhecida, e a função de muitas das proteínas que têm sido implicados nesses processos é ainda rudimentar. Um trabalho recente mostrou que Drosophila espermatogênese fornece um sistema poderoso para identificar novas proteínas críticas para a função centrosome e formação, bem como para obter insights sobre a função específica de jogadores conhecidos em processos relacionados com o centrossoma. Drosophila é um modelo genético organismo estabelecido onde os mutantes em centrosomal genes podem ser prontamente obtidos e facilmente analisadas. Além disso, os recentes avanços na sensibilidade e resolução de microscopia de luz edesenvolvimento de marcadores centrosomal geneticamente marcadas robustas têm transformado a capacidade de usar testes de Drosophila como um sistema modelo simples e acessível para estudar centrossomas. Este artigo descreve o uso de marcadores centrosomal geneticamente marcadas para executar telas genéticos para novos mutantes centrosomal e para obter insights sobre a função específica de genes recentemente identificados.

Centrossomas sofrer várias transformações morfológicas e funcionais ao longo da espermatogénese. Esta característica faz com que a espermatogénese de testículos de um sistema útil para estudar diferentes aspectos da biologia do centrossoma. Um tal processo é facilmente observado alongamento centrossoma. Em espermatogónios, o marcador centriolar ANA1-GFP marca a 0,6 um longo centriole (Figura 4a). Este centríolo alonga durante a espermatogênese e atinge um comprimento de 2,5 mM de espermátides quase maduros. Desde centríolos em Drosophila esperma são excepcionalmente longa, a imagem pode ser usada para fazer declarações quantitativos sobre alongamento centrosome (Figura 4b). Análise de comprimento centriole também pode ser realizada em um fundo mutante e vários mutantes foram identificadas que alteram o crescimento centriole (Figura 5). Exemplos são sempre cedo (ALY) e bala de canhão (CAN), mutações que arrest espermatogênese antes do início da meiose 30, mas não bloqueiam centríolo alongamento. Nestes mutantes, centríolos do espermatócitos madura crescer até cerca de ~ 2,4 mM, em comparação com células de controlo de centríolos que atingem um máximo de 1,8 um. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"/> Figura 1. Espermatogênese e Biologia centrossoma. A) Desenvolvimento de Células Estaminais e espermatogônias. Todas as células de esperma têm origem a partir de células-tronco encontradas na extremidade apical dos testículos. Cada célula-tronco se divide assimetricamente para formar uma célula-tronco que herda a centrosome mãe e um spermatogonium progenitor que herda a centrosome filha 31. Como forma de espermatogônias, tornam-se rodeado por 2 células cisto, que continuam a cercar os espermatócitos e espermátides em todo espermatogênese. As espermatogônias dividem 4 vezes para produzir 16 espermatogônias, cada um contendo dois centríolos. B) Desenvolvimento de espermatócitos e meiose. Durante o desenvolvimento de espermatócitos, centríolos duplicar mais uma vez para gerar quatro centrioles organizadas em dois pares por célula e 64 centrioles por cisto. Cedo durante o desenvolvimento de espermatócitos, cada centriole move-se para a membrana plasmática, docas para ele, e alonga-se para formar uma estrutura que se assemelha a um cílio primário 18,32-34. Em maduros de espermatócitos, comprimento centriole atinge ~ 1,8 mM. Os centrossomas desempenham um papel essencial na meiose. Durante a meiose I, os pares de centríolos que ainda estão ligados ao movimento da membrana plasmática para o centro da célula e criar invaginações da membrana celular em sua ponta distal. O PCM em torno dos centríolos cresce, nucleia microtúbulos astrais, e colocaliza com o pólo do fuso. Durante a transição para a meiose II, a dupla centríolo separa de modo que apenas um único centríolo é apresent em cada pólo do fuso. C) A espermiogênese. No final da meiose II, o mais cedo redondo spermatid tem um único centriole ligada à membrana plasmática invaginada. Uma grande derivado mitocondrial rodada é encontrado perto do núcleo e mais tarde começa a se alongar ao longo do crescente axonema em posteriores espermátides arredondadas. Durante a espermatogénese, as formas axonema e se alonga no interior do citoplasma. Além disso, uma nova estrutura centriolar conhecido como o PCL (Proximal Centríolo Like) aparece perto do centríolo preexistente 1. No final da espermatogénese, células que partilham uma cisto comum separar um do outro para se tornar espermatozóides móveis totalmente madura. Os diagramas de desenvolvimento espermatócito (B) e espermiogênese (C) representam apenas uma célula dos 16 espermatócitos e 64 Espermátides, respectivamente por cisto e não retratam as células do cisto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver grande</a>figura r. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"/> Figura 2. Os testículos Drosophila. Uma sobreposição de um de contraste de fase e fluorescência da GFP micrografia de um testículo todo-mount expressando o marcador pan-centriolar Ana-1-GFP. Área distinta correspondente aos painéis 1-3 da Figura 1 são separados por uma linha vermelha tracejada A) Células-Tronco e espermatogônias, B) espermatócitos e meiose, C) espermiogênese. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"/> Figura 3. Faixas Para geração de imagens centrossomas em Drosophila testículos. <p class="jove_content" fo: Manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4highres.jpg"/> Figura 4. Centrossoma Alongamento durante a espermatogênese. A) Cada etapa mostra uma imagem de contraste de fase (à esquerda), imagem de fluorescência (meio), e uma imagem ampliada do centrossoma (direita). A imagem de contraste de fase demonstra a fase particular de célula com base na posição e na morfologia da célula, núcleo, nucléolos, e as mitocôndrias. A imagem de fluorescência mostra DNA corado com DAPI (azul). A imagem mostra centrosome centrossomas rotulados por Asterless-GFP (Asl, top imagens) e ANA1-GFP (ANA1, imagem inferior). Um círculo branco destaca a membrana celular em ambas as imagens de contraste de fase e fluorescência. Os círculos brancos tracejadas e o círculo cinzento na imagem de fluorescência destacar a posição do núcleo e o nucléolo, respectivamente. Seta aponta amarelos para o Y-cromoalguns laços. Tracejado vermelho círculos marcam as mitocôndrias. Estágios 1-6 refere-se a 29 e encena 13-17 refere-se à descrição de estágios celulares em 32. Fase 1: Primário espermatócito. Identificado como uma pequena célula de uma dica do testículo. Etapa 2a: Polar espermatócito. Identificados pela presença de um tampão de mitocôndria de um lado do núcleo. Fase 3: Apolar espermatócito. Identificada pelo seu tamanho relativamente maior que os espermatócitos primários e falta de uma tampa de mitocôndrias. Estágio 4: Primário espermatócito. Identificado pelo aparecimento de tudo: Todos os 3 ciclos do cromossomo Y. Etapa 5: Mature primária espermatócito. Espermatócitos maior produzido na espermatogénese, identificado por um aumento adicional no tamanho do núcleo. Estágio 6: premeióticas primária espermatócito. Laços do cromossomo Y se desintegrar eo núcleo desaparece. Etapa 13: Cebola Stage spermatid. Células redondas contendo núcleo de tamanho igual e mitocôndrias. Etapa 17: spermatid Tarde. Identificado como um espermátide alongada que continua a fazer parte de um Bundle de 64 espermatídeos com núcleos encontrados perto da base dos testículos., núcleos são ligeiramente mais largas do que espermatídeos maduras encontradas na vesícula seminal. As barras de escala, 10 mM e 1 mM. B) Gráfico apresenta média e desvio padrão para cada fase medida pelo Asterless-GFP (azul) e ANA1-GFP (verde). No estágio 6, (verde) médias e desvios-padrão Asterless-GFP (azul) e ANA1-GFP se sobrepõem e apenas Asterless-GFP (azul) pode ser apreciado. A partir de Stage 13, Asterless-GFP não decorar todo o centríolo e as medições não foram determinados (ND). <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"/> Figura 5. Anormalmente longo Centríolos na fase 6 espermatócitos de aly e pode mutantes. AC) micrografia Luz de testículos inteiros e painel fluorescente do representante centrosome labeled por ANA1-GFP. Observe a forma anormal dos testículos em aly e pode mutantes, o que resulta de uma falta de espermátides como consequência da prisão meiótica. D) Gráfico apresenta média, desvio padrão e distribuição de dados de comprimento centríolo no tipo selvagem, aly e pode . Número de amostras para cada ponto de dados está entre parênteses. Barra de escala, 1 mícron.

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Imaging Centrosomes in Fly Testes

Imagiologia de proteínas centrosomal durante Drosophila espermatogénese é um método potente para identificar novas proteínas críticas para a biologia do centrossoma, bem como para elucidar a função particular de jogadores conhecidos neste processo.

Centrossomas de imagem na mosca Testículos

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

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Vídeo: Imaging Centrosomes in Fly Testes

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Biologia

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identificação de novos reguladores de transpiração vegetal por triagem de imagens térmicas em larga escala em Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm development. However, immunolabeling of the whole Drosophila testis is often associated with significant non-uniformity of staining due to antibody penetration. Squashed preparations only partially overcome the problem since it decreases the 3D quality of the analyses. Herein, we describe a whole-mount protocol using NP40 and heptane during fixation together with immunolabeling in liquid media. It preserves the volume suitable for confocal microscopy together with reproducible and reliable labeling. We show different examples of 3D reconstitution of spermatocyte nuclei from confocal sections. The intra- and inter-testes reproducibility allows 3D quantification and comparison of fluorescence between single cells from different genotypes. We used different components of the intranuclear MINT structure (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) as well as two components associated with the nuclear pore complex to illustrate this protocol and its applications on the largest cells of the testis, the S4-S5 spermatocytes.

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

We present here an improved protocol for the whole-mount preparation and immunostaining of Drosophila testes, suitable for confocal microscopy and also allowing reproducible and reliable labeling. We illustrate this protocol by 3D representation and quantification of colocalization experiments on the large S4-S5 spermatocytes.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...