Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (R01GM098394) von NIH und National Institute of General Medical Sciences sowie Gewährung von 1.121.176 National Science Foundation unterstützt.

1. Spur A. Herstellung der Live-Testes <ol><li> Vorbereitung PBS durch Auflösen von 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, 0,24 g KH 2 PO 4 in 800 ml destilliertem Wasser und Einstellen des pH auf 7,4. Bringen Sie das Volumen auf 1 L und durch Autoklavieren sterilisieren. </li><li> Isolieren Hoden, wie zuvor beschrieben 27. </li><li> Bereiten DAPI-Färbung Puffer durch Verdünnung von 1 mg / ml Stamm 1 ug / ml in PBS. Verwenden Sie Aluminiumfolie um das Rohr aus Licht und bei -20 ° C schützen </li><li> Nach Isolierung der Hoden, tauchen die Probe in 6 ul der DAPI-Färbung Puffer auf einer positiv geladenen Glasobjektträger für 10 min. Hoden gut an im Handel erhältlich positiv geladene Objektträger, erlaubt eine einfache Manipulation der Probe. Positiv geladene Objektträger kovalent modifiziert, um eine statische positive Ladung an der Glasoberfläche zu verleihen. Ähnlich Polylysin-Beschichtung, fördert dies die Wechselwirkung des Testes with der Oberfläche der Folie. </li><li> Waschen Sie überschüssiges DAPI durch zweimaliges Ersetzen der Färbepuffer mit 6 ul PBS. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier nach jedem Waschschritt Docht entfernt den Puffer. Seien Sie vorsichtig, um während jeder Wäsche nicht versehentlich entfernen Sie die Hoden zusammen mit dem Puffer. </li><li> In 6 ul PBS auf die Probe. Die Menge des verwendeten Puffers sollte für die Größe des Deckglases eingestellt werden. Die in diesem Protokoll vorgesehenen Volumina sind für einen 18 x 18 mm Deckglas. Optional: Es ist ratsam, die Hoden in der Nähe der relativen Lage der interessierenden Zelltyp zu durchstechen. Dies wird sicherstellen, dass ein minimaler Druck auf die Zellen während der Quetsch-Schritt, wodurch ihre strukturelle Integrität beibehalten. Piercing der Hoden durchgeführt mit einem scharfen, sauberen Skalpell werden. </li><li> Vorsichtig ein Deckglas auf der Probe. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack, um sicherzustellen, dass der Puffer nicht aus den Live-Probe zu verdampfen, während imAlterung. </li><li> Mit einem Stift, um die Position der Hoden zur Erleichterung der Lokalisierung der Probe auf dem Objektträger zu bezeichnen und zur Bildgebung. </li><li> Waschen Sie überschüssiges DAPI-Färbung Puffer zweimal ersetzt den Puffer mit 6 ul PBS. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier nach jedem Waschschritt Docht entfernt den Puffer. Achten Sie darauf, bei jedem Waschgang nicht versehentlich entfernen Sie die Probe zusammen mit dem Puffer. </li></ol> 2. Titel B. Herstellung von Fest Hoden <ol><li> Vorbereitung Fix Puffer durch Verdünnung 37% Formaldehyd in PBS-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 3,7% Formaldehyd in PBS 1x </li><li> Bereiten DAPI-Färbung Puffer durch Verdünnung von 1 mg / ml DAPI Lager 1 ug / ml in PBS. </li><li> Tauchen der Hoden in einem 6 ul Tropfen PBS auf einem positiv geladenen Objektträger aus Glas. </li><li> Manuelles orientieren die Hoden in einer linearen Weise oder als sonst bevorzugt. </li><li> Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um den Docht entfernt PBS und ersetzen Sie es mit 6 ul FixPuffer für 5 min. </li><li> Verwenden Sie ein Stück Filterpapier Docht entfernt die Fix-Puffer und tauchen die Probe in 6 ul der DAPI-Färbung Puffer für 10 min. </li><li> Vorsichtig einen 18 x 18 mm Deckglas auf der Probe. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack, um sicherzustellen, dass der Puffer nicht aus der Probe zu verdampfen, während die Abbildung. </li><li> Mit einem Stift, um die Position der Hoden zur Erleichterung der Lokalisierung der Probe auf dem Objektträger zu bezeichnen und zur Bildgebung. </li></ol> 3. Titel C. Herstellung von immun Hoden Coverslip Silizieren: Tauchen mehrere 18 x 18 mm Deckgläsern in einem kleinen Fach mit Silizieren Lösung und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur unter einer Abzugshaube. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser sind komplett freigelegt und sind nicht auf der jeweils anderen gestapelt. <ol><li> Legen Sie die Probe in einer 5 ul Tropfen PBS auf der silikonisierten Deckglas. Richten Sie dieHoden wie gewünscht und durchbohren die Hoden mit einem scharfen Skalpell. Sanft statt einer positiv geladenen Glasobjektträger über das Deckglas, so dass der PBS gleichmäßig zwischen dem Deckglas und dem Objektträger verteilt werden. Mit einem kleinen Stück Filterpapier zu Docht entfernt die überschüssige Puffer zwischen dem Deckglas und Objektträger. Als Puffer wird durch das Filterpapier entfernt wird, wird der Druckanstieg der Hoden quetschen. Viele Proben sollten gleichzeitig hergestellt werden, wie einige können verloren gehen oder beschädigt werden, im Laufe des Protokolls. Ein Glas Stecher kann verwendet werden, um die Folien zu beschriften, wenn verschiedene Arten von Proben gleichzeitig zubereitet werden. <ol><li> Für 1 min jeweils in Wasser, gefolgt von 3x 1 min jeweils in 70% Ethanol und einem letzten Waschen für 1 min in Wasser Waschen Sie die Deckgläser 3x. Lassen Sie die silikonisierten Deckgläschen an der Luft trocknen unter einer Abzugshaube. </li></ol></li><li> Lassen Sie die Folien in flüssigem Stickstoff und lassen Sie die Probe für 5-10 min einzufrieren. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus der liquid Stickstoff mit einer großen Pinzette. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Deckglas schnell zu entfernen. Sollte die Probe auf dem Objektträger verbleiben. Achten Sie darauf, um die Probe während dieses Prozesses, indem das Deckglas auf dem Objektträger zu schmieren. </li><li> Die Folien in vorgekühltes Methanol Inkubation in einem Glas Coplin Küvette bei -20 ° C für 15 min. </li><li> Die Objektträger in einem Glasgefäß, Coplin Färbung vorgekühlt Aceton bei -20 ° C für 30 Sekunden. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 1 min in PBS bei Raumtemperatur mit einem Glas Coplin Küvette. </li><li> Vorbereitung PBST-B durch Hinzu PBS mit 0,1% Triton-X100 und 1% Rinderserumalbumin (BSA). 5% normalem Serum der gleichen Spezies wie die Wirts sekundären Antikörper (aus Schritt 3.14) anstelle des BSA verwendet, um die nichtspezifische Antikörperbindung hergestellt Sekundärhintergrundrauschen zu reduzieren. </li><li> Die Folien Inkubation für 10 min in PBST-B in einem Glas Coplin Küvette für unspezifische Seiten zu sperren. </li><li> Füllen Sie die Vertiefungender Feuchtekammer mit Wasser. Feuchtigkeit im Inneren der Kammer wird die Verdampfung von Antikörperlösungen von der Probe während der Inkubationsschritte minimieren. </li><li> Vorbereitung PBST-BR durch Hinzu PBST-B mit 100 ug / ml RNase A RNase A zersetzt RNA in der Probe und dient auch als ein zusätzliches Sperrmittel durch stark absorbierende an der Glasoberfläche. <ol><li> Legen Sie ein etwa 1x1 cm großes Stück Parafilm auf der Probe, um die Antikörperlösung gleichmäßig verteilt und die Antikörperlösung schützen verdampft. Schließen der Feuchtigkeitskammer und Inkubieren der Probe in dem primären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Folien aus PBST-B. Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um den Bereich der Folie um die Probe zu trocknen, mit Vorsicht die Probe selbst nicht zu trocken. Schließlich legen Sie die Folie in der Feuchtigkeitskammer mit der Probe nach oben </li><li> Vorsichtig mit 100 ul des primären Antikörpers in PBST-BR auf der Oberseite des spec verdünntimen (1:200 ist in der Regel ein guter Ausgangskonzentration für nicht charakterisierte Antikörper). <ol><li> Decken Sie die Probe mit einem ca. 1 x 1 cm großes Stück Parafilm und schließen die Feuchtigkeit Kammer. Inkubieren der Probe in sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer und verwenden Pinzette vorsichtig die Parafilm von der Folie. Die Objektträger für 5 min Inkubation in PBST in einem Glas Coplin Küvette bei Raumtemperatur zu waschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt drei Waschungen. </li><li> Entfernen Sie die Folien aus PBST-B und legen Sie sie in der feuchten Kammer mit der Probe nach oben ein. Vorsichtig mit 100 ul sekundären Antikörper in PBST-BR auf der Probe verdünnt. </li><li> Öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer und verwenden Pinzette vorsichtig die Parafilm von der Folie. Wieder, waschen Sie die Probe 3x für jeweils 5 min in PBST in einem Glas Coplin Küvette gefolgt von 3x 5 min jeweils in PBS. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe und Filterpapier<html> sorgfältig trocknen die Oberfläche der Folie vorsichtig berühren oder Trocknen der Probe zu vermeiden. </li><li> In 6 ul Montage Medien auf die Probe, decken Sie mit einem sauberen Deckglas (nicht mit Silikon beschichtet) und die Dichtung Ränder mit Nagellack. </li><li> Mit einem Stift, um die Position der Hoden zur Erleichterung der Lokalisierung der Probe auf dem Objektträger zu bezeichnen und zur Bildgebung. </li></ol> 4. Imaging Hinweise Imaging kann mit einem stehenden oder umgekehrten normalen Lichtmikroskop oder konfokalen Mikroskop erreicht werden. Es ist wichtig, dass das Mikroskop mit Phasenkontrast ausgestattet werden, insbesondere für die Abbildung von lebenden Proben Hoden (Spur A). Diese Funktion ist vor kurzem zur Verfügung stehen auf konfokalen Mikroskopen. Wenn die Hoden brechen spontan (Track A) wird die Spitze (Stammzellbereich) in der Regel intakt gehalten und ist leicht erkennbar, die eine gute Markierung, um zunächst finden und verwenden zur Orientierung. _content &quot;&gt; Centriolen sind ziemlich klein Strukturen und Bilder sollten daher mit 63X oder 100X Ziele, einen Zoomfaktor von 4-6X genommen werden, und eine Auflösung von mindestens 512 x 512 Bildpunkten, wenn möglich.

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Studium der Biologie in Zentrosom fly Hoden mit genetisch markierten zentrosomale Marker ist eine nützliche Methode für die Bewertung der Zentrosom Funktion und Aktivität sowohl in Wildtyp-und Mutanten-Kontext. Insbesondere ist Track A geeignet für ein schnelles Screening von zentrosomale Missbildungen wie Fehlbildungen, misegregation, Instabilität, oder abnorme Länge in dem Bemühen, neue Mutanten zu identifizieren. Weiterhin Spermatiden Zilien in lebenden Präparaten bleiben beweglich etwa 15 min nach der Sektion und die Verwendung von lebenden Hoden in Spur A erlaubt auch die Beweglichkeit der Spermien, um leicht gerichtet. Da die Aktivität der Spermien beweglich Flimmerhärchen direkt an Zentrosomenfunktion Zusammenhang können Assays durchgeführt, um die Effekte von Mutationen auf verschiedenen zentrosomale Ziliarfunktion bestimmen. Spur B können für spezifische Beobachtungen vor allem, wenn die statistischen Daten, wie zum Zählen der Anzahl von Centriole pro Zelle und oder die Anzahl der Zellen pro Zyste erforderlich ist. Track C ist am Wissel für detaillierte Beobachtungen, die Färbung mit Antikörpern erforderlich. Beispiele schließen Kennzeichnung eines bestimmten Zelltyp, wie Stammzellen, Färbung eines Proteins, das nicht über einen verfügbaren tag wie acetylierte Tubulin, oder um die Abwesenheit oder Fehllokalisierung von einem Protein in einer Mutante zu überprüfen. Bei der Abbildung Zentrosomen und Zentrosom bezogenen Strukturen, mit Hilfe von gentechnisch-markierten Marker anstatt Antikörper ist nicht nur experimentell einfacher, sondern bietet auch mehr robuste und reproduzierbare Ergebnisse. Daher ist der Einsatz von gentechnisch-markierten Proteine ​​zentrosomale ein zuverlässiger Ansatz für mechanistische und quantitative Analysen, die eine große Datenmenge benötigen. Beispielsweise wurde die Verwendung von genetisch markiert zentrosomale Marker für die Quantifizierung von Zentriol Länge besonders wertvoll. Eine solche Analyse hat ergeben, dass verschiedene Mutationen können auf der Basis der Variabilität in Zentriol Länge in zwei Kategorien eingeteilt werden. Eine Kategorie umfasst Mutationen, die change Centriol Länge, aber keinen Einfluss auf die Standardabweichung 1 und die andere Kategorie gehören Mutationen, die sowohl Centriol Länge und die Standardabweichung in der Länge 11 beeinflussen. Solche quantitativen Daten können nützliche Einblicke in die Funktion von bestimmten Genen zentrosomale bieten. Centrosomal Mutanten, defekt Zentriol Länge mit einer Zunahme der Standardabweichung aufweisen, können aufgrund einer Destabilisierung centriolar Struktur sein. Jedoch defekt Zentriol Länge mit einer normalen Standardfehler zeigen, dass die Mutation nicht strukturell destabilisieren Zentriol und eher aufgrund einer Änderung in regulatorischen Mechanismus Steuern Zentriol Länge sein. Aufgrund von Inkonsistenzen in der Immunfärbung sind quantitative Analysen schwer bei der Verwendung von Antikörper-Marker allein. Das Zentrosom ist eine große, komplexe proteinartigen Struktur und viele ihrer Proteine ​​nur in seinem Inneren vorhanden. Mit genetisch-markierten zentrosomaleMarker nicht die Antikörper erlaubt es konsequent kenn internen Komponenten der Zentrosomen, deren Epitope anderweitig unzugänglich Antikörper-Marker sein. Zum Beispiel Lokalisationsstudien von BLD10 Verwendung von Antikörpern findet sich das Protein an den distalen und proximalen Enden des Zentriol 13 angereichert werden, während BLD10-GFP zeigt eine gleichmäßige Verteilung 1. Allerdings ist es auch wichtig, die Höhe der Expression eines bestimmten genetisch markierte Protein zu betrachten, da diese Proteinverteilung beeinflussen. Lokalisierung von Sas-4-GFP-und SAS-6-GFP exprimiert unter ihrer endogenen an den proximalen Enden der Centriol 1,16,35 Auf der anderen Seite beschränkt, Sas-4-GFP-und SAS-6-GFP exprimiert unter der starke Ubiquitin-Promotor sind entlang der gesamten Länge des Zentriol 12,14 lokalisiert. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Wirkung der genetischen Tag auf Proteinfunktion. Die Analyse, ob genetisch markierten Proteine ​​sind funktionell sein können testen durch die Einführung des transgenen Proteins in eine Mutante Hintergrund und prüft, ob die transgene Protein rettet die mutierten Phänotyp. Fixierung von Drosophila Hoden kann unter Verwendung einer Vielzahl von chemischen Fixiermittel werden. Hier beschreiben wir Fixierung sowohl mit Formaldehyd (Track B) und Methanol-Aceton-(Track C). Jedoch kann entweder Fixiermittel austauschbar verwendet werden und da verschiedene Fixiermittel chemisch stören nativen Antikörper-Epitope, muss die Auswahl des geeigneten Fixiermittel für Immun experimentell bestimmt werden. Die folgenden Fixiermittel und Inkubationsbedingungen werden üblicherweise verwendet: 3,7% Formaldehyd, 5 min bei Raumtemperatur; Methanol, 15 min bei -20 ° C, Aceton, 10 min bei -20 ° C Methanol, 15 min bei -20 ° C. gefolgt von Aceton, 30 sec bei 20 ° C, Ethanol, 20 min bei -20 ° C. Obwohl Fixation mit Aceton, Methanol und Ethanol nicht eine erweiterte Permeabilisierung Schritt für Immunfärbung Fixierung erfordern with Formaldehyd sollte von einem 1-stündigen Inkubation in PBST-B bei Raumtemperatur, um die Zellmembranen durchlässig zu machen und damit den Zugang zu intrazellulären Antikörper-Epitope folgen. Darüber hinaus sind bestimmte Fixative besser geeignet für bestimmte Antigene. Beispielsweise Formaldehyd funktioniert gut für die Fixierung von kleinen Proteinen, während Methanol und Aceton sind für die Fixierung von großen Molekülkomplexe 36 gut geeignet. Immunfärbung von Drosophila Hoden zuvor für die Beobachtung Chromatin-Strukturen und die Mikrotubuli-Zytoskeletts 29,37 beschrieben. Hier (Spur C) wurde das Verfahren für die Analyse von Strukturen zentrosomale genetisch markierte Proteine ​​enthält, optimiert. Wir liefern eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens, um Menschen, die Erfahrung mit Arbeiten in Drosophila Hoden führen. Dieses Verfahren umfaßt auch Modifikationen, die Erhaltung und die Morphologie der Hoden, wie unter Verwendung von s zu verbesserniliconized Deckgläser und positiv geladene Objektträger aus Glas.

Drosophila Hoden eine geeignete Organsystem, eine Vielzahl von Zell-und Entwicklungsprozesse zu studieren und wurden ausgiebig über die Jahre 1-9 bewertet. Handschrift konzentriert sich auf die Verwendung von Drosophila Hoden Zentrosom, eine konservierte zelluläre Organelle zu studieren. Wie in anderen Systemen, das Zentrosom des Drosophila-Hoden-Funktion in der Mitose, Meiose und ciliogenesis 10. Zentrosomen aus einem Paar als Centriole durch einen komplexen Proteinnetzwerk bezeichnet als pericentriolar Material (PCM) umgeben bekannt Mikrotubuli-basierte Strukturen. Die Centriol Paar einer älteren Mutter Centriol und einer jüngeren Tochter Centriol besteht. Wenn die Zelle zur Mitose fortschreitet, beide Centriolen zu trennen, zu vervielfältigen, zu erwerben und eine große Menge von PCM zu bilden schließlich zwei verschiedene Zentrosomen. Das Zentrosom, die die ursprüngliche Mutter Centriol wird als Mutter und dem Zentrosom bezeichnet zentrOsome mit der Original Tochter Centriol wird als Tochter Zentrosom bezeichnet. Drosophila Hoden sind ideal für die Untersuchung der molekularen Grundlagen von Zentrosomen Biologie durch Fluoreszenzmikroskopie für eine Vielzahl von Gründen. <ol><li> Die meisten der Drosophila-Proteine, die für die Biologie Zentrosom in den Hoden erforderlich sind, unter den Eukaryoten konserviert, was darauf hindeutet, dass Einblick relevant Zentrosom Biologie in Menschen und anderen Spezies können durch das Studium der Zentrosomen in Drosophila gewonnen werden Hoden 1,11-14. </li><li> Darstellende Mutante Analyse in Drosophila bietet einen erheblichen Vorteil, da, im Gegensatz zu vielen anderen Modellen, zentrosomale Mutationen in Drosophila sind nicht embryonalen tödlich, so dass für klassische genetische Analyse von Zentrosom-Funktion. Diese einzigartige Funktion von Drosophila ist aufgrund der Anwesenheit der mütterlichen Beitrag, der während der kritischen Phasen der embryonalen entwi weiterhin bestehtpment. 1,11-14. So kann man a) Studie Mutationen, die Zentrosom Bildung vollständig zu beseitigen und b) zu studieren, das Schicksal eines normalen Zentrosom, das im frühen Embryo durch mütterliche Beitrag in einer mutierten Zusammenhang wurde gebildet, nachdem die mütterlichen Beitrag erschöpft ist (Prinzip der Methode in 11) beschrieben. </li><li> Funktionelle Transgene mit genetisch kodierten Fluoreszenzmarkern, die die Zentrosomen zu beschriften sind. Viele dieser Linien verwenden eigenen Promotor des Proteins, die Transkription des Transgens, um starke Überexpression verhindern zu fahren. Dies ist besonders wichtig, da die Überexpression von Proteinen häufig zu Artefakten, die mit der Analyse der Zentrosomenfunktion 1,11 stören. </li><li> Das Zentrosom Centriol und sind einzigartig in ganz lange Drosophila Spermatogenese, so dass für eine schnelle und einfache Analyse des Zentrosom durch Bildgebung. </li><li> Aufeinanderfolgenden Schritten in Spermatogenese und Zentrosom biology sind chronologisch entlang der Hoden organisiert, beginnend an der Spitze mit den Hoden Zentrosomen der Spermien-Stammzellen und endet an der Unterseite der Hoden mit verminderter Zentrosom Größe und Aktivität in reifen Samenzellen (Abbildungen 1 und 2). Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung und Analyse von Zentrosom-Funktion während der verschiedenen Stadien der Entwicklung der Spermien. </li><li> Hoden werden leicht von männlichen Larven, Puppen und Erwachsene 27 seziert. </li><li> Während der Spermatogenese, das Zentrosom und seine Centriolen gehen durch mehrere kompositorische, strukturelle und funktionelle Staaten in der Mitose, Meiose und Bildung Cilium funktionieren. Während dieser Prozesse, die Zentrosom montiert, Dubletten, wandert, Anker auf bestimmte Teile der Zelle reift, dividieren, und schafft eine Wimper. Außerdem die Centriol der reifen Spermatiden führt zu einer centriolar Vorläufer namens der PCL ein. Auch in den reifen Spermatiden, das Zentrosom läuft einen Prozess cALLED Zentrosom Reduzierung wobei er verliert viele Komponenten des PCM und die Centriol (Abbildungen 1 und 2). So haben Studien in den Hoden erlauben es, mehrere Aspekte des Lebens wie Zentrosom Zentrosom Einlagerungen in den Stammzellen, Centriol Vervielfältigung, Centriol Stabilität, Centriol Dehnung, Centriol Trennung und Segregation, PCM Rekrutierung, ciliogenesis, PCL Bildung, Zentrosom Reduktion und Adresse astralen Mikrotubuli-Nukleation unter anderem. </li><li> Schließlich sind Studien Zentrosom Biologie von den anderen bekannten Eigenschaften von Drosophila, die es zu einem bevorzugten Modellorganismus für biologische Studien gemacht haben unterstützt. Dazu gehören eine kurze Generationszeit, einfache Genetik, sowie zufällige und gerichtete Mutagenese. </li></ol> Zusammen bilden die oben genannten Eigenschaften von Drosophila Hoden bietet ein Modell, wo das Zentrosom kann durch einfache, schnelle und detaillierte Bildgebung untersucht werden. Die beschriebenen Technikenin diesem Papier wurden angewendet, um viele Aspekte der Biologie einschließlich Zentrosom Centriol Bildung 11, 15 Centriol Vervielfältigung, PCM Einstellung 16, Zentrosom Regulierung 17 und 18 ciliogenesis zu untersuchen. Diese Techniken wurden auch angewendet, um das Zentrosom in anderen Bereichen der Biologie wie meiotischen Regelung 19 Spindelanordnung 20 und Zentrosom Aktivität in asymmetrischen Stammzellteilung 21 unter vielen anderen zu studieren. Imaging der Hoden in den Zentrosom beginnt mit Erhalt Fliegen, die genetisch-markierten Proteine ​​zu exprimieren zentrosomale und Isolierung der Hoden von männlichen Larven, Puppen oder Erwachsenen-Fliegen. Diese Fliegen sind von verschiedenen Forschungsgruppen 1,11,15,22-25. Die Larven Hoden enthalten alle Stadien der Spermatogenese vor der Meiose und sind nützlich bei der Analyse von Mutationen, die in der Puppe oder Erwachsener tödlich sind. Allerdings Spätpuppen oder junge adult Hoden sind die robustesten und enthalten alle Pre-und Post-Reifestadien der Spermatogenese, wodurch sie bevorzugt für die Analyse. Da die Anzahl der Spermien als der Fliegen Alter abnimmt, ist auch die Verwendung von adulten Hoden für die Untersuchung der Zentrosomen in Zusammenhang mit Alterung. 26 geeignet. Ein Verfahren zur Isolation von Hoden erwachsenen Fliegen ist bereits beschrieben worden 27. Imaging von Zentrosomen und deren Funktion in Drosophila Hoden kann über drei verwandten Titel, die hier (Abbildung 3) dargestellt werden, erreicht werden. Auswahl, welche Spur am besten geeignet ist, hängt von der Art der Frage der Prüfer Adressierung. Track A beinhaltet Bildgebung von Live-Hoden. Es ist die schnelle der drei Spuren kann jedoch nur angewendet, wenn Proben müssen nicht erhalten werden und wenn die Immunfärbung ist nicht erforderlich. In der Spur A werden die Hoden auf Objektträger (intakte, durchbohrt oder schneiden)und vorsichtig unter einem Deckglas gequetscht, um eine einzelne Schicht von leicht identifizierbaren Zellen zu bilden. Die Zellen werden dann unter Verwendung von sowohl Phasenkontrastmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Verwendung von Phasenkontrast ist besonders wichtig für die Analyse von Drosophila Hoden, weil sie Zell Informationen, die nicht mit anderen Formen von Durchlicht sichtbar ist und ermöglicht somit eine schnelle Identifizierung der verschiedenen Stadien der Samenentwicklung 28,29 zeigt. Allerdings Track A hat zwei Nachteile. Zuerst wird die morphologische Integrität der Zellen häufig beeinträchtigt, wenn die Hoden brochen werden. Zweitens, nicht fixierten Zellen innerhalb der Probe bewegen manchmal, was die Abbildung von mehreren konfokalen Schichten innerhalb einer bestimmten Region schwierig. Um die Analyse von spezifischen Zelltypen zu fördern, kann durchstochen oder Hoden, um den Weg des Hodens Brüchen, so dass unter dem Deck Quetschen minimal beeinflußt die Morphologie der Zelltyp von Interesse direkt geschnitten werden. Track B umfasst die chemische Fixierung der Hoden. Diese Spur ist ein Zwischenzeitaufwand für die Probenvorbereitung und hat den Vorteil, dass Festkörper können für eine spätere Analyse gespeichert werden. Darüber hinaus dient Fixierung Zellstrukturen steifer zu machen, minimiert die Bewegung der Probe während der Bildgebung. Allerdings wird Phasenkontrastmikroskopie viel weniger aussage nach chemischer Fixierung, so dass einige Stadien der Entwicklung der Spermien schwer zu identifizieren. Spur C ist der zeitintensiv, hat aber den zusätzlichen Vorteil, dass die Zellstrukturen fixiert und immunhistochemisch, so dass für die Visualisierung von Proteinen, die nicht mit den entsprechenden genetischen Tags vorhanden sind. Es gibt viele Antikörper sowohl im Handel und von verschiedenen Forschungsgruppen für Immunfärbung Zentrosomen und Zentrosom bezogenen Strukturen in Drosophila Hoden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/ Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments/Description</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1306</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positively Charged Slides</td>
 <td>AZER Scientific</td>
 <td>EMS200A+</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feather Microscalpel</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72045-30</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37% Formaldehyde or Paraformaldehyde</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP531-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
 <td>Boston Bioproducts</td>
 <td>BM-220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18 mm coverslips number 1.5</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48366 205</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nail Polish</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72180</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A412-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A949-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton-X100</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T9284-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Jackson ImmunoResearch</td>
 <td>001-000-162</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse A</td>
 <td>5 prime</td>
 <td>2900142</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter paper</td>
 <td>Whatman</td>
 <td>1001-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass engraver</td>
 <td>Dremel</td>
 <td>290-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCS SP5 confocal microscope</td>
 <td>Leica </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounting Media</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>17985-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immuno Stain Moisture Chamber, Black</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62010-37</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70315</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

imaging centrosomes in fly testes

Zentrosomen konserviert Mikrotubuli-basierte Organellen, deren Struktur und Funktion Änderung drastisch während des Zellzyklus und der Zelldifferenzierung. Zentrosomen sind unerlässlich, um die Zellteilung während der Mitose Achse bestimmen und Zilien während der Inter Keime. Die Identität der Proteine, die diese dynamische Veränderungen vermitteln bleibt nur teilweise bekannt ist, und die Funktion von vielen der Proteine, die in diesen Prozessen in Verbindung gebracht wurden, ist immer noch rudimentär. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass Drosophila Spermatogenese ist ein leistungsstarkes System, um neue Proteine ​​entscheidend für Zentrosomenfunktion und Bildung sowie zu identifizieren, um Einblick in die besondere Funktion der bekanntesten Spieler im Zentrosom bezogenen Prozesse zu gewinnen. Drosophila ist ein etablierter genetischen Modellorganismus in dem Mutanten in zentrosomale-Gene lassen sich leicht erhalten und analysiert werden. Die jüngsten Fortschritte in der Empfindlichkeit und Auflösung der Lichtmikroskopie und derEntwicklung von robusten genetisch markiert zentrosomale Marker die Möglichkeit, Drosophila Hoden als eine einfache und zugängliche Modellsystem, um zu studieren Zentrosomen verwenden verwandelt. Dieses Papier beschreibt die Verwendung von genetisch markierten zentrosomale Marker zu genetischen Bildschirme für neue zentrosomale Mutanten durchzuführen und Einblicke in die spezifische Funktion der neu identifizierten Gene zu gewinnen.

Zentrosomen laufen mehrere morphologische und funktionelle Transformationen im Laufe der Spermatogenese. Diese Eigenschaft macht die Spermatogenese Hoden ein nützliches System, um verschiedene Aspekte der Biologie Zentrosom studieren. Ein solches Verfahren ist leicht beobachtet Zentrosom Dehnung. In Spermatogonien, die centriolar Marker Ana1-GFP markiert die 0,6 um lange Centriol (Abbildung 4a). Dies verlängert Centriol während der Spermatogenese und eine Länge von 2,5 um fast reife Spermatiden erreicht. Seit Centriolen in Drosophila Spermien sind einzigartig lang ist, können Bildgebung verwendet, um quantitative Aussagen über Zentrosom Dehnung (Abbildung 4b) zu machen. Analyse Zentriol Länge kann auch in einem mutierten Hintergrund ausgeführt werden und verschiedene Mutanten identifiziert, die Zentriol Wachstum (Fig. 5) zu ändern. Beispiele sind immer früh (Aly) und Kanonenkugel (können), dass Mutationen arrest Spermatogenese vor Beginn der Meiose 30 aber nicht Centriol Dehnung blockieren. In diesen Mutanten Centriolen der reifen Samenzelle wachsen, um über ~ 2,4 um im Vergleich zu Centriolen von Kontrollzellen, die ein Maximum von 1,8 um zu erreichen. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"/> Fig. 1 ist. Spermatogenese und Zentrosom Biologie. A) Entwicklung von Stammzellen und Spermatogonien. Alle Samenzellen stammen aus Stammzellen an der apikalen Spitze der Hoden gefunden. Jede Stammzelle teilt sich asymmetrisch, um eine Stammzelle, die die Mutter Zentrosom und eine Vorläufer Spermatogonie, die die Tochter erbt erbt Zentrosom 31 bilden. Als Spermatogonien Form, werden sie von zwei Zyste Zellen, die die Spermatozyten und Spermatiden während der Spermatogenese umgeben weiterhin umgeben. Spermatogonien Kluft 4 mal 16 Spermatogonien, die jeweils zwei Centriolen. B enthalten) Entwicklung der Spermatozyten und Meiose zu produzieren. Während Spermatozyten Entwicklung, Centriolen duplizieren noch einmal auf vier Centriolen in zwei Paare pro Zelle und 64 Centriolen pro Zyste organisiert generieren. Frühe während Spermatozyten Entwicklung, bewegt sich jede Centriol an der Plasmamembran, Docks, um es, und verlängert, um eine Struktur, die eine primäre Zilien 18,32-34 ähnelt bilden. In reifen Spermatozyten, Centriol Länge erreicht ~ 1,8 um. Die Zentrosomen spielen eine wesentliche Rolle in der Meiose. Während der Meiose I, die Centriol Paare, die immer noch an der Plasmamembran Schritt in Richtung der Mitte der Zelle befestigt sind und erstellen Einstülpungen der Zellmembran an ihren distalen Spitze. Das PCM um die Centriolen wächst, Keim für Astral Mikrotubuli und kolokalisiert mit der Spindelstange. Beim Übergang in Meiose II, trennt sich das Paar Zentriol so dass nur eine einzige Zentriol ist Präsentationt bei jeder Spindelstange. C) Spermiogenese. Am Ende der Meiose II hat der Frühe Runde Spermatide eine einzige Centriol zu der eingestülpte Plasmamembran angebracht. Ein großer runder mitochondrialen Derivat wird in der Nähe des Zellkerns und später beginnt, entlang der wachsenden Axonem Später in runden Spermatiden zu verlängern. Während der Spermatogenese, die Axonem Formen und verlängert in der Zytoplasma. Darüber hinaus erscheint eine neue centriolar Struktur wie die PCL (proximale Centriole Like) bekannt, in der Nähe des bereits existierenden Centriol ein. Am Ende der Spermatogenese, Zellen, die eine gemeinsame Zyste voneinander trennen, um vollständig ausgereift beweglichen Spermien zu werden. Die Diagramme der Spermatozyten Entwicklung (B) und Spermiogenese (C) zeigen nur eine Zelle der 16 Spermatozyten und Spermatiden 64, jeweils pro Zyste und nicht die Zyste Zellen darzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier zur Ansicht groß</a>r Figur. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="Figur 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"/> 2. Die Drosophila-Testes. Die Lasche der Phasenkontrast-und GFP-Fluoreszenz-Aufnahme eines ganzen-mount Hoden die pan-centriolar Marker Ana-1-GFP-exprimierenden. Distinct Bereich entsprechend Platten 1-3 von Abbildung 1 sind durch eine gestrichelte rote Linie getrennt) Stammzellen und Spermatogonien, B) Spermatozyten und Meiose, C) Spermiogenese. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"/> 3. Gegen Tracks Imaging Zentrosomen in Drosophila Hoden. <p class="jove_content" fo: Keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4.jpg" alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4highres.jpg"/> Abbildung 4. Zentrosom Dehnung während der Spermatogenese. A) Jede Stufe zeigt ein Phasenkontrastbild (links), Fluoreszenz-Bild (Mitte) und vergrößertes Bild der Zentrosom (rechts). Das Phasenkontrastbild zeigt die besondere Zellstadium auf der Grundlage der Position und der Morphologie der Zelle, Zellkern Nukleolus und Mitochondrien. Das Fluoreszenzbild zeigt DNA mit DAPI (blau) gefärbt. Das Zentrosom Bild zeigt von Zentrosomen Asterless-GFP (Asl, Top-Bilder) und Ana1-GFP (Ana1, Bild unten) gekennzeichnet. Ein weißer Kreis unterstreicht die Zellmembran in beiden Phasenkontrast-und Fluoreszenzbilder. Die gestrichelten Kreise weiße und die graue Kreis im Fluoreszenzbild zu markieren die Position des Kerns und Nukleolus sind. Gelber Pfeil auf den Y-Chromosomeinige Schleifen. Red gestrichelten Kreise markieren die Mitochondrien. Stufen 1-6 bezieht sich auf 29 und die Stufen 13 bis 17 bezieht sich auf Beschreibung der Zellstadien in 32. Stufe 1: Primäre Spermatozyten. Als kleine Zelle eine Spitze des Hoden identifiziert. Stufe 2a: Polar Spermatozyten. Von der Gegenwart eines Mitochondrien Kappe auf einer Seite des Kerns bezeichnet. Stufe 3: Apolare Spermatozyten. Durch ihre relativ größeren Größe als die identifizierten primären Spermatozyten und das Fehlen einer Kappe Mitochondrien. Stufe 4: Primäre Spermatozyten. Alle 3 Y-Chromosom Schlaufen: durch das Auftreten von alle identifiziert. Stufe 5: Ältere Primäre Spermatozyten. Größte Spermatozyten in Spermatogenese produziert, von einem weiteren Anstieg der Kerngröße identifiziert. Stage 6: Premeiotic Primäre Spermatozyten. Y-Chromosom Schleifen zerfallen und der Kern verschwindet. Stufe 13: Zwiebel Bühne Spermatide. Runde Zelle gleich großen Zellkern und Mitochondrien enthalten. Stufe 17: Späte Spermatide. Als länglicher Spermatiden, die Teil einer bundl bleibt identifizierte von 64 Spermatiden mit Kernen gefunden in der Nähe der Basis der Hoden. sind Kerne etwas breiter als reife Spermatiden in der Samenblase gefunden. Maßstabsbalken 10 &amp;mgr; m und 1 &amp;mgr; m. B) Grafik zeigt Mittelwert und Standardabweichung für jede Stufe wie Asterless-GFP-(blau) und Ana1-GFP (grün) gemessen. In Phase 6, Asterless-GFP-(blau) und Ana1-GFP (grün) Mittelwerte und Standardabweichungen überlappen und nur Asterless-GFP (blau) ist offensichtlich. Schon ab Stufe 13, hat Asterless-GFP nicht die ganze Centriol dekorieren und Messungen wurden nicht bestimmt (ND). <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"/> 5. Ungewöhnlich lange Centriolen in Stage 6 Spermatozyten von aly und kann Mutanten. AC) Lichtmikroskopische Aufnahme von ganzen Hoden und Leuchtstoffplatte der Vertreter Zentrosom lavon Ana1-GFP Beled. Beachten Sie die abnorme Form der Hoden in aly und kann Mutanten, die aus einem Mangel an Spermatiden als Folge der Meiosehemmung. D führt) Grafik zeigt Mittelwert, Standardabweichung und Datenverteilung Centriol Länge in Wildtyp-, aly und kann . Probennummer für jeden Datenpunkt ist in Klammern. Maßstabsbalken, 1 um.

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Imaging Centrosomes in Fly Testes

Imaging von zentrosomale Proteine ​​während der Drosophila Spermatogenese ist eine leistungsfähige Methode, um neue Proteine ​​von entscheidender Bedeutung für die Biologie Zentrosom zu identifizieren sowie die besondere Funktion der bekannten Akteure in diesem Prozess aufzuklären.

Imaging Zentrosomen in Fly Hoden

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

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15.8K Aufrufe.  University of Toledo.  Imaging von zentrosomale Proteine ​​während der Drosophila Spermatogenese ist eine leistungsfähige Methode, um neue Proteine ​​von entscheidender Bedeutung für die Biologie Zentrosom zu identifizieren sowie die besondere Funktion der bekannten Akteure in diesem Prozess aufzuklären. 

Serie: Imaging Centrosomes in Fly Testes

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Forschung

Biologie

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm development. However, immunolabeling of the whole Drosophila testis is often associated with significant non-uniformity of staining due to antibody penetration. Squashed preparations only partially overcome the problem since it decreases the 3D quality of the analyses. Herein, we describe a whole-mount protocol using NP40 and heptane during fixation together with immunolabeling in liquid media. It preserves the volume suitable for confocal microscopy together with reproducible and reliable labeling. We show different examples of 3D reconstitution of spermatocyte nuclei from confocal sections. The intra- and inter-testes reproducibility allows 3D quantification and comparison of fluorescence between single cells from different genotypes. We used different components of the intranuclear MINT structure (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) as well as two components associated with the nuclear pore complex to illustrate this protocol and its applications on the largest cells of the testis, the S4-S5 spermatocytes.

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

We present here an improved protocol for the whole-mount preparation and immunostaining of Drosophila testes, suitable for confocal microscopy and also allowing reproducible and reliable labeling. We illustrate this protocol by 3D representation and quantification of colocalization experiments on the large S4-S5 spermatocytes.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...